大鳞大马哈鱼精子活力的观察

大鳞大马哈鱼精子活力的观察 大鳞大马哈鱼精子活力的观察 吉林农业大学2007,29(3):338,342 JournalofJilinAgriculturalUniversity E-mail:flndxb@.sina.corn 大鳞大马哈鱼精子活力的观察 王炳谦,徐连伟2,韩志忠2,贾钟贺,尹家胜 (1.中国水产科学院黑龙江水产研究所,哈尔滨150070;2.哈尔滨市农业科学院水产分院, 哈尔滨150070) 摘要:采集成熟的大鳞大马哈鱼精子,在不同的激活介质,人工精浆(ASP),pH和温度条件下进行活力观 察.结果表明:用生理盐水(BSS)激活的精子活力高于用水激活(P<0.05),单尾鱼的精子活力高于多尾混精 (P<0.05);在ASPA,B和C液中,用ASPC液保存精子的效果最好(P<0.05);保持大鳞大马哈鱼精子活力 较强的适宜pH值为8.19,8.40,而活力最强时pH值为8.40;在4~C下保存的大鳞大马哈鱼精子活力最高;大 鳞大马哈鱼受精率最高时的温度和pH值分别为4~C和8.40,这与大鳞大马哈鱼精子活力最强时的温度和pH 条件高度相关. 关键词:大鳞大马哈鱼;精子活力;激活剂;人工精浆;pH值;温度 中图分类号:S965.229;S961.22文献标识码:A文章编号:1000.5684(2007)03—0338.05 ObservationonSpermMotilityofChinookSalmon WANGBing—qian'.XULian—wei,HANZhi—zhong,JIAZhong—he',YINJia—sheng' (1.HeilongjiangInstituteofRwerResearch,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin1 50070,Chi一 ,;2.InstituteofFisheriesResearch,HarbinAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150070,Chi— M)' Abstract:TheactivationandmotilityofspermatozoafromChinooksalmoncollectedbydissectionwere studiedunderdifferentreactivators,ASP,pHandtemperature.Theresultswerea8follows:spermmotil— ityinBSSishi 【gherthanthatinwater(P<0.05).Spermmotilityofonefishisbetterthanthatofmixed milt(P<0.05).InASPA,BandC,ASPCisthebesttopreservespermatozoa(P<0.05).epH valuetohelppreservestrongmotilityofthespermatozoaispH8.19, 8.40.andspermatozoamotilityis thehighestundertheconditionsofpH8.40.W11entemperatureis4~C.spermmotilityisthehighest. eoptimumtemperatureandpHforthehighestfertilizationofChinooksalmonarealso4and8.4re— spectively,consistentwiththeconditionsmakingthevitalityofthespermatozoahighest. Keywords:Chinooksalmon;spermvitality;reactivator;artificialseminalplasma(ASP);pHvalue; temperature 人工受精是鱼类人工繁殖中的一项重要技 术,获取具有受精能力的精子是保证人工繁殖成 功的重要步骤之一.