克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内_外刺激肺上皮细胞分泌IL_8的研究_cropped

克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内_外刺激肺上皮细胞分泌IL_8的研究_cropped 论 著 Ξ 克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内 、外刺激肺上皮细胞分泌 IL28 的研究 ΞΞ 周敏燕 ,王国兴 ,冯 云 ,黄 宁 ,王伯瑶 ,吴 琦 ()四川大学华西医学中心感染免疫研究室 ,成都 610041 ( ) 摘 要 目的 :通过比较肺炎克雷伯杆菌 Klebsiella p neumo niae , Kp分泌因子及菌体成分对经过 digito nin 处理和未处理的肺 上皮细胞株 IL28 分泌的影响 ,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制 。 :实验分为两组 ,一组使用能使细胞膜通透性增加的温和去污剂 digito nin 处理 ,而另一组不处理 。分别用 Kp03183 的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激 ( ) 肺上皮细胞株 A549 ,酶联免疫吸附实验 EL ISA检测细胞 IL28 表达水平 。并用 R T2PCR 的方法检测肺上皮细胞胞内模式识别受 (体 NOD1 的表达 。结果 : Kp 培养上清对未经 digito nin 处理的细胞 IL28 分泌无明显增强作用 ,与对照相比差异无显著意义 p > 0 . ) ( ) 05,菌体成分能刺激 IL28 分泌增加 P < 0 . 01,但增高不超过一倍 。经 digito nin 处理使细胞膜通透性增加后 , Kp 培养上清及菌体 成分刺激细胞 IL28 的作用都增强 ,菌体成分刺激 IL28 效果更为显著 ,为对照的 3 倍 ,而培养上清作用相对较弱 。R T2PCR 检测结果 表明 ,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体 NOD1 。结论 :菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物 ,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细 胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节 。肺上皮细胞表达胞内模式识别受体 NOD1 ,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌 菌体成分 ,值得进一步的研究 。 关键词 肺炎克雷伯杆菌 ;人肺上皮细胞 ;白细胞介素28 ( ) 克雷伯杆菌 Klebsiella p neumo niae , Kp 是目前较为常见的 1 . 2 肺炎克雷伯杆菌菌体成分的制备 Kp03183 接种于 TSB 1 医院内机会致病菌。近年来由于抗生素 ,特别是广谱抗生素 培养基 ,37 ?振荡培养过夜 ,离心收集细菌 , PBS 洗涤细菌三次 ,的广泛应用 ,使细菌耐药性问愈加突出 。治疗克雷伯引起的 每次均用 5000g 、4 ?离心 5min 沉淀细菌 ,最后活菌重悬于适量 肺部感染也更困难 。克雷伯杆菌引起的肺部感染 ,临床表现为 的 PBS ,调节细菌浓度 ,使得紫外分光光度计测定 600nmOD 为 快速进展的多囊性肺脓肿 , 发病率和致死率都相当高 。因此 , 1 . 0 。取 50ml 菌液在冰浴下进行超声处理 ,每次超声 1 分钟 ,共 5 次 。超声后的菌液用 0 . 22um 的滤器滤过除菌 , - 80 ?保存待 深入研究克雷伯杆菌的致病机制 ,包括细菌与宿主上皮细胞的 相互作用 ,肺组织炎症反应的分子机理 , 宿主对细菌的防御机 实验用 。 ) (制 ,将有助于从免疫生物学的角度探讨该病新的防治措施 。 1 . 3 肺上皮细胞培养 肺上皮细胞株 A549 本实验室保存用 ( ) μ白细胞介素28 Interleukin28 , IL28又称中性粒细胞活化蛋 含 10 %新 生 小 牛 血 清 、100U/ ml 青 霉 素 、100g/ ml 链 霉 素 的 4 ( ) 白 1 ,属于 13 种人 CXC 趋化因子家族成员之一 。IL28 不仅是 DM EM GIBCO,37 ?,5 %CO常规传代培养 ,并以 8 ×10/ 孔 2 5重要的炎症趋化因子 ,也是重要的免疫及炎症反应调节因子并 ( 接种于 48 孔板 ,待细胞生长到基本完全融合时 大约 1 . 