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=幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析

2017-11-30 42页 doc 72KB 35阅读

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=幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析=幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 =幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 江苏大学 硕士学位论文 幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 姓名:唐炜 申请学位级别:硕士 专业:内科学 指导教师:张尤历 20090606江苏大学硕士学位论文 摘 要 自从年和由人胃黏膜分离出幽门螺杆菌 , 后, 感染与慢性胃炎 , 、胃溃疡 和胃癌 、十二指肠溃疡 等疾病的关系逐步被人们所认识。国际癌症机构已将 列为级致癌因子。丫.谷氨酰转肽酶丫.,是 一种催化肽基转移作用的酶,这种酶广泛存在于原核和...
=幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析
=幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 =幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 江苏大学 硕士学位论文 幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆和分析 姓名:唐炜 申请学位级别:硕士 专业:内科学 指导教师:张尤历 20090606江苏大学硕士学位论文 摘 要 自从年和由人胃黏膜分离出幽门螺杆菌 , 后, 感染与慢性胃炎 , 、胃溃疡 和胃癌 、十二指肠溃疡 等疾病的关系逐步被人们所认识。国际癌症机构已将 列为级致癌因子。丫.谷氨酰转肽酶丫.,是 一种催化肽基转移作用的酶,这种酶广泛存在于原核和真核细胞中,在动物 体内主要存在于肾、肝、胰等脏器,在谷胱昔肽的新陈代谢中起到了重要的 作用。研究发现 分泌的通过抑制细胞的增殖,从而 抑制了细胞对月的清除作用,可见对 的定 植有一定的作用。参与诱导 介导的程序性细胞死亡,可能是 一个好的抗肿瘤因子。但程序性细胞死亡的持续发生,破坏了新细胞生成和 细胞消亡之间的平衡产生病理作用,凋亡调节基因的转变和突变频繁的发 生, 反而增加了胃癌发生的危险性。有关 的生物学机制研究尚未 见报道。 本研究从人胃粘膜组织中分离出 菌株,经固体培养后提取全基 因组,采用技术分别扩增出了来源于胃炎/莎、胃溃疡例、 十二指肠溃疡例和胃癌例等 菌株的全长片段,进行了 克隆和序列测定,并与标准株登录号: 和 登录号: 进行比对,了解菌株问的差异。构建该基因的 原核达载体,并进行表达,并构建真核的融合表达载体,在人胃癌上皮细 胞.中进行表达和蛋白定位,为进一步研究的生物机制和 与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系提供依据。 结果表明种病源的 全长序列大小均为 ,编码江苏大学硕士学位论文 ,等电点是.,在端具有信号肽, 个氨基酸,理论分子质量足 剪切位点位于第和个氨基酸处,含有蛋白激酶结合结构域和 一谷氨酰转肽酶保守结构域。与 标准株和株比较分析 显示,氨基酸同源性均高达%以上。其中突变均发生在非功能结构区域, 不同疾病来源的.菌株中的结构区和功能区均没有变化,该基 因所编码的蛋白质具有很高的保守性。成功构建了原核表达载体 ,成功表达了基因。并构建了?重组质 粒,在人胃癌上皮细胞.中成功表达,其蛋白产物卡要定位于 细胞质中。 关键词:幽门螺杆菌,,克隆,序列分析,信号肽,细胞表达,定位, 细胞凋亡。江苏大学硕士学位论文. , ,?.. , , ? , . ,,, .,.一 , .. ?.. ,. ., ? ., . , 一 ...江苏大学硕士学位论文 , . ,.. /. ,. .. 一 . .. . .. ?, ? . .. 一 . : ,;, , , ,, 江苏大学硕士学位论文 缩写与符号 . 幽门螺杆菌 .谷氨酰转肽酶 细胞毒素相关基因 空泡毒素 血型抗原 结合黏附蛋白基因 促细胞因子诱导基冈 聚合酶链式反应 一 人胃癌上皮细胞株 胎牛血清 磷酸盐缓冲液 异丙基硫代...半乳糖苷 一溴..氯.吲哚...