而精子活力是影响精子的质 量和受精能力的主要因素之一.有关鱼类精子活 力方面的研究,国内外学者曾作过一些报道H, 最近国内外学者主要针对鱼类精子的新陈代谢, 渗透压,受精动力学和细胞兴奋性等进行了研 究【5],但国内对鲑科鱼类精子活力方面的研究报 道很少,仅见虹鳟,细鳞鱼,未见大鳞大马哈鱼的 相关报道. 我国2001年从美国引进大鳞大马哈鱼,目前 全人工繁殖已获成功,并开始在全国推广养殖. ?基金项目:国家"948"项目(203104) 作者简介:王炳谦(1963.),男,硕士,副研究员,主要从事鲑鳟鱼类养殖及育种研究. 收稿日期:2006.04.O1修回日期:2006.07.26 ??通讯作者 国外报道了大鳞大马哈鱼精子的短期保存]和精 子暴露于不同氧张力下的ATP水平].本试验 对大鳞大马哈鱼的精子在不同的激活介质,人工 精浆(ASP),pH和温度条件下的精子活力进行了 初步研究,以期为在大鳞大马哈鱼人工繁殖时提 高受精率提供基础资料. 1材料与 1.1试验材料 1.1.1试验用鱼及精液采集试验用雄性大鳞 大马哈鱼取自中国水产科学研究院黑龙江水产研 究所渤海冷水性鱼类试验站,利用2001年从美国 引进繁殖的F代苗种培育成的亲鱼.选择体质 健壮,体表光滑无伤,性腺丰满且生理成熟的2龄 雄性大鳞大马哈鱼24尾,体长34.546.0cm,体 重4801115g.精液采用人工挤压方法获得,挤 压前用干毛巾擦干鱼体表,挤压过程中防止尿液 与体表水分混入精液. 1.1.2药品配制人工精浆(Artificialseminal plasma,ASP)[m]配制成A,B,c3种,其pH值均以 0.1mol/LNaOH调整至8.4. A液:将NaC17.43g,KC12.78g,CaCl2?2H2O 0.38g,MgC12?6H200.31g,NaHCO30.42g用蒸馏 水溶解,并定容至1L. B液:将NaC17.60g,KC10.2g,Cat12?2H2O 0.2g,NaHCO30.02g用蒸馏水溶解,并定容至 1L. c液:将NaC17.60g,KC12.98g,CaC12?2H20 0.37g,MgC12?6H2O0.31g,NaHCO30.21g用蒸馏 水溶解,并定容至1L. 生理盐水(Balancedsaltsolution,BSS)【J配制 方法为将NaC17.50g,KC10.2g,CaC12?2H2O 0.2g,NaHCO30.02g用蒸馏水溶解,定容至1L, 其pH值通过添加0.1mol/LNaOH调整为7.5, 7.8,8.2,8.4,9.8. 1.2试验设计 1.2.1不同激活剂及精液混合方式试验随机 取9尾鱼,3尾1组.混精试验为将每组内鱼的 精液(每尾1mL)混合后,立即以养殖用水和生理 盐水(pH8.19)为激活剂,每组做10次重复观察. 单精试验为每组3尾鱼的精液不混合分别重复上 述操作. 1.2.2不同pH值对精子活力影响的试验随 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 王炳谦等:大鳞大马哈鱼精子活力的观察339 机取3尾鱼,将每尾鱼的精液分别以pH值为 7.5,7.8,8.19,8.4,9.8的生理盐水激活,每组做5 次重复观察. 1.2.3不同保存温度及时间对精子活力影响的 试验随机取3尾鱼,将精液混合并等分成8份 (每份1.0mL),分别在1,2,3,4,5,8,12,16?室 温下进行保存试验,以4?,pH8.4的生理盐水为 激活剂,于采精后第0,1,2,4,8,16h进行观察,每 个时间点进行3次重复观察,其后观察精子全部 死亡时间. 1.2.4不同ASP对精子活力影响的试验随机 取3尾鱼,将每尾鱼的精液分别放入pH8.4的 ASPA,B和c液中,于4~C保存,精液在每种ASP 中稀释的倍数均为50,100,150倍,以4~C的 pH8.4的生理盐水为激活剂,于放入ASP后1.0, 1.5,2.0,3.0h进行观察,每个时间点进行3次重 复观察. 1.2.5不同人工授精条件对受精率影响试 验孵化水温为5.1oC,在1L烧杯中分别加入等 量的不同温度,pH为8.4的生理盐水计16组,不 同pH,温度为4?