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人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系

2017-09-26 9页 doc 26KB 41阅读

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人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系 人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗 体的关系 一 J_ “ .上海第二医科大学 人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系 上海第二医科大学附属瑞金医院上海市内分泌研究所(200025) 王铸钢陈春荣V唐金凤李凤英陈家伦 /摘要用胆酸钠增溶,硫酸铵盐析,差速离心及免疫亲和层析法从甲状腺细胞膜成分中提纯hTPO.纯 f[:hTPO的比牛物活性提高了438.7倍,其RZ值为025SDS—PAGE于105KD和107KD处呈现两条条带.以 相Iodogen去标记...
人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系
人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系 人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗 体的关系 一 J_ “ .上海第二医科大学 人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系 上海第二医科大学附属瑞金医院上海市内分泌研究所(200025) 王铸钢陈春荣V唐金凤李凤英陈家伦 /摘要用胆酸钠增溶,硫酸铵盐析,差速离心及免疫亲和层析法从甲状腺细胞膜成分中提纯hTPO.纯 f[:hTPO的比牛物活性提高了438.7倍,其RZ值为025SDS—PAGE于105KD和107KD处呈现两条条带.以 相Iodogen去标记hTP0,建立放免法测定29侧AITD患者McAb阳性血清的TPOAb结合率为 163?63”而ll例正常人McAb阳性血清的结合率为34?4.7,McAb与TPOAb结合率的测定值呈 着枉】关(r=0.73P<0.001);稀释试验提示McAb可与hTPD结合且存在剂量依赖性.因此AITD患者的 McAb所针对的微粒体抗原即为hTPO.而McAb即为TPOAb. 关键词甲状腙过氧化物酶:甲状睬微粒体抗体;自身免疫性甲状腺疾病:甲状腺过氧化物酶抗体 中图号R335?2,P;{ 人I}j状腺过氧化物酶(humanthyriodper- oxidase.hTPO)不仅是甲状腺激素生物合成所必 后的关键酶,而且作为甲状腺微粒抗原的主要成份 n身免疫性甲状腺疾病的发病机制中具有重要作 J『】观明确,hTPO是一种以血红素为辅基的膜结 精蛋n.分子量约为100KD,主要分布在甲状腺细 胞顶缘和内质网由于其组织含量低,用普通的 化疗法纯化仅步骤繁杂,费时,而且回收率低 研究采用特异性单克隆抗体免疫亲和层析纯化 hTPO使纯化步骤大为简化,而且提高了酶回收 半.脱报道如下. 材料与方法 hTPO的初步纯化.收集甲状腺手术标本, j0,4.C剔除包膜,脂肪等并将甲状腺组织剪成碎 块项冷的10mmoULrs,Hcl,PH7.8,0.1mmol/ IKI缓冲液中先后用高速组织捣碎机和玻璃匀浆 器制成组织匀浆经纱布过滤后以500g,0,4.C离 t:q0min.I清液250o0g离~70min,沉淀物以预冷 的20mmol/LTris/Hcl,pH7.80.1mmol/LKI. 05胆酸钠溶液悬浮.冷水浴中磁力搅拌过夜经 i00000g离~,90min.上清液用60饱和硫酸铵溶液 盐析25000g离~,70min沉淀物用20mmol/ LTris/?HclpH7.80.1mmol/LKZ缓冲液悬浮.再 经l0000离心帅mjn.