[doc格式] 异位、在位和正常子宫内膜基质细胞分泌RANTES水平比较

[doc] 异位、在位和正常子宫内膜基质细胞分泌RANTES水平比较 异位、在位和正常子宫内膜基质细胞分泌 RANTES水平比较 第28卷第7期 2008年7月 南京医科大学(自然科学版) ACTAUNIVERSITATISMEDICINALISNANJING(NaturalScience)?8 3l? 异位,在位和正常子宫内膜基质细胞分泌RANTES水平比较 方春丽,王秀丽,王嫜,孔娜,韩素萍 (南京医科大学第一附属医院妇产科,江苏南京210036) [摘要]目的:比较子宫内膜异位症患者异位内膜,在位内膜和正常子宫内膜分泌RANTES的水平,以了解盆腔局部趋化巨 噬细胞浸润的始动因素.方法:不同浓度(5,10,20ng/m1)的IL.1B刺激培养异位内膜基质细胞;选择最佳刺激浓度的IL.1p刺 激培养异位内膜,在位内膜和正常内膜基质细胞,在不同的时间点取培养上清ELISA检测RANTES水平.结果:10ng/ml的IL-1B 是刺激异位内膜基质细胞分泌RANTES的最佳浓度:异位内膜基质细胞分泌RANTES的水平显着高于在位内膜和正常内膜 (P<0.01);刺激培养60h后,在位内膜RANTES分泌量较正常内膜显着增加(P<0.05).结论:EMS患者的在位内膜与正常内 膜相比,其生物学特性已经发生了改变,盆腔内的异位内膜,巨噬细胞 和细胞因子形成了一个炎症反馈环,促进了异位内膜的种 植,生长和局部炎症的发生. [关键词]子宫内膜异位症;异位内膜;在位内膜;RANTES;巨噬细胞 [中图分类号]Q786[文献标识码]A[文章编 号]lOO7-4368(2oo8)07.831-05 ComparisonofRANTESexpressioninectopic,eutopicandnormalendometrium FANGChun—li,WANGXiu—li,WANGWei,KONGNa,HANSu—ping (DepartmentofObstetricsandGynecoligy,theFirstAffiliatedHospitalofNJMU,Nanjing210036,China) [Abstract]Objective:Toexplorethemajorfactorofenhancingmonocyterecruitmentintotheperitonealcavity.Methods:The stromalcellofectopicimplantswasexposedtovariousconcentrations(5,10,20ng/m1)ofIL一113andthe10ng/mlofIL?1pwas COculturedwithectopicimplants,eutopicandnormalendometrium.ConcentrationofRANTESinthecellculturesupernatantwas measuredwithasandwishELISA.Results:The10ng/mlofIL-113elicitedthehighestsecretionofRANTESinectopicimplants.The RANTESsecretedbythestromalcellofectopicimplantswasincreasedmoresignificantlythanthatineutopicandnormalendometrium (P<0.01).After60h,thestromalcellofeutopicendometriumsecretedmuc hmoreRANTESthannormalendometrium(P<0.05). Conclusion:Thesefindingsareconsistentwithafeed?forwardinflammatoryloopamongtheactivatemacrophages,RANTESproduc— tionbyectopicimplantsandfurthermonocytechemotaxis.Wepostulatethatthispathwayisactivatedinendometriosis,andthe bioactivityofeutopicendometriumwasdifferentfromnormalendometrium. [Keywords]endometriosis;ectopicimplants;eutopicendometrium;RANTES;macrophages [ActaUnivMedNanjing,2008,28(07):831-835] 子宫内膜异位症(EMS)的发生与妇女盆腔局部 和全身的免疫功能紊乱密切相关.