5 ×102 与血管生成 、肿瘤发生及转移等相关。有研究表明 , IL28 可 ) 个细胞/ 孔进行实验 。 促进呼吸道上皮细胞防御素 HBD22 的表达 3B 。IL28 的分泌 1 . 4 细菌培养上清及菌体成分在细胞内及细胞外刺激肺上皮 是机体炎症防御反应开始启动的标志 。作为条件致病菌的肺 细胞 细胞通透性增 加 缓 冲 液 为 50mM HEP ES ,p H7 , 100mM 炎克雷伯杆菌 ,在感染肺部的致病过程中 , 往往产生严重的炎 KCl ,3mM MgCl,0 . 1mM D T T ,85mM sucrose ,0 . 2 % BSA ,1mM 2 ( ) A TP and 0 . 1mM GTP 以及 digito nin 10ug/ ml, 非 digito nin 处 症反应 。肺炎克雷伯杆菌是否首先通过刺激肺上皮细胞而触 理细胞实验组中使用的缓冲液与之相同 ,但不含 digito nin 。细 发炎症 ,肺炎克雷伯杆菌主要的炎症活性成分是什么 , 另外上 菌培养上清及超声处理的菌体成分用上述缓冲液稀释 ,使其终 皮细胞炎症反应的识别受体及信号传递途径 ,这些问题目前还 ( ) ( ) 浓度为 20 % V/ V,以大豆培养基 TSB作为阴性对照 。将配 知之甚少 。本研究旨在对这些问题作初步的探讨 。 好的细菌培养上清或菌体成分加入培养有 A549 细胞的 48 孔 板 ,每孔 500ul ,每个样品作三复孔 ,37 ?,孵育 30 分钟 ,然后将 1 和方法 μ孔内液体吸去 ,用 PBS 洗细胞一次 ,再加入 300l 含 5 %小牛血 清的 DM EM 培养基继续培养 24 h 后收集细胞上清 , 用 EL ISA 肺炎克雷伯杆菌临床 1 . 1 肺炎克雷伯杆菌培养上清的制备 测定 IL28 浓度 。 () 分离株编号 03183 以下简写为 Kp03183由四川抗生素研 1 . 5 EL ISA 检测 IL28 表达量及统计学处理 人 IL28 EL ISA ( ) 究所惠 赠 , 接 种 于 TSB 培 养 基 Sigma , 37 ?振 荡 培 养 72 h , 试剂盒为美国 R &D systems 公司产品 ,严格按说明操作 ,B IO210000g 、4 ?离心 30min ,收取上清 ,用分子截留量 1000 道尔顿 RAD550 型酶标仪 490nm 测定样品 OD 值 , IL28 浓度检测上限( ) 的 YM1 超滤膜 Millipore超 滤 浓 缩 约 5 倍 , 浓 缩 上 清 液 用 0 . μ 2m 滤器滤过除菌 , - 80 ?保存待实验用 。 为 2000p g/ ml 。实验数据以 SPSS 进行统计学处理 , 数值以 ?s 表示 ,采用 t 检验 。 1 . 6 R T2PCR 检测肺上皮细胞 NOD1 的表达 根据 GenBank () 中 NOD1 基因 cDNA 序列 登录为 NM2006092引物一对 , 上 游 引 物 : T GC T TCA GCC GCC TCAC T GT TC TCA , 下 游 引 物 : T GCCAAAC TC TC T GCCAC T TCA TC G。上 下 游 引 物 在 基 因 组 上间隔 13600bp , PCR 预 期 产 物 长 度 为 491bp 。用 Trizol 试 剂 ( ) Invit rogen提取肺上皮细胞株 A549 细胞总 RNA ,利用 Super2 ( ) scrip t I I 反转录酶 Invit rogen合成 cDNA 第一条链 ,以此为模板 图 3 R T2PCR 法扩增的 NOD1 cDNA 片段 进行 PCR 扩增 。PCR 条件是 94 ?预变性 3min ; 94 ?变性 35s , 3 讨论 52 ?退火 35s ,72 ?延伸 2min ,重复 30 个循环 ;72 ?延伸 10min , 取 10ul PCR 产物电泳 , EB 染色 ,数码凝胶成像系统拍照 。Kp 是人上呼吸道的常居菌 ,在正常人并不致病 ,说明正常 人对 Kp 有防御的能力 。上皮细胞是机体防御微生物入侵的第 2 结果 一道防线 。已 有 研 究 证 明 , 呼 吸 菌 上 皮 细 胞 能 够 清 除 入 侵 的 4 2 . 1 克雷伯杆菌培养上清刺激肺上皮细胞分泌 IL28 的情况 Kp 。Kp 感染常发生在免疫缺陷和抵抗力下降的人 ,提示机在未加入 digito nin 的 实 验 中 , Kp03183 株 培 养 上 清 对 A549 细 体自身防御机制低下是发病的重要原因 。