半乳糖苷 琼脂糖 氨卞青霉素 溴化乙锭 聚丙烯酰胺凝胶电泳 二硫苏糖醇 过硫酸铵 ,,’一四甲基乙二胺 乙二胺乙酸独创性声 明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导 下独立完成的,除文中注明引用的内容外,本论文不包含任何 其他个人或集体的研究成果。对本论文做出重要贡献的个人和 集体,均在文中作了声明并表示谢意。 日期: 作者签名:学位论文版权授予书 本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机 构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权江 苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口,在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密。 导师签名: 学位论文作者签名: 签字日期: 签字日期:江苏大学硕士学位论文 第一章 绪论 . 幽门螺杆菌简介及研究现状 .. 幽门螺杆菌的发现及生物学性状 首次从 年,澳大利亚学者罗宾?沃伦 和巴里?马歇尔 一个慢性活动性胃炎患者胃粘膜活检标本中分离到了幽门螺杆菌 , ‘?。 无芽胞、荚膜、菌毛,在菌体一端有~根鞭毛,因而可以使细 菌方便地穿过胃粘膜而定居在胃上皮细胞。鞭毛是定居胃粘膜并致病的 一个重要因素,也是刺激机体产生无效免疫反应的重要原因。它由基体、钩 状结 构和鞭毛纤维三部分组成,鞭毛纤维的中心是一个由鞭毛蛋白所组成的多聚 体。 能产生大量尿素酶,分解尿素在菌体周围形成一股碱性的“氨云”,可以 抵抗胃中的酸性环境,免受胃酸杀死【】。 是一种革兰氏阴性杆菌,常作形或弧形弯曲。电镜下呈单极多鞭 毛,末端钝圆,菌体螺旋弯曲【图.。细菌长..肛,宽.~.“【。 系微需氧菌,环境氧要求%~%,在大气或绝对厌氧环境下不能生长 【。许多固体培养基可作 分离培养的基础培养基,布氏琼脂使用较多, 但需加适量全血或胎牛血清作为补充物方能生长。常以万古霉素、、两性霉 素等组成抑茵剂防止杂菌生长【。 抵抗力不强,但对酸性环境有特殊 的耐受性,对抗生素易产生耐药性。当延长培养时间或体内抗生素作用时, 可发生球形体样变化。 对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多 数经典生化实验不起反应。而氧化酶、触酶、尿素酶、碱性磷酸酶、一谷氨 酰转肽 酶、亮氨酸肽酶这七种酶反应是作为 生化鉴定的依据。 的全基因序列已经测出,其中尿素酶基因编码的尿素酶约含菌体蛋 白的%,能够催化尿素水解形成氨云保护细菌在高酸环境下生存【。此外,尚 有和基因,分别编码空泡毒素和细胞毒素相关蛋白。空泡毒素能使 胃上皮细胞空泡变性、黏膜损伤;而细胞毒素相关蛋白能够通过 的型 分泌系统注入到宿主细胞内,激活细胞内一系列信号转导通路。此外尚有 基、 .印扎 发艇』:,起一篮作. ?囊 ??自撕自 一 蚓 幽 蝶剌阐镜《片 : . 幽门螺杆菌传播及流行病学 然,人『感染率微而,个抖人群感染率?边 人址儿的唯 %以叫?。 盎拨触。儿发病牢各 的,二蜓传播途径足人’人的九接或 个翻家小,甚争川 ?家旧各个地区也:州同。前已知发病率的高低与社会 经济水平,人?密集程度,公兆生条什以及水源供应有前较密切的关系。慢性 胃炎忠揣的删料?世活榆标本巾 榆牢可达%~%,而消化】溃疡 忠并史尚,可达%以。,甚节垃近%?。胃癌?‘局部波细胞已发生 异化,眦榆?率高低报道小 。存弧洲地?,叶囡、乔港、越白、叫度等田少 年人群 的感染率分刖为%、%、%、%。?然人群初 小的新札消”抗口毗,?水、?乩接近成人水’.”能足从群体捩 得被动免疫抗体之敞。新:/后抗体迅述降,住找刚及大多数发胜闷家 中,?盹率降至%~%,义迅述【四。人约订岁以后?逊述川 达到或接近成人吼悱检?率水’ 我:及人多数发展,叫家人群 ?』盛染幽地区有』衍:川,低节%, 高然%,人群?总感染半岛发达?家。这此基小资料兑州了儿个问题: 、』盛染 庄都会导致跌病的发生。这『能还蕴减杵,撤牺 的人群不 仃关的』‘他凼素,特别是遗传冈豢宿易感性和茼株的,弘刖:异等;、人群 巾的感染率与胃艏的发生牢,发胜吲家商发达?家。这又与社会经 济、生状兑有关。特别是现已证明胃痛高发区除了与酸地区人群 感 染率高有关外,还与人群中的早发感染有关:、人类感染江苏大学硕士学位论 文 后,若不进行治疗,几乎终身处于持续感染中。因此感染率总的讲来随着年龄 增 长而增长】。 .. 幽门螺杆菌相关致病因子 是造成上消化道疾病的主要囚素,而 能分泌许多毒力因 子,这些毒力因子在病变过程中起的作用不尽相同。