日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢

日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢 日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢 2002.18(1)中国人兽共患病杂志 ChineseJoumalofZ0.n05es 文章缉号:1002-2694【2002)01—0059—04 日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢 洪佳冬'何蔼.王鞋詹希姜屈良鹄' 摘要:目的为了解日丰血吸虫棱酸在宿主体内代谢规律,寻抗快捷,筒便的血嗳虫 病棱酸诊断方法提供理论依据. 方法本实验用经体井扩增的日丰血吸虫rRNA大亚基棱酸片段,以不同剂量20,4O,60,80,100耀经小鼠尾静脉注^小鼠体 内,在不同的时间5,10,20,30,60,120rain取小鼠肝,全血及血清,用PCR方法检测血嗳虫棱酸片段在小鼠体内的分布及代 谢.结果用特异的rRNA引物对日丰血嗳虫成虫基因组DNA进行扩增,可见一条分子量大小为270bp的扩增带.当注^ 小鼠体内棱酸量大干80.t~时,血清中5,/Omin组,肝内30,60min组检测出有血吸虫特异性的棱酸片段;而20,120min肝及血 清中均不能检测出血嗳虫的特异性片段.白细胞在不同剂量及各个对阃点上的PCR结果均为阴性.结论提示血嗳虫棱酸 在小鼠体内的分布及代谢情况:血吸虫棱酸进^小鼠体内,首先是分布在血清中,经血液循环后.棱酸作为异性物质.很快 地在肝内进行代谢,经一段时间后用PCR方法也检测不到. 关键调:日本血嗳虫;异源棱酸:聚合酶链反应 MetabolismofnucleicacidofSchistosoma japonieuminvivo HONGJiadong,HEAi,WANGYi,ZHANXimei,QULianghu (HealthandAnti—EpidemicStationofLiv~anDistrict,C-.ne~u,510176) ABSTRA(SJI'=AimInordertounderstandthemetabolismofthenucleicacidofS.japonicum inhost.toprovidethebasisof findingoutarapidandsimplediagnosticnudeicsmethodofSchistosomiasisMethodIntexperiment.thefragmentofrRNA largesubunitofSch/stosomawasamplifiedinvivo,andthePCRproductwasinjectedintothetailveinofmicewithdifferentdcees suchas20.40.60,80.1OOFg,thensamplesofliver.bloodandS~l-dmwetakenondifferenttimepointssuchaS5,10.20,30.60, 120minutes.edistributionandmetabolismofthenucleicacidof&histosonminmicew储tedbyPCRtechniqueRESULTS FragmentofrRNAofSyaponicumwaSampbedandfragmentsized270bpwasobserved.Whenthedosesofnucleicacidinjectedinto micewere0v80~tg.thespecialfragmentoftiIlC[eOSacidofSch/stosomatx~ldbetestedinthe9emmingroupsof5and10minutes andintheliveringof30and60minutestime,butthefragmentcouldn'tbefoundintheIiverandinthe~ftlmgroupsof20and 120minutes.Alltheresultsofbloodcellswerenegativeusingdifferentdosesolld]fferemtimepointColldttsimllThemtoatlonofthe distributionandmetabolismofthetilldeicaeidinmiceshowed:aftea"thenkldeicacidofSchlstosomawasectedintomice.itfirstdis. tributedin8 啪,thenrapidlydec~nposedinBverasexc~enicsubstance.whichctmlda'tbetestedbyPCRtechniqueafteraperk~of time. KEYw帆Ds:&histosomajaponicum;Exogemcnucleicacid;PCR 中国分娄号:R文献标识码:A 血吸虫病的确诊是依据粪检虫卵或毛蚴,但是 该法对轻度感染的血吸虫病人和晚期血吸虫病及经 过有效防治的疫区感染人群的诊断效果并不理想, 常会出现漏诊.