人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系
人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗
体的关系
一
J_
“
.上海第二医科大学
人甲状腺过氧化物酶的纯化及与微粒体抗体的关系
上海第二医科大学附属瑞金医院上海市内分泌研究所(200025)
王铸钢陈春荣V唐金凤李凤英陈家伦
/摘要用胆酸钠增溶,硫酸铵盐析,差速离心及免疫亲和层析法从甲状腺细胞膜成分中提纯hTPO.纯
f[:hTPO的比牛物活性提高了438.7倍,其RZ值为025SDS—PAGE于105KD和107KD处呈现两条条带.以
相Iodogen去标记hTP0,建立放免法测定29侧AITD患者McAb阳性血清的TPOAb结合率为
163?63”而ll例正常人McAb阳性血清的结合率为34?4.7,McAb与TPOAb结合率的测定值呈
着枉】关(r=0.73P<0.001);稀释试验提示McAb可与hTPD结合且存在剂量依赖性.因此AITD患者的
McAb所针对的微粒体抗原即为hTPO.而McAb即为TPOAb.
关键词甲状腙过氧化物酶:甲状睬微粒体抗体;自身免疫性甲状腺疾病:甲状腺过氧化物酶抗体
中图号R335?2,P;{
人I}j状腺过氧化物酶(humanthyriodper-
oxidase.hTPO)不仅是甲状腺激素生物合成所必
后的关键酶,而且作为甲状腺微粒抗原的主要成份
n身免疫性甲状腺疾病的发病机制中具有重要作
J『】观明确,hTPO是一种以血红素为辅基的膜结
精蛋n.分子量约为100KD,主要分布在甲状腺细
胞顶缘和内质网由于其组织含量低,用普通的
化疗法纯化仅步骤繁杂,费时,而且回收率低
研究采用特异性单克隆抗体免疫亲和层析纯化
hTPO使纯化步骤大为简化,而且提高了酶回收
半.脱报道如下.
材料与方法
hTPO的初步纯化.收集甲状腺手术标本,
j0,4.C剔除包膜,脂肪等并将甲状腺组织剪成碎
块项冷的10mmoULrs,Hcl,PH7.8,0.1mmol/
IKI缓冲液中先后用高速组织捣碎机和玻璃匀浆
器制成组织匀浆经纱布过滤后以500g,0,4.C离
t:q0min.I清液250o0g离~70min,沉淀物以预冷
的20mmol/LTris/Hcl,pH7.80.1mmol/LKI.
05胆酸钠溶液悬浮.冷水浴中磁力搅拌过夜经
i00000g离~,90min.上清液用60饱和硫酸铵溶液
盐析25000g离~,70min沉淀物用20mmol/
LTris/?HclpH7.80.1mmol/LKZ缓冲液悬浮.再
经l0000离心帅mjn.上清液TO~4”C在l(~nol/L
1_永fl然科学金资助项Uf39200055)
Tris/Hc1.pH7801mmol/LKI缓冲液中透析至无
NH浓缩后分装,--80.C保存.
hTPO的免疫亲和层析”hTPO单克隆抗
体(38E.IgG.,由日本Ohtaki教授惠赠)20rag与溴化
氰活化的Sepharose4B16ml偶联并制成免疫亲和
层析柱(08cm×18era)用20mmol/LTris/Hcl,pH
7.50.1mmol/LKCl01mmol/LKI.0.2胆酸钠
缓冲液(B)平衡后,将粗制hTPO分次上样,并用B
以8ml/h的流速洗脱至A280<0.02换用pH9含
lmol/LKC1,0.1mmol/LKI,0.5胆酸钠(B)
50mmol/L硼酸缓冲液继续洗脱至A280<0.02后,
用含有0.imoI/LNH{OH,0.5胆酸钠,lmmol/.
LKcl?0.1mmol/LKI的溶液(B,)以30ml/h的流速
洗脱收集洗脱蜂,经透析浓缩后分装一80C保存.
hTPO的碘化标记hTPO10ng以固相Iodo—
gen法标记,室温反应2min,反应液经SephacrylS
300柱层析纯化.标记物分装后-80.C保存.比放
射性为736—12.36×10kBq/pg.