的生理盐水计5组,分别与等 量的卵搅拌均匀,然后立即加入精液并搅拌均匀. 受精率的观察,从极体出现到原肠期为止n. 1.3精子活力的测定方法 用移液器取50肚L激活液于载玻片上,并移 到视野内.以牙签挑取少许精液放入显微镜下载 玻片的液滴中,记录时间并进行观察.将载玻片 置于Motic(/35ProfessionalSeries)显微镜下(10× 10倍),并将载玻片固定好,然后参照鲁大椿n]精 子活力的分级,用快速运动时间,总运动时间 和激活率等指标来精子活力.快速运动时间 即从精液与激活液混合开始,到约70%运动精子 转入缓慢运动(此时精子运动变慢,能看清其大致 形态和运动路线)的时间;总运动时间即从精液与 激活液相混合开始,到视野中约90%的精子停止 活动的时间;激活率以显微镜下同一视野中的活 动精子百分率表示. 1.4统计分析方法 采用SPSS11.0软件对试验数据进行分析. 2结果 2.1激活剂及混精方式对精子活力的影响 大鳞大马哈鱼性成熟雄鱼的精子无论是快速 340吉林农业大学2007年6月 运动时间还是总运动时间,在生理盐水中的运动(P<O.05),但激活率没有明显差 异(表1). 效果都好于在水中(P<O.05),单精好于混精 表1不同激活剂对精子激活率的影响 Table1.InfluenceofdifferentreactiVatOrsonpercentageofmotilesperms 2.2pH值对精子活力的影响 环境温度16%时pH值对精子活力的影响见 表2.将精子放人不同pH值的生理盐水中立即 进行观察,结果表明,在pH7.5,9.8的生理盐水 中精子均有一定活力,pH7.5,8.4的生理盐水中 速运动.pH为8.19和8.4时精子活力显着高于 pH7.8时(P<O.05),极显着高于pH7.5时(P< O.01),而pH值为8.19和8.4的2个处理中精子 活力差异不显着.可见大鳞大马哈鱼精子激活的 适宜pH值为8.19,8.4,最适pH值为8.4,即大 精子的运动呈加快趋势,而pH9.8时则不出现快鳞大马哈鱼精子适宜在弱碱性环 境中活动. 表2pH值对精子活力的影响 Table2.InfluenceofpHonspermmotilityafterthedischarge 2.3不同保存温度和时间对精子活力的影响 由表3可知,温度在1,4?范围内精子的运 动时间呈明显上升趋势,而5,16?时则呈缓慢 下降趋势,并且在4?时,精子活力最高,保存时 间也最长.精子全部死亡时间为27h. 表3不同保存温度和时间对精子活力的影响 Table3.Influenceofdifferenttemperatureandtimeonspermmotilafterthedischarge JournalofJilinAgriculturalUniversity2007,June 2.4不同的ASP对精子活力的影响 通过观察,环境温度4?时,在ASPA液和B 液中保存1h的精子全部死亡,在c液中保存1h 的精子仍有较强的活力.在c液中保存1h的不 同稀释倍数精子的活力无显着差异(P>0.05), 但在c液中保存1.5h的精子全部死亡. 表4人工精浆C液不同的稀释倍数对精子活力的影响 Table4.InfluenceofdifferentdilutedfoldASPConsperm motilityofChinooksalmonin1hour 2.5人工授精适宜的温度和pH值 在不同温度和pH条件下进行人工授精,其 受精率分别见图1和图2. l234581216 t/? 图1温度对受精率的影响 Fig.1.Effectoftemperatureonfertilization i6O 墨 絮40 【工_ 20 7.57.88.198498 pH 图2pH值对受精率的影响 Fig.2.EffectofpHonfertilization 在本试验的温度和pH值范围内,受精率均 有1个峰值.