对于 Kp 致病的分子 胞 IL28 分泌没有明显的刺激作用 , EL ISA 检测 IL28 分泌水平 机理 ,以及机体对细菌的免疫和炎症反应机理 , 目前的认识仍 细菌培 养 上 清 实 验 组 为 1094 . 8 ?66 . 5p g/ ml , 而 TSB 照 为 组 相当有限 。 ( ) 1029 . 7 ?60 . 9p g/ ml ,统计学处理没有显著差异 P > 0 . 05。在 最近 Kp 致病机制的研究多集中在细菌的侵袭力 ,实验观 加入 digito nin 使细胞通透性增加的实验中 , Kp03183 株培养上 察到 Kp 粘附并侵入呼吸道上皮细胞 ,因此细菌侵入细胞的机 清刺激 A549 细 胞 IL28 分 泌 的 作 用 增 加 , 实 验 组 为 1316 . 6 ?理及其病理生理学意义成为致病机制研究的重要内容 。然而 ( ) 80 . 3p g/ ml ,对照为 941 . 9 ?58 . 8p g/ ml P < 0 . 05, 但增加的幅 研究 Kp 感染的发病机制 ,不仅要探讨细菌对宿主的侵袭 ,机体 度不到 1 倍 。结果见图 1 。 对细菌产生的免疫和炎症反应也是重要的研究内容 ,从现有的 资料看 ,这方面的工作还有待开展 。 上世纪 90 年代中期 , Toll 样受体被发现 ,这是天然免疫识 别最为显著的进展 , Toll 样受体主要表达于细胞膜 ,通过感知微 生物保守的成分 ,它介导宿主天然免疫及炎症反应 , 并进一步 5 ( 诱导获得性免疫。Toll 样受体研究主要集中在免疫细胞 单 ) 核细胞 、树突细胞,上皮细胞 Toll 样受体的生物学意义还有待 更多的研究 。最近几年 ,在上皮细胞的胞内又发现一类模式识 图 1 克雷伯杆菌培养上清胞内外刺激细胞分泌 IL28 ,既 NOD 分子 , 识别细菌肽聚糖结构 , 能够介导上皮细 别受体 2 . 2 克雷伯杆菌菌体成分刺激肺上皮细胞分泌 IL28 的情况 在6 胞天然免疫及炎症反应。Kp 刺激上皮细胞的炎症反应 ,主要未加入 digito nin 的实验中 ,肺炎克雷伯杆菌菌体成虽然能够 刺是由 Toll 样受体介导 ,还是 NOD 分子介导 ,目前还不清楚 。 ( 激 A549 细胞分泌 IL28 增加 实验组为 1302 . 7 ?69 . 8p g/ ml , 对照本实验初步观察了 Kp 分泌因子及细菌菌体成分刺激肺上 ) 为 804 . 9 ?80 . 5p g/ ml , P < 0 . 01,但增加的幅度不到 1 倍 。 在用 皮细胞炎 症 反 应 的 可 能 性 。digito nin 是 一 种 作 用 温 和 的 去 污 digito nin 使细胞通透性增加的实验中 ,菌体成分刺激 A549 细胞 剂 ,在适当的浓度下 , digito nin 使细胞膜通透性增加 ,但并不杀 (IL28 分泌的活性显著增加 实验组为 2183 . 5 ?92 . 8p g/ ml , 对照为 死细胞 ,因此采用 digito nin 处理以增加膜通透性 ,成为研究某些 ) 774 . 6 ?77 . 2p g/ ml , P < 0 . 01,实验组为对照组的 3 倍 。 结果见( ) 物资在细胞内外 或细胞器内外转运的一种常用手段 。最近图 2 。 Girardin 采用 digito nin 处理 293 细胞 ,证实肠道致病菌的超声破 7 碎成分能够激活 293 细胞内的 NOD1 分子。我们的试验观 察到在不使用 digito nin 的条件下 ,无论 Kp 的培养上清或菌体 成分对 A549 细 胞 IL28 分 泌 的 刺 激 作 用 都 很 弱 , 然 而 在 digi2 to nin 增加膜通透性后 ,它们的刺激活性都得到增强 ,提示 Kp 诱 ( ) 导呼吸道上皮细胞的炎症反应主要不是细菌 或产物与细胞 膜受体分子 的 相 互 作 用 , 而 更 加 依 赖 于 细 菌 对 上 皮 细 胞 的 侵 袭 ,也即需要细菌进入到细胞内激活胞内受体 。细胞内微生物 图 2 克雷伯杆菌菌体成分胞内外刺激肺上皮细胞分泌 IL28 ( ) NOD 家族分子 包括多个分子, 其 识别受体目前主要发现了 2 . 3 肺 上 皮 细 胞 表 达 胞 内 模 式 识 别 受 体 NOD1 A549 中 NOD1 识别革兰氏阴性细菌肽聚糖结构 ,因此我们检测证实 的 RNA 经 R T2PCR 扩增 , PCR 产物凝胶电泳显示 490bp 左右的了 NOD1 在 A549 细胞的表达 ,但是 Kp 是否就是通过 NOD1 刺 ( 特 异条带 ,表明肺上皮细胞表达胞内模式识别受体 NOD1 结果激炎症 ,或者还有其他分子的参与 ,需要进一步的实验 。