研究发现,、、 西方株、、尿素酶基因、、、、与溃疡的发病相关,西 方株和与胃炎的发病相关, 、和与胃癌的发病相关。这 些结果将有助于临床诊断与治疗。 全世界约有%的人患有幽门螺杆菌相关疾病【】。年世界卫生组织 确认 并将其列为类致癌因子【酬。 与胃癌发生密切相关, .已成为一个胃相关疾病的研究热点【】。该茵的致病因子分为定植因子和 毒力因子,毒力因子决定感染后导致炎症、溃疡及胃癌等临床转归的发生, 毒力 因子的遗传多样性是 感染后表现不同临床结局的重要因素之一。 是 最重要的毒力因子之一。研究发现具有更多羧基末端谷氨 酸一脯氨酸一异亮氨酸.酪氨酸.丙氨酸基序的蛋白能诱导更多的酪氨 酸磷酸化和.的分泌,具有更强的生物活性而导致更强的细胞毒性【】。 定植于胃上皮表面,通过特有的型分泌系统将蛋白注入宿主细 胞【, 蛋白发生酪氨酸磷酸化,磷酸化的蛋白与.结合后, 激活后者的磷酸化酶活性,从而引起瀑布式的级联反应,强烈干扰细胞的信 息转 导通路所致。通过各种机制引起病理性细胞应答,如细胞的过度增值,活力、 程 序性细胞凋亡和形态学的改变。在感染的胃粘膜上 产生了活性氧族 。尽管产物的主要束源可能是宿主中性白细胞,本身也能引起 胃上皮细胞产生。胃上皮细胞的过度产生能够引起的破坏,有 可能引起胃癌【。磷酸化的影响/、、和等多条细 胞信息传递通路,引起细胞有丝分裂活跃,细胞增殖加快、细胞骨架重排、基 挚 结构形成,使胃上皮细胞发生形态改变【。这些细胞调控蛋白的变化在 的致病过程中起着关键作用。 在西方国家,与严重的胃十二指肠疾病有关【】,菌株感染在胃内 江苏大学硕士学位论文 定植的数量远多于‖厂的菌株。携带的菌株较一的菌株产生明显的 急性和慢性炎症。菌株造成的胃粘膜炎症反应加强和炎症前细胞介质产生过 多相关,这些细胞介质包括一、一、一和肿瘤坏死因子?‘,诱导促 炎症反应。 的基因型有地区分和的差异,与不同的疾病也有一定的相关性。不 仅可以作用于空泡酶,还可作用于..酶,抑制该酶的活性造成细 胞水肿。研究发现,还能利用细胞表面受体与细胞结合。蛋白进入细 胞后,影响细胞骨架相关基因的表达使细胞骨架结构中断,直接诱导肿瘤启 动子 相关基因,抑制肿瘤抑制基因的表达,凶而有利于肿瘤发展。研究认为 脱 落的的外膜囊泡可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡,同时还发现 一表现型的外膜囊泡也能诱导细胞凋亡【。还可以通过多种机制抑制细胞 功能,具有免疫抑制剂的效应,通过干扰细胞受体信号传导通路限制.的 分泌,这个过程必须在一定的钙调神经磷酸酶的水平下才可以进行【,进而逃 避 宿主的免疫应答。 有和两种等位基因。基因是在 与胃粘膜接 触并成功生成下来后才诱导产生的,通过甲基化水平的改变来调控相关毒 素基因的表达,从而间接参与的致病作用。不同国家的学者的 和检出率及其与消化系统疾病的关系也不尽相同。 为 外膜蛋白的一种。基因有功能性和非功能性两种功能 致病因子,特别在感染的炎症过程 状态【’。蛋白是一种较强的 中起着重要的作用,主要存在于毒力强的菌株中。研究显示, 感染后黏 膜.水平明显升高【】,提示一在 相关性炎症和疾病中发挥着重 要作用,蛋白通过调节一的表达而起作用。 国内有研究发现在胃溃疡患者中的检出率显著高于胃炎患者。但是, 的研究却报道并非溃疡和癌症的标志【。总之,与临床疾病类 型之间的关系,各家研究报道的结果并不十分一致,尚且存在许多的不确定 性。 尿素酶基因可以直接引起胃粘膜损伤,可以通过免疫反应和炎症反应引起损 伤,同时,】等发现当胃粘膜上皮细胞受到纯化尿素酶刺激时,上皮细 胞同样产生.、.的细胞因子。说明胃上皮细胞在 感染时的局 江苏大学硕士学位论文 部炎性反应中也起着一定作用。 ..幽门螺杆菌导致胃炎及消化性溃疡的发病机制 幽门螺杆菌的致病与众多因素相关: 、茵体动力和粘附作用:是 能穿越黏液层并定植于胃窦上皮部的 重要因素。 、抗酸能力和免疫保护: 能够抵抗胃内低酸度,使菌体能在酸性环 境中生存,并抗中性粒细胞的清除作用,起作用的有:尿素酶、热休克蛋白、 胃 酸分泌抑制蛋白、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶等。 、损害胃粘膜屏障:通过细胞毒素、尿素酶、粘液酶等起作用。大约有% 麒菌株可以产生和。能干扰胃粘膜上皮细胞中生长因子 的调节机制,抑制细胞的修复,影响上皮的愈合,以致逐渐出现胃粘膜萎缩,肠 上皮化生和异型增生,最终导致疾病的发生。通过型分泌系统进入胃上 皮细胞,在家族酪氨酸磷酸酶作用下,在靶细胞内蛋白的羧基术端谷 氨酸.脯氨酸。异亮氨酸.酪氨酸.丙氨酸序列重复部位发生酪氨酸磷酸化 ?,而.可进一步激活靶细胞内相关的信号传导通路,引起宿 主细胞的多重改变【。 