由图1,2可知,大鳞大马哈鱼人工 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 王炳谦等:大鳞大马哈鱼精子活力的观察341 授精适宜的温度和pH范围分别为3—8?和 pH8.19,8.4,适宜的温度和'pH条件分别为4? 和pH8.4.在适宜温度和pH范围以外,人工授 精的受精率则明显降低. 3讨论 鱼类精子的激活是指精巢中不活动的精子释 放进入水体后在各种水体理化因子的作用下变得 活动起来的简短过程,而精子活力则指精子受激 活后运动的能力和持续时间.在众多的影响因子 中渗透压是鱼类精子激活与活动的最关键的影响 因素[13-14].一般认为,淡水鱼类精子的激活是由 低渗环境所致,且存在使精子活动时间(寿命)最 长的最适渗透压[15-16].本试验中,用生理盐水激 活的精子活力明显高于用水激活的(P<0.05). 原因是Na(维持细胞兴奋性和渗透压的主要阳 离子)在一定范围内具有提高精子活率和加快精 子运动速度的作用l_1.这提示Na可以通过诱 发细胞膜去极化产生动作电位,进而引起细胞内 Ca2浓度的变化,起到间接激活精子运动的作 用,同时会使运动的强烈程度增大.所以在生理 盐水的激活作用下精子能更具有活力,运动更剧 烈,但由于生理盐水是缓冲溶液,有调节渗透压 的作用,精子不会在极短的时间内发生细胞内 Ca2一Na大量交换,将ATP大量活化导致动能 全部释放而寿命过短.这说明尽管大鳞大马哈鱼 的精子是在自然条件下的淡水中激活,但养殖用 水不是良好的激活介质,这与Cosson等的l_1J研究 结果相同. 本试验中,单尾鱼的精子活力显着高于混精 的活力,这可能是由于不同雄鱼的生理条件不同, 导致不同雄鱼精液问和精子的理化成分也不同, 精液混合后,改变了精子原来所处的生理环境,缩 短了精子的寿命,另外也可能是不同鱼的精子之 间存在着竞争也会导致部分精子活力下降.为了 延长精子的活力,许多研究都在模拟精液的组成 成分,寻找卵巢液的替代品和适当的激活剂.生 产中有许多简单的生理溶液和复杂的介质被用于 鱼苗的孵化,但是没有研究确定某个品种的最佳 介质【19].本试验用ASP(A,B和C)液保存精子, 其中C液中保存的精子寿命最长,但精子也只能 存活2h左右,可见用这3种溶液保存精子效果也 不理想,可能是这3种溶液的渗透压与精液的渗 ?如?如加加0 EI口【I矗 褂孵 342吉林农业大学2007年6月 透压相差较大,或者还有其他因素如溶解氧. pH和温度也是影响鱼类精子活力与寿命的 重要因素.唐天德等加J认为,鱼类精子均适于在 中性和偏碱性环境中活动,酸性环境会破坏精子 细胞,抑制精子活力.据报道,草鱼,鲤,乌鳢等淡 水鱼类精子活力最强时的适宜pH值均在7.5 9.0,即在弱碱性范围内2.在本试验中大鳞大 马哈鱼精子活力最强时的pH值为8.4,这一结果 与一般淡水鱼类一致.另外在试验中4~C下保存 的精子活力和寿命以及保存时间高于4~C以上处 理,这可能是由于高温会增加精子的摆动频率,降 低向前泳动的持续时间,而低温(4—10~C,自然 繁殖温度)会延长精子向前泳动的持续时间.另 外,低温(4?左右)下保存精子可使精子的新陈代 谢变慢,也可延长精子的保存时间].赵强在对 暗纹东方鱼屯精液冷藏的研究中指出,精子活动时 间随冷藏保存时间的延长而呈指数下降],本试 验结果与之相似. 本试验结果表明,在4~C,pH8.4的条件下, 当大鳞大马哈鱼精子活力最强时,其受精率也最 高,两者高度一致,表明精子活力与受精率密切相 关.在人工授精时,为得到高的受精率,必须使精 子具有较强的活力.有关影响精子活力的其他因 子如渗透压等还有待进一步研究. 参考文献: [1] [2] [3] [4] [5] [6] 周定刚,温安样.黄鳝精子活力检测和精子入卵早期过程 观察[J].水产,2003,27(5):398..402. 阮国良.冯家斌,杨代勤.渗透压,pH和温度对泥鳅精子活 力及受精率的影响[J].湖北农学院,2004.24(1):22. 25. 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