上清液TO~4”C在l(~nol/L 1_永fl然科学金资助项Uf39200055) Tris/Hc1.pH7801mmol/LKI缓冲液中透析至无 NH浓缩后分装,--80.C保存. hTPO的免疫亲和层析”hTPO单克隆抗 体(38E.IgG.,由日本Ohtaki教授惠赠)20rag与溴化 氰活化的Sepharose4B16ml偶联并制成免疫亲和 层析柱(08cm×18era)用20mmol/LTris/Hcl,pH 7.50.1mmol/LKCl01mmol/LKI.0.2胆酸钠 缓冲液(B)平衡后,将粗制hTPO分次上样,并用B 以8ml/h的流速洗脱至A280<0.02换用pH9含 lmol/LKC1,0.1mmol/LKI,0.5胆酸钠(B) 50mmol/L硼酸缓冲液继续洗脱至A280<0.02后, 用含有0.imoI/LNH{OH,0.5胆酸钠,lmmol/. LKcl?0.1mmol/LKI的溶液(B,)以30ml/h的流速 洗脱收集洗脱蜂,经透析浓缩后分装一80C保存. hTPO的碘化标记hTPO10ng以固相Iodo— gen法标记,室温反应2min,反应液经SephacrylS 300柱层析纯化.标记物分装后-80.C保存.比放 射性为736—12.36×10kBq/pg. 蛋白质和酶活性的测定蛋白质浓度用考马斯 亮蓝G一250和紫外光吸收法测定.hTPO酶活性用 愈创木酚(Guaiaco1)法测定.取待测标本10--50 ul用PBS*b至100ul,~[140mmol/L愈创木酚2ml 混匀后,加66mmol/LHO210ul,室温反应 lmin,A一1定义为1个酶活性单位(Gu). 其它甲状腺微粒体抗体(McAb)用放免法测 定.McAb阳性血清来自本单位临床测试标本统计 学处理采用直线相关性分析. 上海第?医科大学 ActaUniversitatJsMedJcina]~sSecondaeShanghai 结果 hTP0的免疫亲和层析 ll1洗脱曲线,IJ见B.洗脱峰中有hTPO活性,但 j商慢远小段篮r{峰.说明此峰以杂蛋白为主.系上 样jt越过析柱口发附容量所致.B峰中有?低平的 hTP0峰,但仍杂蛋白为主,换用B后出现hTP0 高峰.蚩门峰则明显降低.收集B峰.测A4l3/ A280(RZ值)为0.25. hTPO纯化过程中蛋白质和酶活性的监测结果 嵌I{JJ.500g离心至免疫亲和层析,hTPO被纯化了 438.7f,其中以免疫亲和层析效率最高(附表).SDS PAGE示纯化产物在105KD和107KD处出现 条1{条带. 附表纯忧过程中的蛋白质和酶活性监测 McAb阳性血清对II—hTPO的免疫沉淀作用 清稀释5倍后取50pl与5I—hTPO0.1lII】(?. 000,4000O/cpm)于37oc温育60min.再加抗XIgG 抗体继续温育60min后离心测沉淀物放射性.结果 丧II』】McAb阳性血清(29例)与”I—hTPO的结合率 为l6.3?6.3%而MCAb阴性血清(11例)为 3.4?4.7%.两组fnj蔗异显着(P<O.001)McAb结合 半I—hTPO结合率之间有显着性相关一 4O,r=0.73.P<O.oo1). 血清稀释度对I1一hTPO结合率的影响 血清经不同程度稀释与I—hTPO反应,血清 IgG以SPA火活菌体悬液(10%50p1)吸附.离心后 测沉淀物放射性.结果表明McAb阳性血清与I— hTPO的结合率随血清稀释度的升高而下降.而 McAb阴?性和正常人混合血清的结合率远较McAb 血清低FL受血清稀释度的影响. 讨论 hTPO的纯化?般都要经过细胞膜结合蛋白的 增溶处理.其主要方法有二:单独应用去垢剂或加 用胰蛋白酶.后者将hTPO水解成多肽片段,所纯 化的hTPO主要为细胞外亚区片段.较天然完整的 hTPO约少90个氨基酸.本文采用未经胰蛋白酶消 化的膜增溶产物经单克隆抗体亲和层析纯化天然完 整的hTPO,不仅简便,快速,而且酶活性回收率高. 从135g甲状腺组织中经两次亲和层析最终获得酶蛋 白152rag,酶比生物活性为66.8GU/mg,虽较文献 报道低….但RZ比值0,25与文献报道相近:.印6一 实所纯化的】1TP0收出现两条蛋白质条带.分 子量分别为105KD和1.与文献报遭相同. 用免疫亲和纯化的hTPO作为标记抗原,发现 McAb阳性血清对其有免疫沉淀作用,”I—hTPO 结合率与McAb结合率高度相关.用SPA菌体试剂 也证实McAb阳性血清中存在与I—hTPO结合的 IgG~PhTPO抗体(TPOAb).Czarnocka等进一步 证实hTPO单克隆抗体与”I—hTPO的结合可被 McAb阳性血清或纯化的lgG呈剂量依赖性抑制,反 之亦然.以上结果证明AITD所涉及的甲状腺微 粒体抗原和McAb实际上分别就是hTPO和TPO. Ab.显然,用高度纯化的hTPO作为标记抗原检澳I TPOAb能进一步排除McAb测定中其它甲状腺自 身抗原和自身抗体的干扰,使测定的特异性,灵敏度 进一步提高…这对AITD发病机制的研究及其临床 诊断和治疗有重要意义. 