蛋白质和酶活性的测定蛋白质浓度用考马斯
亮蓝G一250和紫外光吸收法测定.hTPO酶活性用
愈创木酚(Guaiaco1)法测定.取待测标本10--50
ul用PBS*b至100ul,~[140mmol/L愈创木酚2ml
混匀后,加66mmol/LHO210ul,室温反应
lmin,A一1定义为1个酶活性单位(Gu).
其它甲状腺微粒体抗体(McAb)用放免法测
定.McAb阳性血清来自本单位临床测试标本统计
学处理采用直线相关性分析.
上海第?医科大学
ActaUniversitatJsMedJcina]~sSecondaeShanghai
结果
hTP0的免疫亲和层析
ll1洗脱曲线,IJ见B.洗脱峰中有hTPO活性,但
j商慢远小段篮r{峰.说明此峰以杂蛋白为主.系上
样jt越过析柱口发附容量所致.B峰中有?低平的
hTP0峰,但仍杂蛋白为主,换用B后出现hTP0
高峰.蚩门峰则明显降低.收集B峰.测A4l3/
A280(RZ值)为0.25.
hTPO纯化过程中蛋白质和酶活性的监测结果
嵌I{JJ.500g离心至免疫亲和层析,hTPO被纯化了
438.7f,其中以免疫亲和层析效率最高(附表).SDS
PAGE示纯化产物在105KD和107KD处出现
条1{条带.
附表纯忧过程中的蛋白质和酶活性监测
McAb阳性血清对II—hTPO的免疫沉淀作用
清稀释5倍后取50pl与5I—hTPO0.1lII】(?.
000,4000O/cpm)于37oc温育60min.再加抗XIgG
抗体继续温育60min后离心测沉淀物放射性.结果
丧II』】McAb阳性血清(29例)与”I—hTPO的结合率
为l6.3?6.3%而MCAb阴性血清(11例)为
3.4?4.7%.两组fnj蔗异显着(P<O.001)McAb结合
半I—hTPO结合率之间有显着性相关一
4O,r=0.73.P<O.oo1).
血清稀释度对I1一hTPO结合率的影响
血清经不同程度稀释与I—hTPO反应,血清
IgG以SPA火活菌体悬液(10%50p1)吸附.离心后
测沉淀物放射性.结果表明McAb阳性血清与I—
hTPO的结合率随血清稀释度的升高而下降.而
McAb阴?性和正常人混合血清的结合率远较McAb
血清低FL受血清稀释度的影响.
讨论
hTPO的纯化?般都要经过细胞膜结合蛋白的
增溶处理.其主要方法有二:单独应用去垢剂或加
用胰蛋白酶.后者将hTPO水解成多肽片段,所纯
化的hTPO主要为细胞外亚区片段.较天然完整的
hTPO约少90个氨基酸.本文采用未经胰蛋白酶消
化的膜增溶产物经单克隆抗体亲和层析纯化天然完
整的hTPO,不仅简便,快速,而且酶活性回收率高.
从135g甲状腺组织中经两次亲和层析最终获得酶蛋
白152rag,酶比生物活性为66.8GU/mg,虽较文献
报道低….但RZ比值0,25与文献报道相近:.印6一
实所纯化的】1TP0收出现两条蛋白质条带.分
子量分别为105KD和1.与文献报遭相同.
用免疫亲和纯化的hTPO作为标记抗原,发现
McAb阳性血清对其有免疫沉淀作用,”I—hTPO
结合率与McAb结合率高度相关.用SPA菌体试剂
也证实McAb阳性血清中存在与I—hTPO结合的
IgG~PhTPO抗体(TPOAb).Czarnocka等进一步
证实hTPO单克隆抗体与”I—hTPO的结合可被
McAb阳性血清或纯化的lgG呈剂量依赖性抑制,反
之亦然.以上结果证明AITD所涉及的甲状腺微
粒体抗原和McAb实际上分别就是hTPO和TPO.
Ab.显然,用高度纯化的hTPO作为标记抗原检澳I
TPOAb能进一步排除McAb测定中其它甲状腺自
身抗原和自身抗体的干扰,使测定的特异性,灵敏度
进一步提高…这对AITD发病机制的研究及其临床
诊断和治疗有重要意义.
