免疫组化

免疫组化 石蜡切片免疫组化染色实验步骤: 1(石蜡切片脱蜡至水: (石蜡切片染色前应置65?烤片40min以上)。 (1)二甲苯?、II,各10 分钟。 (2)梯度酒精: 100%，2 次，各2 分钟; 95%，2 次，各1 分钟; 85%，1 分钟; 75%，1 分钟。 (3)水洗:3 分钟，2 次(可置于摇床)。 2(抗原修复: 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附:抗原修复液(10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制 (1)储备液的配制: A 液:枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml B 液:枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml (2)工作液的配制:A 液18ml + B 液82ml + 蒸馏水900ml 抗原修复的方法: (1)加热修复处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM，PH6.0),淹没切 片,盖上锅盖，锅内煮沸后,保温40 分钟以上，取出自然冷却至 室温。 1 3. 抗原修复的注意事项: (1)组织不能干。 (2)选择抗原修复方法要因抗体而异。 (3)该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。 4. 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶: 3%H2O2，室温10 分钟(避光)。 5(水洗: 5 分钟，2 -3次(可置于摇床)。 6(正常血清封闭: 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的 水分(保持组织呈湿润状态),滴加正常山羊或兔血清(与第二抗 体同源动物血清)处理，37?，15 分钟。 附:正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)按1:20 比例,用PBS 配制,每张切片需要量按50ul+5ul (10%抛洒量)计算。 7(滴加第一抗体: 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37? 2 小时(也 可置于4?冰箱过夜)。 8( PBS: 2 分钟，3次(可置于摇床)。 9(滴加二抗(辣根过氧化物酶标记)， 37?，40 分钟。 10( PBS: 2 分钟，3 次(可置于摇床)。 11( DAB显色试剂盒显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止反应)。 注:抗体显色反应过程需保持切片湿润。 2 12(自来水(细水)充分冲洗。 13(苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。(时间可调节，最好在镜下观察，核染上就好不要过染)。 14(自来水冲洗返蓝，5-15 分钟。(可调节) 15(梯度酒精脱水: 75%,1 分钟; 85%，1 分钟; 95%，2 次，各1 分钟; 100%， 2 次，各2 分钟。 16(二甲苯透明: I，II(二甲苯)各5 分钟 17(封片: 加拿大树胶(或中性树胶)封片。 备注:若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。 若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的 水份，直接将水溶性封片剂(例如明胶甘油)封片。 3 附录 免疫组织化学常用缓冲液的配制 ? 0.2mol/L磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer, PB) 甲液: 0.2mol/L NaHPO称取NaHPO?12HO 71.632g(或:24242 NaHPO ?7HO 53.6g或 NaHPO ?2HO 35.6g),加双蒸水至1000ml242242 溶解。 乙液: 0.2mol/L NaHPO称取NaHPO?12HO 31.2g (或:24242 NaHPO?2HO 27.6g), 加双蒸水至1000ml溶解。 242 根据需要按不同比例混合两液 pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 0.2mol/NaHPO/ ml 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 24 0.2mol/NaHPO/ ml 92.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.3 24 ? 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水 (phosphate buffer, PBS) 0.2mol/L PB 50ml, NaCl 8.5-9g, 加水至1000ml。 ? 0.1mol/L 柠檬酸缓冲液 甲液: 柠檬酸(CHO.HO)21.01g, 加双蒸水至1000ml溶解。 6872 乙液: 柠檬酸三钠 (NaCHO?2HO) 29.4g, 加水至1000ml。 36572 根据需要按不同比例混合两液 pH 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.8 6.0 6.2 0.1mol/L CHO?HO/ml 82.0 77.5 73.0 68.5 63.5 59.9 54.0 49.5 44.5 40.0 35.0 30.0 25.5 16.0 11.5 8.5 6872 0.1mol/L NaCHO?2HO/ml 18.0 22.5 27.0 31.5 36.5 41 46.0 50.5 55.5 60.0 65.0 70.0 74.5 84.0 88.5 91.5 36572 4 5 6 7 8