另外本 见 实验观察到 Kp 菌体成分刺激 A549 细胞 IL28 表达的作用明显 ) 图 3。 facto r2kB t hro ugh TRA F62dependent pat hway. J Biol Chem. 2005 ; 280 强于细菌的培养上清 ,提示 Kp 的致炎成分主要不是来自细菌 ( ) 8:7010,21 的分泌或代谢产物 ,而是直接来自细菌的菌体 。 观察上皮细胞3 To mita T , Nagase T Defensins as a mechanism of ho st defense and in2 对侵入胞内的肺炎克雷伯杆菌炎症反应 ,探 ( ) nate immunit y Nippo n Ro nen Igakkai Zasshi . 2001 ;38 4:440,3讨炎症反应信号传递和分子机制不仅具有学术理论意义 ,对细 4 Co rtes G , Alvarez D , Saus C , et al . Role of lung epit helial cells in de2 菌感染性疾病的治疗也可能会产生实际指导意义 。最近有研 fense against Klebsiella p neumo niae p neumo nia . Infect Immun . 2002 ; 70 究发现肠上 皮 细 胞 NOD 信 号 介 导 了 上 皮 细 胞 直 接 的 抗 菌 活 ( ) 3:1075 性 ,沿着这条思路 ,有可能发展呼吸道感染新的防治措施 。 5 Akira S , Takeda K , Kaisho T. Toll2like recepto rs : critical p roteins ( ) linking innate and acquired immunit y. Nat Immunol . 2001 ;2 8:675,80 参考文献 6 No hara N , Nunez G. NODs : int racellular p roteins involved in inflam2 1 Po dschun R , Ullmann U . Klebsiella spp . as no soco mial pat hogens : epi2 ( ) matio n and apopto sis. Nat Rev Immunol . 2003 ;3 5:371,82demiology , taxo no my , t yping met ho ds , and pat hogenicit y facto rs. Clin Mi2 7 Girardin SE , et al . No dl detect s a unique muropeptide f ro m gram2nega2 ( ) cro biol Rev. 1998 ;11 4:589,603 ( ) tive bacterial peptidoglycan . Science . 2003 ; 300 5625:1584,72 Manna S K , Ramesh GT. Interleukin28 induces nuclear t ranscriptio n Klebsiella pneumon iae secretory factors and son icated bacterial extract induc ing human l ung epithel ial cell s IL - 8 secret ion intracell ularly and extracell ularly Zhou Mingyan , Wang Guo xing , Wu qi ( )School of basic and foresic medicine , Sichuan U niversity , Chengdu 610041 ABSTRACT Objective : To investigate t he mechanisms of inflammatio n signal t ransductio n induced by Klebsiella p neumo niae in hu2 man lung pit helial cells by co mparing t he IL28 exp ressio n level bet ween digito nin2t reated and unt reated A549 cells stimulated by secretory factors and t he so nicated bacterial ext ract of Klebsiella p neumo