、炎症反应和免疫反应: 感染后,各种炎症细胞释放的介质相继被 激活和趋化,从固有层移行至上皮内,造成炎症反应。炎症细胞释放的细胞因子、 氧化自由基、水解酶、溶菌酶造成胃粘膜的损伤。慢性 感染造成细 胞和浆细胞浸润,刺激这两种细胞产生特异性抗体,参与体液免疫反应【”。但面 对机体强大的免疫应答,其仍能继续生存并致病,目前这种免疫逃避机理尚不清 楚。 ..幽门螺杆菌导致胃癌发生的相关机制 ...环氧合酶一一 最近,.吸引了肿瘤学家们的注意力。一些流行病学研究显示,长期使 用非甾体类抗炎药可以有效降低消化道肿瘤的发生率,包括结肠癌和胃痛的 发生 率和死亡率【。研究发现.的过度表达会改变细胞的动力学,抑制细胞凋江苏大学硕士学位论文 亡,诱导侵袭性表型,支持肿瘤血管形成,影响细胞黏附到上皮组织。 感 染诱导胃.表达上调,这种感染治愈后.表达下降【】。然而,在肠 化生的黏膜,即使 感染治愈了,.仍过量表达。在 感染清除 后,.对胃癌癌前病变的影响只能部分逆转【。相似的情况也在癌前胃黏膜 中硝基酪氨酸的产物一中发现。在有感染的胃炎病人中,硝基酪氨酸 表达增高,在感染治愈后,其水平会下降。然而,在肠化生的黏膜,在感染治愈 后,硝基酪氨酸仍过度表达,提示和其他活性氮在化生的病变中是高表达的 。 ...错配修复缺陷 微卫星不稳定性 ,分为高频,低频,以及中频。 微卫星不稳定性被认为足肿瘤早期形成的变化之一,可导致基因的不稳定性。微 卫星不稳定性不仅在胃癌中发现,而且在肠化生的病人中也有发现,不管有或者 没有胃癌,微卫星不稳定性是胃癌发生的一个早期事件【。另外,在基因 的启动区域发生的岛的超甲基化与蛋白的减少有关,而且经常发 生在高频微卫星不稳定性的胃癌中,提示基因的后生失活可能经历了微 卫星不稳定性。胃癌中微卫星不稳定性和窦肿瘤、肠型分化有关【。在微卫 星不 稳定性的癌症中,有、、、一、?受体、? 的突变,在他们的编码区中有简单串联蕈复序】。幽门螺杆菌感染和接下去发 生的胃黏膜改变和微卫星不稳定性密切相关【。等报道,在麒感染的 病人, 蛋白、表达减少。感染治愈后,和 在上皮细胞的表达增加,揭示了感染对于微卫星不稳定性的作用至少有一 部分是可逆的。 ...端粒和端粒酶 端粒酶的激活可以阻止细胞分裂过程中端粒的缩短。端粒覆盖了染色体的未 端,在维持染色体的稳定性方面起着重要的作用。在肠化生中存在端粒的缩 短和 端粒酶的激活,有报道说 的感染激活了端粒酶,感染的治愈能够减弱端 粒酶的活性【。所以 感染在端粒酶介导的胃癌中仍是一个重要的环节。 江苏大学硕士学位论文 ... 感染后引起胃黏膜急、慢性炎性反应 感染可引起中性粒细胞氧化爆发和单核.巨噬细胞等炎性细胞的激 活、分泌和释放多种细胞因子,如一、.、.、肿瘤坏死因子。 等【】研究结果表明,.和一的水平在胃癌组织中的含量是『常胃组织的 倍。.在进展期胃癌的水平是早期胃癌的倍。早期癌组织中 阳性 者一的含量显著高于 阴性者,当根除 后一含量明显下 降。提示,不同的细胞因子对癌细胞的不同分裂时期的作用有所差异。 ... 感染引起细胞增生与凋亡平衡失调 『常胃黏膜的结构功能依赖于黏膜上皮细胞增殖和凋亡之间的动态平衡,而 二者失衡会导致病变的产生。由于增殖细胞的基因组具有不稳定性,细胞增 殖加 快的同时,也增加了损伤和产生非整倍体的危险性。若损伤的得不 到及时修复又不能启动凋亡信号系统使该细胞正常死亡,就有可能逐渐由异 型增 生而形成癌肿。研究表明, 感染可使胃黏膜上皮细胞增生活跃,且增生 活跃程度由胃小凹的基底部向顶部依次增蛔】。该变化与胃黏膜氨浓度增加 有 关,氨被认为是一种强烈细胞增殖刺激剂。国外的研究表明, 感染可使上皮细胞增殖超出正常水平倍以上,而在根除 后,其增殖水 平可恢复正常。等【】对 诱导宿主细胞增殖机制的研究显示, 尤其是 菌株,通过丝裂原激活蛋白激酶途径使周期素 激活,导致周期素过度表达,使细胞周期改变而致增殖加速,从而增加了胃 癌的危险性。 ... 感染引起胃癌相关基因变异 国内外许多研究表明,在 感染时可以引起胃癌相关基因的变异。如 参与对细胞增殖调控的原癌基因、在肠化生、异型增生的上皮中均有阳 性表达,提示基因的激活与细胞增长、增殖有关。特别是.基因与胃癌 关系较为密切,其所编码的蛋白质。、具有调节细胞生长和分化的功能, 它的异常表达对细胞恶性表型起着重要作用。?基因在细胞恶性的转化过程 中可出现增殖和表达,在胃癌前病变肠化生、异型增生胃黏膜中,该基因表达 呈 江苏大学硕士学位论文 现持续性高水平,并随病变的进展而呈上升的趋势。提示,其与胃黏膜癌变过 程 的发生和发展密切相关,是胃癌发生的早期基因之一。基因是迄今发现与人 类肿痛相关性最高的抑癌基因,等【垮艮道抑癌基因在细胞增殖调控过 程中起重要作用,其缺失、突变可引起细胞的恶性增殖,导致肿瘤发生,而野 生 型基因很容易转变成突变型基因,它不但丧失了抑制肿瘤生长的作用, 反而具有致癌作用,成为癌基因,故基凶蛋白的变化是胃癌的早期特征。 