因此,应用免疫学方法诊断病人日 趋广泛,尤其是如能在血清中找到循环抗原,则是现 症感染的依据.能考核疗效及监测疫苗效果.现在 国内外虽然建立了多种检测手段和方法并初步应用 于现场,但检测结果不稳定.究其原因.一方面由于 免疫复合物的形成导致血中循环抗原转阴(t,23.另 一 方面是由于血吸虫成虫外膜具有不断更新的特 点.外膜连同成虫肠管上皮细胞分泌物,部分皮层 细胞进入血中后被破坏,降解,这些原因造成在血中 抗原的量不够稳定,使得检测结果有时难以反映真 实情况.血吸虫核酸作为脱落产物的一部 *丰实驻摒到中华医学基查爰国束教羹博士点基查费助 作者单位:1_广州市荔湾匹卫生防疫站(广州,510176) 2.中山医科大学年生虫学教研皇 3.中山大学生专科学院 60中国人兽共患病杂志 CbineseJourrm]Zoonoses2002,18(1) 分出现在血循环中.如能在血中找到血吸虫特异的 DNA或RNA片段.就有可能作出诊断.但是目前 对血吸虫核酸在宿主体内的消长规律并不了解,本 实验用经PCR扩增的日本血吸虫rRNA基因片段. 不同剂量经尾静脉注入小鼠体内,用PCR的方法 在不同时间里检测血吸虫核酸片段在小鼠体内的分 布及代谢情况. 1材料与方法 1.1材料 1.11日本血吸虫成虫阳性钉螺取自湖南省疫 区,每只家兔人工感染尾蚴约800条.42d后处死. 收集成虫,用预冷的生理盐水反复冲洗,分装于Ep— pendorf管中,立即置一70?冰箱中保存备用. 1.2PCR反应试剂盒购自加拿大真达公司广州 分公司. 1.3DNA快速抽提液由中山医科大学寄生虫学 教研室奚志勇老师赠送. 1.4其他主要试剂及仪器xDNA/HindIll+EcoR I和PCRMarker(华美生物工程公司).SDS及蛋 白酶K(Merck). 15动物小鼠,为昆明鼠,体重20,25g,雌雄各 半,为中山医科大学实验动物中心提供. 12实验方法 12.1血吸虫成虫基国组DNA的抽提参照路 群等方法进行,并用紫外分光光度计测定DNA 的含量. 12.2鼠肝DNA的抽提同血吸虫成虫基因组 DNA提取. 123小鼠血细胞的采集及血清的分离自小鼠 眼眶采血,一部分血加肝素抗凝.4"C放置数小时后 离心.5000r/min×5.取界面层白细胞;一部分血不 加抗凝素室温静置数小时,待血块凝固后,离心取血 清,一部分血清56"C灭活30min,另一部分血清未灭 活.4"C保存. 1.24DNA快速抽提法取1,2倍体积的DNA 快速抽提液,与小鼠白细胞混匀.沸水浴5min, 10000r/min×5.取上清液作模板. 12.5聚合酶链反应(PCR)在基因扩增仪上进 行,加Taq酶之前先94"C预变性7min.反应参数: 变性92"Clmin;退火52"C50s;延伸72"C1min.循环 35次,最后一次循环延伸7min终止反应.反应结 束后取出离心管立即置4"C保存,2%琼脂糖凝胶电 泳检测. 1.2.6按20,40,60,80,100/.tg的不同剂量的血吸 虫基因组DNA注入小鼠每组5只小鼠,5rain采 血,血样按上述方法处理.用PCR检测血吸虫 DNA 1.2.7按20,40,60,80,100/Jg不同剂量的血吸虫 基因组DNA注入小鼠.每组5只小鼠,30rain取肝 脏,按上述方法处理后用PCR检测血吸虫DNA. 1.2.8每鼠注入DNA量为80/Jg.在不同时间分别 为5,10,20,30,60rain采血查DNA,每组5只小鼠. 1.2.9每鼠注入DNA量为80ttg,在不同时间分别 为10,20,30,60,120rain采鼠肝查DNA.每组5只 小鼠. 2结果 2.1用酚,氯仿抽提方法来提取日本血吸虫成虫基 因组DNA.经电泳鉴定.所提取的DNA较完整,分 子量在23kb以上.经紫外分光光度计测定DNA 含量1000~g/m!. 2.2用rtLNA引物扩增日本血吸虫成虫基因组 DNA,可见有一条清晰的约为270bp扩增带. 2.3不同剂量的血吸虫基因组DNA注入小鼠, 5rain后采血.在80,100tJg的剂量组中的5只小鼠 的血清(包括灭活与未灭活).经PCR扩增,可见一 条约270bp的扩增带,20,40,60tJg的剂量组的小鼠 的血清未见扩增带,见图1.白细胞中亦未见有扩 增带. 2.4不同剂量的血吸虫基因组13NA注入小鼠, 30rain后采肝脏,在80,100tag剂量组中5只小鼠肝 脏,经PCR扩增,可见一条约270bp的扩增带,20, 40,60tJg的剂量组小鼠的肝脏未见扩增带,见图2. 2.5每鼠注入DNA的量为80t~g,采肝脏,在30, 60min组中的5只小鼠肝脏经PCR扩增后,可见一 条约270bp的扩增带.10,20,120min组的小鼠肝脏 未见扩增带,见图3. 