研究发现,EMS患 者的异位内膜,腹腔液和卵泡液中有大量的巨噬细胞 浸润和细胞因子生成,这些高浓度的细胞因子多为巨 噬细胞来源,它们促进了逆流内膜的种植和生长[1]. 体外实验研究结果显示.EMS患者腹腔液中70%的 单核一巨噬细胞系由RANTES趋化而来[2].本研究针 对巨噬细胞的重要趋化因子RANTES(reducedupon activation.normalTexpressedandsecreted,由正常T 细胞达和分泌,活化时表达下降的因子),比较了异 位内膜,在位内膜和正常子宫内膜分泌RANTES的 水平,以了解盆腔局部趋化巨噬细胞浸润的始动因 素,有助于从病因学上寻找治疗EMS的新方法. [基金项目1国家自然科学基金资助(30600671),江苏省自1材料与方 法 然科学基金资助(BK2006577) 通讯作者,E.mail:han_suping@hotmail.com1.1标本来源 ? 832?南京医科大学 第28卷第7期 2008年7月 11例EMS患者的异位内膜取自2006年9月 至2007年6月在本院因卵巢子宫内膜异位囊肿接 受手术治疗的患者,术前3个月内未服用过性激素 类药物.手术均在月经周期前半期进行.据美国生 殖学会(AFS)修正分期法?期患者7例,?期患者4 例.手术室严格无菌操作下取2cm×3cm大小异 位囊肿壁.置人含有青,链霉素各200U/ml的 DMEM细胞培养液中,立即送实验室进行基质细胞 的分离培养,手术标本经病理检查均证实为EMS. 11例EMS患者的在位内膜取自以上同一患 者.其中部分为同时罹患子宫肌瘤或子宫腺肌症切 除子宫时取材,部分为内异症合并不孕的患者于术 中行输卵管通液检查后取材. 5例正常的子宫内膜取自本院计划生育门诊手 术室因节育环位置下移而取环的患者,节育环均不 含激素类药物 1.2方法 1.2.1基质细胞分离,培养及鉴定 将内膜剪碎至1mm大小,O.125%的I型胶原 酶溶液37?消化1.5h,消化液用150目铜网初筛, 400目铜网复筛,滤液离一t2,(1500r/min,7min, 4~C),沉淀细胞用含10%FCS的DMEM/F10培养液 培养.待细胞在盖玻片上爬片生长至80%,90%时 取出,用免疫细胞化学法鉴定,一抗分别为小鼠抗 人角蛋白和小鼠抗人波形蛋白抗体(美国Neo Markers公司产品) 1.2.2ELISA检测内膜基质细胞培养上清中RANTES 水平 将原代培养7,10天后的细胞传代接种于六孔 板中,待细胞90%汇片时,用OPTI.MEM低血清培 养48h.不同浓度(5,10,20ng/m1)IL.1B(美国 Sigma公司产品)刺激培养异位内膜基质细胞.然后 选择最佳刺激浓度的IL.1B刺激培养异位内膜,在位 内膜和正常内膜基质细胞,在不同的时间点(12,24, 36,48,60,72,84和96h)取培养上清4000r/min 离心后一20?保存,RANTESELISA试剂盒(美国 R&D公司产品)检测,实验重复3次 1.3统计学方法 数据以均数?标准差(?s)表示,采用SPSS 11.5统计软件中One.WayANOVA进行多个样本均 数比较,P<0.05为差异具有显着性. 2结果 2.1原代培养的异位内膜,在位内膜和正常内膜基 质细胞 内膜基质细胞接种24h后大部分贴壁.呈多边 形或梭形,培养3,4天后细胞排列无极性.平铺生 长,细胞质薄而透明,核居中,呈圆形或椭圆形.异 位内膜基质细胞多呈多边形,体积较大,生长较慢 (图1A).在位内膜和正常内膜基质细胞多呈梭行, 生长较快(图1B,c).内膜基质细胞平均可维持生 长5,8周.传代4,6次.本研究中所用的基质细胞 均传代1-2次.免疫细胞化学染色显示,异位内膜 基质细胞波形蛋白染色阳性(图2A,B),角蛋白染 色阴性(图2C),纯度较高.