参考文献 1.Me|aehianSM.eta1.Themo[eeu|arbiologyofthyroid peroxidase:cloning.expressionandroleasautoantigen inautoimmunethyroiddisease.EndocrRev.1992; 13:192 2.OhtakiS.eta1.Reactionsofpurifiedhogthyroid peroxidasewithHzO,ttyrosine,andmethylmercaptoi- midazole(goitrogen)incomparisonwithbovinelacto- peroxidaseJBiolChem,1982;257:761 3PortmannLeta1.Anti—thyroidperoxidaseantibody inpatientswithautoimmunethyroiddisease:possible identitywithanti—microsomalantibody.JClinEndo- - crinolMetab.1985;61:i001 4.OhtakiS.etalCharacterizationofhumanthyroid 铸钢等人【f]状腺过氧化酶的纯化发与微粒体抗体的关系 1990;393:333 7CzarnockaB,eta1.Purificationofthehumanthyroid peroxidaseandltsidentificationasthemicrosomaI antigeninvolvedinautoimmunethyroiddiseases FEBSLett,1985;190:147 8BeeverK,etalHighlysensitiveassaysofautoanti— bodiestothyroglobulinandtothyroidperoxidase.Clin Chem,1989;35:1949 (199542—27收稿) r77吖 .NA含量分析在恶性胸腔积液诊断中的应用 J:海第一医科大学附属瑞金医院肺科(200025)时国朝邓伟吾黄绍光 生物物理教研室(20o025)f菊栗一 摘要应用流式细胞光度术检测38例良,恶性胸腔积液标本.并进行胸 液细胞学,胸液癌胚抗原值检 删.站址流式细胞DNA含量分析对恶性胸腔积液的诊断敏感性为 810:若结合胸液细胞学胸液癌胚 抗蛆f检测.则对恶性胸腔积液诊断的敏感性可达10o%. 关键词胸腔积液:流式细胞光度术:脱氧核塘核酸 中国号R5613e}R7.6 lj丽恶性胸腔积液的诊断主要依赖于胸液细胞 „榆.近年来开展r胸液癌胚抗原(carcinoemb. t~nicantigen,CEA)~J定.但仍有部分恶性胸腔 口{液病例漏珍和误诊.大量文献证明,细胞 【)NA芹常町作为恶性肿瘤细胞的一个标 ;本实验试罔应用流式细胞光度术(flowcyto. metry,FCM)~1定胸液细胞DNA含量,探讨其对恶 H日;【!J舱秘液的诊断价值并与胸液细胞学,胸液 CEA似检测进对比. 材料与方法 根掘组织病理检查结果将病例分成二组,其中 - rk胸腔积液组21例.良性胸腔积液组17倒. 试剂和仪器l_RNA酶:上海华美生物程公 ?i川IlI.用pH7.4Tris缓冲液配制.浓度12.碘化 ?彤呼懈季 丙啶(propidiumiodide.PI)荧光染料:美国Sigma 公司出品,PBS配制,浓度50#g/ml3.FACScan流 式细胞仪:美国BeetonDickinson公司出品. 实验方法胸液标本经胸腔穿刺获得,胸液细 胞学检查以HE染色,胸液CEA值以放免法测定.其 余胸液标本肝素抗凝后留作细胞DNA含量测定. l_胸液细胞DNA荧光染色胸液以PBS离心 洗涤.洗涤后的细胞可以70的酒精固定,一20C保 存.DNA荧光染色前,以PBS将标本中的酒精离心 洗涤.调整细胞浓度至2,3×10/ml,取细胞悬液0. 4ml,加入少量新鲜鸡血红细胞作为DNA含量分析 的内.加入1RNA酶0.2anl,置于3J7.C10min,然 后加入P10.4ml置于4.C20min.以4号针头将细胞 悬液强力吹打3次,350日尼龙滤网过滤后上机. 2.胸液细胞的DNA含量测定全部样品均采 用FACSean流式细胞仪测定.以渡长488nm输出功 ,.一, 一晰 ,,三一
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