2.6每鼠注入DNA的量为80/Jg,采血取血清为模 板,在5,10rain组中的5只小鼠血清经PCR扩增 后,可见一条约270bp的扩增带,20,30,60min组小 鼠血清未见有扩增带.见图4.白细胞中未见有扩 增带. 3讨论 当前血吸虫病的防治策略的调整,选择采用以 人为中心的综台防治措施.因此,建立一种高灵敏, 高特异,简便,经济的检测方法仍是当务之急. 聚合酶链反应(PCR)技术是近年来发展起来的 一 种新技术.给微量材料的检测带来了新的突破. 它具有高敏感性,特异性等特点,被广泛应用于生命 科学的各个领域中.在寄生虫病的检测中也有不少 报道.q],而在血吸虫病的诊断中未见报道. 2002,18(1)中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofXoonc~es61 图1不同荆量血吸虫DNA注人小鼠体内后5min采血PCR检测的结果 1.PCRMarker2,5剂量丹别20,40.60,8O.100~g/M6为阴性对照 Fig1R镯 IIlbofdet~tionofbloodbyPCRin5minuteanerthediffere~doesofgenom~DNAofinjectedi ntothemice 1PCRmarker2,5.thedoesof20,40,60.80and100vg/6negativecontrol 图2不周剂量血吸虫DNA注人小鼠体内后30min采肝脏PCR检测的结果 1PCRMarker2,5剂量分别2040,6080,1?/"16为阴性对照 rig2R? ofdetectionofhepaticti.~BebyPCRin30minu~afterthedif~ntdoesofgenom~DNA0fsj~eeteain协the mice. 1PCRmarker.2,5thedoes20,40.60,80and100g,6.negative?ntrD1 图3注人小鼠体内DNA量为80g时在不同时间内小鼠肝脏PeR检测的结果 1PCRMark~2,5时间分别1020,3060,120min6为阴性对照 Fig3R~unsofdetectionofhep~ieti.~Beindiffe~nttimeafter80pgofgenomicDNAofieetedi ntothebodiesofmi? 1.PCRmarker.2,5.therime.f10,2030,60and120mlnresime~vly6negativecontrol 图4注人小鼠体内DNA量为80时不同时间内采小鼠血PCR检测的结果 1.PCRM~ker2,5时间分别为5,10,2030,60rain6为阴性对照 啦 4RIIlbofdetect~norbloodin~fferenttimeafter80gofgenomieDNAoreetedint0thebodieso fmi雠. 1PCRmarker.2-5thetime.f5,10,20,30and120minre5pev1y6negativecontrol (下转第72页) 72中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofZoonoses 3讨论 H感染与胃癌有关的证据首先是经血清流行 病学研究得到的【2,,结果提示胃腺癌患者血清Hp 抗体阳性率显着增高,配对比(OR)2.8,6.0,说明 Hp感染与胃恶变有密切相关国外研究还提示 感染与肠型及弥漫型胃癌有显着相关性,且此 相关性与IM和DYS类似_4,虽然异型增生不一定 伴有癌变形成,但胃癌患者胃粘膜伴有IM者超过 70%.本研究显示,随着年龄的增长,CAG,IM和 DYS病变显着增加,其中IM.DYS和GC病变?56 岁组显着高于?40岁组,说明老年人胃粘膜病变在 进一步加重.同时.Hp感染率也随着组织类型从 csG—CAG—IM—DYS+癌变而明显上升,而 CAG,IM,DYS和GC的HP感染显着高于CSG.提 示Hp在胃粘膜癌变机理的早期起到促进作用. 本研究还表明肠型胃癌H感染明显高于弥漫 型,提示长期的H感染使胃表面上皮甚至粘液颈 增殖带细胞变性坏死,修复与增生,进而使腺体发 生障碍与萎缩.形成肠化生和异型增生最后形成肠 型胃癌l5J. Hp是慢性胃炎的致病陛取决于它与胃上皮特 异性糖脂受体的结合,而该受体在胃窦部含量远高 于胃体底及胃角,故在胃炎时Hp多分布于胃窦区. 但在上皮发生萎缩或肠化或异型增生时随着胃窦 区腺体上移,使受体的环境即具有该利于H自的定 植环境上移至胃体[53.本研究也表明IM,DYS和 GC组胃体小弯和大弯的检出率显着高于CSG,胃 粘膜病变越严重,Hp感染越重.研究表明,常规行 胃窦lip检查是不全面的,必须结合胃角和胃体多 部位高位检测. 4参考文献 1Kt6persPJfandthenskandt咖age血即tofa啪一 ciateddi5?