波形蛋白是一种细胞骨 架蛋白,可在细胞质内形成一个完整的支撑网架, 在外与细胞膜和细胞外基质相连.在内与细胞核表 面和核基质直接联系(图2A). 2.2在位,异位内膜和正常内膜基质细胞IL.1B刺 激培养上清液中RANTES的表达水平 2.2.1标准曲线 按照RANTESELISA说明配制不同浓度的 RANTES标准品,由酶标仪读出吸光度(.4)值,绘制 标准曲线,见图3. 2.2.2异位内膜基质细胞在不同浓度(5,10,20ng/m1) IL.1B刺激后不同时间点的RANTES表达水平 20ng/mlIL.1B刺激培养12hRANTES分泌量 即显着增加,并持续上升至60h,但72h后分泌量 较前下降.5ng/ml的IL.1B刺激培养后RANTES 分泌量略有增加,幅度较小.10ng/ml的IL.1B刺激 培养后自36h开始分泌量较5ng/ml组明显增加. 并可维持上升状态至96h,在72h后其刺激 RANTES分泌的能力甚至超过了20ng/ml组(图 4).据此实验结果,本研究选用10ng/ml的IL.1B 作为最佳刺激浓度. 2.2-3异位内膜,在位内膜和正常内膜基质细胞在 IL一1p(10ng/m1)刺激后不同时间点RANTES的表 达水平 10ng/mlIL.1B刺激后,正常内膜基质细胞 RANTES分泌量较低,维持于(39.19?14.29), (56.88?17.28)pg/ml.刺激培养60h,在位内膜 RANTES分泌量达(173.79?45.26)pg/ml,较正 常内膜显着增加(P<0.05),并持续上升至 (260.65?59.69)pg/m].异位内膜自刺激培养24h 开始RANTES分泌量明显高于在位内膜和正常内 膜(P<0.01),96h可高达(926.52?97.19)pg/ml (图5) 第28卷第7期 2008年7月方春丽等:异位,在位和正常子宫内膜基质细胞分泌RANTES水平比较?833? AB A:异位内膜:B:在位内膜:C:正常内膜. 图1原代培养的异位内膜,在位内膜和正常内膜基质细胞(×200) Fig1Themorphologiesofpurifiedectopic,autologouseutopicandnormalen dometrialstromalcells(x200) A:波形蛋白(×200);B:波形蛋白(×100);C:角蛋白(×100). 图2异位内膜基质细胞(免疫组化) Fig2Theimmunocytochemistryofpurifiedectopicendometrialstromalcells RANTES(pg/m1) 图3RANTESEL|SA标准曲线 Fig3ThestandardcurveofRANTESELISA — ?一:5ng/ml;—?一:10ng/.d:—?一:20ng/ml. 与5ng/ml相比,P<0.05;与10ng/ml相比,<0.05. 图4不同浓度IL一1B刺激后异位内膜基质细胞表达 RANTES水平的比较 Fig4RANTESexpressioninsupernantsofectopicendometrial stromalcellstreatedwithIL一1Batdifferentdoses C C _?_:异位内膜;+:在位内膜;十:正常内膜. 与正常内膜相比,P<0.05,与正常内膜及在位内膜相 比.<0.05. 图5异位内膜,在位内膜和正常内膜基质细胞在IL.1p (10ng/m1)刺激后RANTES表达水平比较 Fig5RANTESexpressioninconditionedmediafromectopic, autologouscutopicandnonllalendometrialstromalceils stimulatedwith10ng/mlofIL一1p 3讨论 EMS目前的治疗主要是对症治疗,包括手术和 激素类药物.对症治疗的年均复发率为5%,20%,治 疗后5年复发率达40%.针对EMS的致病机制进行 对因治疗可有效地预防和控制EMS的发生与发展. 在EMS的病因学说中.以Sampson的经血逆流学说 广为接受.90%的妇女在月经期会发生经血逆流,但 一一g\一?-IJ乏《 一1?盘一?z《 ? 834?