感染后引起基因突变可能与下列因素有关: 感染后胃黏膜处于 过度增殖状态,合成与分裂活跃,错误复制概率增加;高度增殖时 修复功能下降,且增生活跃时易受各种致痛因子损伤导致染色体基因结构和 功能改变,具备了恶性化的条件, 感染后胃黏膜屏障破坏,使腔内致癌 物更易接近胃上皮细胞,如细胞释放的氧自由基的作用,导致细胞断裂、 易位、清除、死亡,引起胞质胞核转导途径的异常,改变了抑制基因和抑制蛋 白 的活性。 ... 感染引起氧化性损伤 感染的存在导致黏膜炎症的持续性,炎性细胞可以通过产生细胞活 素刺激细胞增殖,增加受外来致突变因素损伤的可能性。炎性细胞还产生 一氧化氮合成硝基化物,并产生自由基,亦有人证实 感染后其产物蛋白 酶和脂酶能降解胃黏膜屏障,导致进入腔内的外源性致癌物质更接近胃黏膜 上皮 细胞,同时 定居于胃黏膜上皮细胞后激活炎性反应,产生一系列细胞因 子如肿瘤坏死因子、.、.等,吸引炎性细胞聚集在感染部位并激活中性粒 细胞产生自由基。这些物质可对造成损伤,从多个途径参与并促进胃癌的 发生。抗坏血酸是胃液中强有力的抗氧化剂, 感染可引起胃液中抗坏血 酸的减少,使机体对氧化性损伤的抵御能力减弱,这也与胃癌的发生相关。 ... 感染导致亚硝酸盐和亚硝基化合物的增加 研究证明,胃内抗坏血酸能阻止胃癌的产生,而且阳性者胃液内抗坏 血酸浓度显著低于 阴性者【。因胃内抗坏血酸能抑制硝酸盐一亚硝酸盐 亚硝基化合物的形成过程,且 感染后一氧化氮增加,一氧化氮与氧作江苏大学硕士学位论文 用产生的氮氧产物具转化亚硝酸盐形成亚硝基化合物能力,故 感染后所 致的低胃酸导致细菌过度生长,产硝酸盐菌可转化硝酸盐为亚硝酸盐。由于 上述 作用,胃内亚硝酸盐及亚硝基化合物的集聚最终诱导癌变的发生。 .幽门螺杆菌一谷氨酰转肽酶研究进展 .. 与 诱导的线粒体介导的细胞凋亡之间 的关系 ...细胞凋亡的定义 从年凋亡的概念被提出,到年代术期凋亡不始成为肿瘤病因学、 病理学研究热点,随着人们对凋亡的认识逐渐深入,对凋亡发生的分子机制 的了 解也越来越透彻,但同时也发现这一过程远非原来想象的那样简单,而是包含了 复杂的调控机制。尽管仍有许多问题迄今尚未阐明,但近几年的研究,在凋亡信 号转导途径、凋亡的生化反应机制以及凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进 展。细胞凋亡是生物体细胞的主动消亡过程,是多细胞有机体调控机体 发育、控制细胞衰老、维持内环境稳定的重要机制。细胞凋亡发生过程的启动和 进行受到精确调控,具有独特而复杂的信号系统。各种凋亡信号通过信号传导通 路传至细胞内,激活靶分子而产生细胞效应,引发细胞凋亡。一般认为,细胞凋 亡存在三条主要通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路,各通路间互相 联系,共同调节细胞凋亡。 ...线粒体介导的细胞凋亡 细胞凋亡的线粒体通路:此通路由含结构域的一家族成员、 、、、等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含结 构域的.家族成员与另外的.家族成员亚家族成员、等, 主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆作用,导致后者的寡聚并插入 线粒 体膜,引起线粒体膜通透性改变,跨膜电位丢失,释放细胞色素和其他 蛋白。的释放是线粒体凋亡路径的主要,在/存在的情况 下,与凋亡蛋白酶活化子 ,形成 多聚复合体,通过氨基端的募集结构域 江苏大学硕士学位论文 ,募集胞质中的。前体,并使其自我剪切活化并启动 级联反应,激活下游的.和.,完成其相应底物的剪切, 引起细胞凋亡。此外,定位于线粒体上的转录因子能与、直接相 互作用,这互作用解除了与.一蛋白家族中的抗凋亡蛋白的 结合,使中的结构域外露,从而处于促凋亡的结构构象【】;此外,这 种相互作用还引起、多聚化,这一系列的变化导致线粒体通透性的改变, 使各种促凋亡因子释放到细胞质中【】。线粒体是细胞能量代谢的中心,细胞凋亡 过程中对线粒体损伤的最直接结果是其工常功能的丧失。线粒体功能障碍除了会 导敛自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载而引起细胞凋亡外, 还能直接诱导细胞凋亡。在这里线粒体的能量储备起决定性的作用,如果损伤程 度相对较轻,保留了提供细胞凋亡所需的能量,则发生细胞凋亡;若损伤严 重,急剧耗竭,则发生细胞坏死。 ... 和 诱导的线粒体介导的细胞凋亡之间的关系 丫.谷氨酰转肽酶“一,是一种催化肽基转移作用的 酶,这种酶被发现广泛存在于动植物体内,在谷光苷肽的新陈代谢中起到了 重要 的作用。 