参考文献
1.Me|aehianSM.eta1.Themo[eeu|arbiologyofthyroid
peroxidase:cloning.expressionandroleasautoantigen
inautoimmunethyroiddisease.EndocrRev.1992;
13:192
2.OhtakiS.eta1.Reactionsofpurifiedhogthyroid
peroxidasewithHzO,ttyrosine,andmethylmercaptoi-
midazole(goitrogen)incomparisonwithbovinelacto-
peroxidaseJBiolChem,1982;257:761
3PortmannLeta1.Anti—thyroidperoxidaseantibody
inpatientswithautoimmunethyroiddisease:possible
identitywithanti—microsomalantibody.JClinEndo-
-
crinolMetab.1985;61:i001
4.OhtakiS.etalCharacterizationofhumanthyroid
铸钢等人【f]状腺过氧化酶的纯化发与微粒体抗体的关系
1990;393:333
7CzarnockaB,eta1.Purificationofthehumanthyroid
peroxidaseandltsidentificationasthemicrosomaI
antigeninvolvedinautoimmunethyroiddiseases
FEBSLett,1985;190:147
8BeeverK,etalHighlysensitiveassaysofautoanti—
bodiestothyroglobulinandtothyroidperoxidase.Clin
Chem,1989;35:1949
(199542—27收稿)
r77吖
.NA含量分析在恶性胸腔积液诊断中的应用
J:海第一医科大学附属瑞金医院肺科(200025)时国朝邓伟吾黄绍光
生物物理教研室(20o025)f菊栗一
摘要应用流式细胞光度术检测38例良,恶性胸腔积液标本.并进行胸
液细胞学,胸液癌胚抗原值检
删.站址流式细胞DNA含量分析对恶性胸腔积液的诊断敏感性为
810:若结合胸液细胞学胸液癌胚
抗蛆f检测.则对恶性胸腔积液诊断的敏感性可达10o%.
关键词胸腔积液:流式细胞光度术:脱氧核塘核酸
中国号R5613e}R7.6
lj丽恶性胸腔积液的诊断主要依赖于胸液细胞
„榆.近年来开展r胸液癌胚抗原(carcinoemb.
t~nicantigen,CEA)~J定.但仍有部分恶性胸腔
口{液病例漏珍和误诊.大量文献
证明,细胞
【)NA芹常町作为恶性肿瘤细胞的一个标
;本实验试罔应用流式细胞光度术(flowcyto.
metry,FCM)~1定胸液细胞DNA含量,探讨其对恶
H日;【!J舱秘液的诊断价值并与胸液细胞学,胸液
CEA似检测进对比.
材料与方法
根掘组织病理检查结果将病例分成二组,其中
-
rk胸腔积液组21例.良性胸腔积液组17倒.
试剂和仪器l_RNA酶:上海华美生物程公
?i川IlI.用pH7.4Tris缓冲液配制.浓度12.碘化
?彤呼懈季
丙啶(propidiumiodide.PI)荧光染料:美国Sigma
公司出品,PBS配制,浓度50#g/ml3.FACScan流
式细胞仪:美国BeetonDickinson公司出品.
实验方法胸液标本经胸腔穿刺获得,胸液细
胞学检查以HE染色,胸液CEA值以放免法测定.其
余胸液标本肝素抗凝后留作细胞DNA含量测定.
l_胸液细胞DNA荧光染色胸液以PBS离心
洗涤.洗涤后的细胞可以70的酒精固定,一20C保
存.DNA荧光染色前,以PBS将标本中的酒精离心
洗涤.调整细胞浓度至2,3×10/ml,取细胞悬液0.
4ml,加入少量新鲜鸡血红细胞作为DNA含量分析
的内
.加入1RNA酶0.2anl,置于3J7.C10min,然
后加入P10.4ml置于4.C20min.以4号针头将细胞
悬液强力吹打3次,350日尼龙滤网过滤后上机.
2.胸液细胞的DNA含量测定全部样品均采
用FACSean流式细胞仪测定.以渡长488nm输出功
,.一,
一晰
,,三一