}gastritis..er,e.atropincg~tritisaadgasc ?0].Mime~tPhm'm~eolTher.1997.11(suppl11:71 2.Nom~aA.st目GN.Ch)~uP.Hdi~terin/e=6on .ridgambcc?oma锄J舯髓eAmeficatmin}hw0]NEJM. 】9q】.325.】】32 3.P~onnetJ.Ftiedmm~GD.VandersteenDPHdicobacterpy!o,-iia— fectioaandtheriskofgastabce.~cmomaU]NE]M.1991.325:l127 4.CraanenME,DeekerW.NokeP,etlnteminalmeInsmand licoSacter向:anendoscocbioticstudyofthegasUqcant舢[J], Cut.19922:l6 5P~nnetJHeHcobacterpy/or/?dgasrAc…U]Gastreo~teroI ClinNorthAm,1993.22:89 20131年4月6日收稿2001年8月23El修回 (上接第6l页) 本试验用血吸虫rRNA引物扩增了特异的核酸 片段经定量后用不同剂量血吸虫核酸经尾静脉注 入小鼠体内,当所注入核酸的量每鼠大于80g时, 在1Omin内采血,用PCR的方法可在血清中检测出 有血吸虫的特异性片段,白细胞的结果为阴I生;在 30,60rain内取小鼠肝脏.经PCR扩增后也可见特 异性条带.而在10--20mln内既不能在血液中也不 能在肝脏中检测出血吸虫的特异性条带.这些实验 结果提示;血吸虫核酸在进入小鼠体内后,首先是分 布在血清中.经血液循环后,随血液进入肝脏这时 由于较均匀地分布在全身的血液及肝脏中,尽管从 理论上讲,只要样品中有一个分子,都可用PCR的 方法测出,但在实际操作中仍需要有一定量的模板. 在注射血吸虫核酸入小鼠体内后10,20min,核酸 量分布相对分散,样本中所含模板量太少.所以在 血清与肝脏中均不能检测出有血吸虫的特异I生片 段.随着时间的推移,核酸大部分都进入肝脏后,又 能用PCR的方法在肝脏中检测出血吸虫的特异性 核酸片段.最后,血吸虫核酸片段在肝脏中作为异 源物质,被肝内酶破坏,降解.原来可检测出来的核 酸片段可能被切断,这就使得用PCR的方法也不能 检测出肝脏中的血吸虫特异性核酸片段. 本研究只涉及异源核酸在鼠肝及血中的代谢情 况,对于血吸虫DNA在宿主体内详细代谢机制,代 谢动力学以及如何将代谢规律应用到血吸虫病的检 测及疫苗研制中去,尚有待进一步的研究. 4参考文献 1Hilly~GVSchi~tosome且ntjensiatheciteLdonofchimpanzeesin— f~tedwithSchistosoraajal~sleum【J]AmJmopMedHyll976, 25:432 2MadwarMAeta1.AntNeinchetercgeaeiD"inpatientwithr~etions 1nb.rdertlnetcprmp[JJBrMcdJ,1975.4:435 3路群,詹希美,王亮等.中国太陆4地日本血吸虫rRNA片断多态 性分析[J]广东省寄生虫学会年报.1995,17:28 4.DeBruijinMHIeya1.DiagnosticDNAamplificadonnorespiteforthe dl~tveparasite【J].ParasitolToday.1988,4(10):293 5.WeissLMetSensitlandSpe~ilcDetectionofTozoplasma DNA[n皿experimentalroutine"loc【d:Useof丁枷gondii— specificcDNAaadthePolymemseChainRearion【』J』Ird~tD, 1991.163(1):l80 6.YusukeWatayaetDNADiagac~isofFma/ar/ausinga doublePCRtechnique:afiddtrialintheSolomonlslands【JJMol BiochemParasitol,1993,58:165. 7.MoserDRetDetectionofTr'Mmnom~congolenseandTry- pano,~mabruce/sI】bsped髑byNDAorap[ifioationLlsi【lgthePoly— mer~eChelnRe~tion[J].Paradtol,l989,99:57 8EakinAEeta1.Amplificationandseq.~gofg~omieDNAfrag? m?encodingeysteineproteo~esfromprotozoanporasite~[JJ.Mol o2ht~tllParasitol.1990,39:1. 9BurgJLalDirectands口detect~nofapathogeincprotozoan To.plasmagondllPolymetmeChainRear'ca[J]JCllnMicrobi— o1.1989,27:1787 2000年l2月6日收稿