南京医科大学 第28卷第7期 2008年7月 是为何只有10%,15%的妇女发展成为EMS,近年 研究认为,在易感基因和环境的共同作用下,部分 妇女盆腔局部和全身的免疫状况发生改变使其不 能有效地清除逆流的内膜组织,异位内膜和盆腔内 增多的免疫细胞分泌的各类细胞因子促进了逆流 内膜的种植,生长和局部炎症的发生.了解这些免 疫细胞和活性因子之间的相互关系与作用机制.找 出免疫状况紊乱的重要因素将有助于寻找更有效 的治疗方法一]. 近年研究显示,在EMS患者的异位内膜,腹腔 液和卵泡液中有大量的巨噬细胞浸润,EMS患者 异位内膜和腹腔液中高浓度的炎性因子多为巨噬 细胞来源.Hornung等研究表明,RANTES是募集 巨噬细胞至EMS病灶部位的主要趋化因子,EMS 患者腹腔液中70%巨噬细胞的迁移归因于 RANTES的趋化作用.那么EMS患者腹腔液中 RANTES来源何在?既往研究显示,RANTES主要定 位于内膜基质.内膜基质细胞分泌RANTES需要 IL.1B,TNF.仅或IFN.-,/等细胞因子的刺激.为比较 异位内膜,在位内膜和正常内膜分泌RANTES的水 平,本研究选用?,?期的EMS患者,在手术治疗时 取异位内膜和同一患者的在位内膜组织进行培养. 内膜细胞的原代培养结果显示,异位内膜基质 细胞多呈多边形,体积较大,生长较慢.在位内膜和 正常内膜基质细胞多呈梭行,生长较快.免疫细胞 化学染色显示,异位内膜基质细胞波形蛋白染色阳 性.角蛋白染色阴性,说明本研究中内膜基质细胞 的分离,培养方法可获得较高纯度的基质细胞. 为了解IL.113刺激异位内膜基质细胞分泌 RANTES的最佳浓度,分别用5,10,20ng/ml的IL1B 刺激培养传代一次的异位内膜基质细胞.结果发 现,5ng/ml的IL.1B刺激培养后RANTES分泌量 无明显增加,20ng/ml的IL.1B刺激培养12h RANTES分泌量即显着增加.但72h后分泌量较前 下降.10ng/ml的IL.1B刺激培养后自36h开始 分泌量较5ng/ml组明显增加,并可维持上升状态 至96h.在72h后其刺激RANTES分泌的能力甚 至超过了20ng/ml组.据此实验结果,本研究选用 10ng/ml的IL.1B作为最佳刺激浓度. 在10ng/mlIL.1B刺激后,正常内膜基质细胞 RANTES分泌量始终较低.在位内膜RANTES分泌 在6Oh时较正常内膜显着增加(P<0.05),并持续 至96h.异位内膜白刺激培养24h开始RANTES 分泌量明显高于在位内膜和正常内膜(P<0.01), 96h可高达(926.52?97.19)pg/ml.由此可见,异位 内膜基质细胞在IL.1B刺激下,其分泌RANTES的 水平远远高于在位内膜和正常内膜.此外,在位内 膜与正常内膜相比,其分泌RANTES的特性也有较 大差异. 以上研究结果可以认为,EMS患者的在位 内膜与正常内膜相比,其生物学特性可能已经发生 了改变.其一旦逆流至盆腔,腹腔液中的炎性因子 便会刺激其分泌RANTES,做为一种促炎性细胞因 子,RANTES对单核细胞,T细胞,树突状细胞,嗜酸 粒细胞,嗜碱粒细胞等均具有强烈的趋化或/和刺 激作用.趋化至盆腔局部和异位内膜病灶的巨噬细 胞能分泌多种细胞因子,包括VEGF,IGF.1,MMP3, IL.1,IL.6,IL.10,IL.12,IFNe~,TGF.B和粒细胞一巨 噬细胞集落刺激因子(GM.CSF)等].这些细胞因 子一发面导致局部炎症发生,一方面促进新生血管 形成,促进异位内膜种植和生长.同时,病灶中巨噬 细胞生成的IL.1B和TNF.仅又能刺激异位内膜分 泌更多的RANTES以趋化巨噬细胞.由此形成一个 炎症反馈环.在EMS病灶的炎症反馈环中,巨噬细 胞处于关键的中心地位.. 巨噬细胞是由血液中的单核细胞进入组织后 转化而成的.在这些组织中,巨噬细胞能吞噬和降 解外来抗原;溶解基质进行组织重塑;产生和分泌 多种生长因子,细胞因子及趋化因子l12.既能维持 内环境的稳定,也可导致疾病发生.在EMS状态下, 腹腔内过量的巨噬细胞则加速了疾病的发生与发 展.由于EMS患者腹腔中70%巨噬细胞的迁移归 因于异位内膜分泌的RANTES的趋化作用,抑制异 位内膜分泌RANTES的能力或针对于单核一巨噬细 胞上RANTES的受体阻断RANTES对巨噬细胞的 趋化作用可在一定程度上减少巨噬细胞的浸润,控 制EMS患者盆腔局部和/或全身炎症反馈环的进 展.