被发现也具有相似的特点。目前大量的哺乳动物细胞的 已经被纯化,它们的性质和功能也被确定。很多细菌的也已经被鉴定 和调查,但是 的成熟过程仍然不十分清楚。在过去的研究中我们发 现 由单个基凶编码,可以被翻译成个多肽,进一步被分别加工 成 和 的多肽。这个结果证实了在原核细胞中很少发生翻译后的成 熟过程。 在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合,将细菌和宿主细胞 直接连接起来【。 在胃癌细胞中诱导线粒体介导的程序性细胞死 亡,主要是细胞色素由线粒体释放进入细胞剧和半胱天冬酶家族成 员的激活【。半胱天冬酶被分为两类,上游区半胱天冬酶,包括.、、 和,下游区半胱天冬酶,包括.、和。所有的半胱天冬酶在细胞内 催化无活性的酶原,在细胞凋亡的过程中必须经历蛋白水解的过程。此外, 细胞 凋亡除了导致细胞核形态学改变以外,还会引起易位和.、. 江苏大学硕士学位论文 表达量的减少【】。在.蛋白家族中,一是一种抗凋亡蛋白,能够通 过在线粒体外膜形成寡聚体和建立细胞色素以及其他凋亡物质释放的通道促 进凋亡。程序性细胞死亡通过破坏新细胞生成和细胞消亡之间的平衡产生病理作 用。程序性细胞死亡持续发生和调节这种死亡的基因发生转变和突变增加胃癌发 生的风险。因此 在致胃癌过程中起到了关键作用。尽管 是一种诱导凋亡的因素,可能是一种好的抗肿瘤因素。但是其诱导的程序性细胞 死亡的信号通路的细胞和分子机制仍需阐明,有关的生物学机制和在体内 的效应还需要进一步研究。 很多体外实验和体内试验初步阐述了在胃上皮细胞中 感染和细胞 凋亡之间的关系。细胞凋亡主要在调节细胞生长、免疫应答的发生以及正常 细胞的清除方面起作用【。但是细胞凋亡也是对抗细菌和病毒的防御机制。 感染促进上皮细胞增生,通过细胞凋亡保持了细胞的稳定性。初步研究 表明 感染引起的细胞凋亡通过/系统,线粒体途径唧】介导的。 线粒体被认为是大部分细胞死亡途径的中枢细胞器?。释放一些促凋亡物质诸如 细胞色素【】。 定植引起胃上皮细胞损伤的确切机制还不太清楚,目前有很多假设 指向氧化应激。氧化应激主要是吞噬细胞在胃上皮下粘膜固有层浸润的结果,这 些吞噬细胞主要包括中性粒细胞和巨噬细胞,这些细胞产生大量的引起宿 主防御反应。细菌在胃粘膜上引起氧化应激反应,线粒体是可能存在的目标之一, 是细胞质中自由基的主要来源,据估计由线粒体消耗的氧通过电子传递链转变为 。。线粒体中主要的是一,增加的‘。对邻近的分子诸如一些蛋 白质、脂类甚至线粒体都有损伤作用。在生理条件下,线粒体有很多酶诸 如锰离子依赖的超氧化物歧化酶,谷胱甘肽过氧化物酶,还有一些非酶系统诸如 ,维生素和,这些物质能够保持。。浓度在非常低的水平【洲。总 之,过氧化物在 感染的细胞中能够能够作用于线粒体启动细胞凋 亡途径。这些变化能够引起线粒体去极化,导致其形态学和功能学的改变。因此, 对于临床上感染 的患者需要给予抗氧化治疗【。江苏大学硕士学位论文 .. 与 长期定植的相关性 和其它的病原体相比, 的感染是终身性的,但是这种终身感染的原 对于 因仍然不清楚。 在小鼠模型胃部的定植非常重要。 免疫细胞的凋亡在 持续感染中起到了重要的作用【。细胞对于 细菌的清除十分重要,但却受到 的抑制。研究发现 分泌的 能够抑制细胞的增贿,是一个新发王兕的 的免疫抑制因素, 通过诱导细胞周期停滞在时相抑制细胞的增殖【】。但是与 细胞作用的机制还不十分清楚。 .大肠杆菌表达载体系统 大肠杆菌表达载体系统是目前应用最广泛的体外蛋白表达系统,首先把目的 基因克隆到不为大肠杆菌聚合酶识别的启动子之下的载体中, 克隆到载体的基因是被关闭的,不会由于产生的蛋白对细胞有毒性向引起质 粒不稳定。而且大肠杆菌属于原核生物,原核细胞表达外源蛋白不存在时序 性, 即转录与表达同时进行,原核细胞不存在于核膜,转录出的直接进入细胞 质中被翻译,甚至转录尚未完成而翻译已经开始。 大肠杆菌在表达过程中容易形成包涵体,包涵体形成的主要原因是重组蛋白 的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的 次级 键等原凶形成的。还有以下一些原因: 、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形 成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫 键 不能正确的配对,过多的蛋白键的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶 解度 熊 寸 、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体,而脯 氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内接近蛋白的等电点时容易形 成包涵体。 