niae. Methods : Human lung epit helial cell line A549 t reated wit h or wit hout digito nin were stimulated by bacterial supernatant and so nicated bacterial ext ract f ro m Klebsiella p neumo niae respectively. The exp ressio n level of IL28 was detected using EL ISA. The int racellular pat tern recognitio n recep tor NOD1 is detected in human lung epit helial cells by R T2PCR. Results : Bacterial supernatant showed no significantly effect o n t he IL28 exp ressio n level in A549 cells wit hout t he additio n of digito nin , whereas t here was a slightly increase in t he exp ressio n of IL28 in digito nin2t reated cells. So nicated bacterial ext ract caused a mod2 est , less t han 1 fold , increase in IL28 secretio n by digito nin2unt reated A549 cells. In t he digito nn2permeabilized A549 cells , So nicated bac2 terial ext ract st ro ngly induced t he exp ressio n of IL28 , a 3 fold increase over t he co nt rol . Finally , t he exp ressio n of nod1 mRNA in human lung epit helial cells is p roved by R T2PCR. Conclusion : So nicated bacterial ext ract f ro m Klebsiella p neumo niae is a more effective inflamma2 tio n stimulator to lung epit helial cells t han bacteria secretory factors. The ent ry of t he bacteria into t he cells may be necessary for Klebsiella p neumo niae to induce effectively inflammatory respo nse in vivo in t he lung epit helial cells. Key words Klebsiella p neumo niae ; Human lung epit helial cell ; Interleukin28 Ξ+ 穿孔膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞 K 电流技术初探 蔡 芳 ,曾晓荣 ,杨 艳 ,刘智飞 ,李妙龄 ,周 文 ,裴 杰 () 泸州医学院心肌电生理学研究室 ,泸州 646000 摘 要 常规全细胞膜片钳模式形成的同时 ,细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失 ,此现象对小细胞的影响更为明 显 。穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性 ,它使细胞内环境保持稳定 ,利于研究胞内信息传导机制 ,并可改善常规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏 ,有望提高实验的成功率 。本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上 + 记录的全细胞 K电流和由大电导钙激活钾通道 B KCa 所介导的自发瞬时外向电流 IS TOCs 。 关键词 穿孔膜片钳技术 ;常规全细胞膜片钳技术 ;B KCa 通道 ;自发瞬时外向电流 ;两性霉素2B