以期从病因学上寻找治疗EMS的新方法. [参考文献] [1]KyamaCM,DebrockS,MwendaJM,eta1.Potential involvementoftheimmunesysteminthedevelopmentof endometriosis[J].ReprodBiolEndocrinol,2003,1:123 [2]HornungD,KlingelK,DohrnK,eta1.Regulatedonacti— cell—expressedand—secretedmRNAex— vation.normalT— pressioninnormalendometriumandendometrioticim— plants:assessmentofautocrine/paracrineregulationbyin situhybridization[J].AmJPathol,2001,158(6):1949- 1954 第28卷第7期 2008年7月方春丽等:异位,在位和正常子宫内膜基质细胞分泌 RANTES水平比较?835? [3]D’HoogheTM,KyamaC,DebrockS,eta1.Futuredirec— tionsinendometriosisresearch[J].AnnNYAcadSci, 2004,1034:316—325 [4]ThomsonJC,RedwineDB.Chronicpelvicpainassociated withautoimmunityandsystemicandperitonealinflamma— tionandtreatmentwithimmunemodification[J].JRe— prodMed,2005,50(10):745—758 [5]SiristatidisC,NissotakisC,ChreliasC,eta1.Immunological factorsandtheirroleinthegenesisanddevelopmentof endometriosis[J].JObstetGynaecolRes,2006,32(2): 162—170 [6]KhanKN,MasuzakiH,FujishitaA,eta1.Differential macrophageinfiltrationinearlyandadvanceden— dometriosisandadjacentperitoneum[J].FertilSteril, 2004,81(3):652—661 [7]LinYJ,LaiMD,LeiHY,eta1.Neu~ophilsand macrophagespromoteangiogenesisintheearlystageof endometriosisinamousemodel[J].Endocrinology, 2006,147(3):1278—1286’ ,,, [8]KaluE,SumarN,GiannopoulosT,eta1.Cytokineprofiles inserumandperitonealfluidfrominfertilewomenwith andwithoutendometriosis[J].JObstetGynaecolRes, 2007,33(4):490—495 [9]KyamaCM,OverberghL,MihalyiA,eta1.Endometrial andperitonealexpressionofaromatase,cytokines,andad— hesionfactorsinwomenwithendometriosis『J].Fertil Steril,2008,89(2):301—310 [10]NaYJ,JinJO,LeeMS,eta1.Peritonealfluidfromen— dometriosispatientsswitchesdifferentiationofmonocytes fromdendriticcellstomacrophages[J].JReprodIm— munol,2008,77(1):63—74 [11]SikoraJ,Anasz—KonderaZ,Mielczarek—PalaczA,eta1. 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