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶 类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。 江苏大学硕士学位论文 使包涵体表达就可以从以上一些方面考虑,比如低温诱导或者选择合适的 值等。 . 荧光蛋白示踪的方法 本论文研究定位运用了荧光蛋白示踪的方法,下面介绍一下这种方 法的应用和发展。年等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧 光的绿色荧光蛋 ,。近年来,绿色荧光蛋兰 ,作为新一代的基因转移报告物或定位标记物,在生命科学 研究中越来越受到关注【】。 的来源、生化特性及其发光机理 来源及生化特性:主要来自两种海洋无脊椎动物,硒南太平洋水母 和佐治亚沿海水域的三色堇 。 上述来源的,其原始发光蛋白基团具有将蓝色的化学发光演变为绿色荧 ,由个氨基酸 光的生物发光特性。野生型.的分子量约为 残基组成。成熟的蛋白是高度稳定的,在值为、?的条件下仍保 持荧光,且数小时内不被蛋白酶降解。的发光基团是由、和 等三个氨基酸残基经过环化、脱氢后形成的咪唑环【】。 荧光的发生与环境密切相关,其真下的发光部位为咪唑环上的阴离子酚。多 ,两种 管水母来源的有两个吸收峰: 和 ,但主峰在 波长的任何一种光激发均可使产生 的绿色荧光。发光机理:水母和 三色堇的发光虽然均需要激发,但二者的发光机理略有不同:在水母 中,结合到发光蛋白上使荧光素被氧化而释放出蓝光,而进一步激发发 出绿色荧光。而三色堇的发光是由荧光素酶氧化荧光结合蛋白结合的荧光素 产生 蓝光并激发产生绿色荧光。 的优点 不加任何底物,荧光性质稳定;分子量小,对细胞无毒性;使用方便,可行 活细胞实时定位观察;突变蛋白可显著改善荧光特性 的应用 由于有很多优点,已成为监测体内基因表达及细胞内蛋白定位十 江苏大学硕士学位论文 分重要的报告基因。在各种异源细胞,如细菌、霉菌、线虫、酵母、果蝇、昆虫 细胞、哺乳动物细胞及植物细胞中的表达,作为一种新型的报告物在生物学 界引起了广泛的关注,它已吸引了从生命科学包括细胞生物学、分子生物学、发 育生物学、遗传学及生物技术等到生物医学及农学许多领域研究者的兴趣。 连接目的基因后转染细胞,结合荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞 仪和荧光分光光度计等设备,将成为分子生物学研究的一个十分有用的工具。 综上所述,报告基因的出现,使我们在不干扰活细胞功能的情况下,能 直接观察蛋白分子,结果可靠、操作简单、方便、费用低廉。 .本研究的目的意义和研究内容及实验技术和实验设计 .. 目的 参与 诱导的线粒体介导的程序性细胞死亡,这种程 序性细胞死亡通过破坏新细胞生成和细胞消亡之间的平衡产生病理作用。细 胞凋 亡的持续发生,凋亡调节基因的转变和突变频繁的发生,增加了胃癌发生的 危险 性。 诱导的细胞凋亡在致胃癌过程中可能起到了重要作用。 本课题提取不同疾病来源慢性胃炎例,胃溃疡例,十二指肠溃疡例, 胃癌例的 菌株基因组,进行基因全长序列和成熟肽序列 的克隆和分析,比较不同疾病来源的 基因和蛋白的差异。 基因的原核表达和在一细胞中的表达和定位,研究基因与 线粒体之问的关系,旨在探索 基因与 诱导的线粒体介导的 细胞凋亡之间的作用机制。 ..意义 感染是人类最常见的慢性感染之一,其相关的胃疾病如慢性活动性 胃炎,消化性溃疡,胃癌等均是常见病,严重危害人类健康,当今运用不同分 子 生物学技术的研究结果发现,其基因遗传学变异导致的生理学功能差异与致病的 多样性有关。长期以来, 感染宿主细胞后的致病机制尤其是致胃癌机制 成为国内外众多学者的研究焦点。近年来研究证实 基因与线粒体介 导的细胞凋亡之间存在相关性。是谷氨酰循环中的关键酶,可特异性催化.江苏大学硕士学位论文 谷氨酰基的转移反应。 被发现也具有相似的特点。有报道具 有诱导凋亡的活性。 参与 感染诱导胃上皮细胞的凋亡。 诱导线粒体介导的程序性细胞死亡,这种程序性细胞死亡通过破坏新细 胞生成和细胞消亡之间的平衡产生病理作用。细胞凋亡的持续发生,凋亡调节基 因的转变和突变频繁的发生,增加了胃癌发生的危险性。 诱导的细胞凋 亡在致胃癌过程中可能起到了萤要作用。细胞凋亡一般通过凋亡受体依赖的或者 线粒体依赖的途径发生。前者包括凋亡受体诸如和受体的活化,继 发.活化诱导细胞凋亡。后者通过一蛋白家族的介导,这个家族的蛋 自主要调节线粒体细胞色素的释放。目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡 的 调节中起到了关键的作用。线粒体释放细胞色素是凋亡过程中的关键一步, 细 胞色素与它的受体分子相互作用,结果引起脱氧三磷酸腺苷和三磷酸腺 苷存在时.的聚集、加工和活化。.反过来分开并且激活 .和.,这些半胱天冬酶分开各种不同的蛋白,导致凋亡的生物化 学和形态学特点。实验证实作用时间越长,和一的活性 越大,的活性上调而抗凋亡的.和?的活性下调。凋亡信号出发了 线粒体的改变,引起细胞质中细胞色素的释放。相反的,缺陷的突变体 不能诱导凋亡。这些结果显示 通过线粒体调节的通路诱导细胞凋 亡。 提取不同疾病转归的 菌株基因组,进行基因的全长序列 和成熟肽序列的克隆和分析、 的原核细胞表达以及在人胃癌上皮细胞 一中的表达和定位。这些研究国内外至今尚未有报道。因此,本研究旨在 通过对鲑 基因的生物学功能的研究,为今后消化道疾病的治疗和预防 以及 的清除和根治提供新的理论依据。 ..研究内容 本实验主要研究 基因对细胞生长的影响 基因的克隆和序列分析。根据基因的序列设计引物,从不同疾病 来源分离的 基因组扩增片段,并分别进行克隆和序列测定, 分析其基因结构的差异。江苏大学硕士学位论文 构建原核表达载体一;利用原核表达系统验证基因的表达产 物。 利用绿色荧光蛋白融合基因全长序列和成熟肽序列,克隆进 质粒中,观察基因表达后在人胃癌上皮细胞一中的定位, 观察一细胞形态、生长以及运动性的变化,探索其可能诱导细胞凋亡的 途径。 ..实验技术 培养,,基因克隆,原核表达,细胞培养,细胞转染,细胞定 位。 ..实验设计 根据国内外的文献报道设计了本论文的实验方案,其操作线路如下: 例, 临床.菌株 例, 例, 例 上 全基因组的提取 土 孥萎翼鸭理隆..,盒篓、 ,成熟肽和序列分析? ? 构建原核表达载体 构建质 粒,转染一细胞 一一 上 土 基因原核表达 观察基因在细 胞内的表达和定位 江苏大学硕士学位论文 第二章幽门螺杆菌 一谷氨酰转肽酶基因的克隆及 序列分析 了一谷氨酰转肽酶丫一,是一种催化肽基转移作用的 酶,这种酶广泛存在于原核和真核细胞中【,在动物体内主要存在于肾、肝、 胰 等脏器,在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要的作用【?。 分泌的在 胃癌细胞中诱导线粒体介导的程序性细胞死亡。 因此,本研究根据基因库中公布的 标准株登录号 为:一基因设计引物,扩增出基冈的全长片段,对其进行克隆 及序列分析,以了解在致病过程中的变化情况,为进一步研究的生物 机制提供依据。 . 实验材料 ..质粒、菌株和试剂 幽门螺杆菌 从本院内镜室活检标本距幽门 内分离培养获得,尿 素酶试验阳性,行常规病理检查明确为胃癌。人胃癌上皮细胞.、大肠埃希 菌. 为江苏大学生命科学研究院实验室保存; 基础培养基、微需氧 环境发生袋、选择性抗生素及厌氧培养罐购自德国公司;改良稚氏肉汤培养 基由上海腹泻疾病控制中心提供。无菌羊全血购自金坛欣迪公司;产物纯化 试 剂盒为公司产品;质粒、试验中所用的限制性内切酶和配套的缓冲 液、 标准分子量 、酶、、标准分子量核酸、 核酸、质粒抽提试剂盒为公司产品;购自公司;.、 为公司产品;酵母提取物 、蛋白胨为公司产 品。其他常规试剂为市售分析纯。 ..常用缓冲液 ’ ...碱法质粒抽提液 ? 溶液: ., /,蔗糖 /, 江苏大学硕士学位论文 /, ,贮存于?。 /.高压下蒸气灭菌 . /, %。 溶液: / 溶液 ,用冰乙酸调节至.。 ...核酸电泳缓冲液 × 碱、. . / 冰乙酸、 .。 ... 凝胶加样缓冲液× .%溴酚兰、.%甲苯青、%/蔗糖水溶液。 ...氨苄青霉素 / 氨苄青霉素. 无菌中,. ,溶解于 滤膜过滤除菌,分装 后于.?保存。 ... / 溶解于 , 通过一个 无菌中,将溶液体积调至 . 的等份,于一?保存。 .滤膜过滤除菌。将溶液均分成 ... ? / 将唱溶于二甲基甲酰胺中,配成 /浓度的溶液,. 滤膜过 滤除菌,用可以避光的玻璃瓶或聚丙烯管装,分装后于.?保存。 ... / . ,分装,高压灭菌 ’ 溶解于 ,定容至 ,贮存于?。 ... / ,分装,高压灭菌 无水 中,定容至 .溶解于 ,贮存于?。 江苏大学硕士学位论文 ... / 含有%的甘油 ., 甘油,定容至 无水 溶解于 中,加入 分装,高压灭菌 ,贮存于?。 .../ . /, /,终浓度为 . ,? ,缓慢冷却至室温,分装、贮存于一?。 /,?加热 .. 培养基 ... 相关培养基液的配制 胃粘膜组织转送液:含.%改良布氏肉汤粉、%蔗糖及%小牛血清 后分装。 的溶液 /. 高压下蒸气灭菌 固体培养基:含%基础培养基的溶液,高压灭菌后待冷却至适当 温度,加入无菌羊全血及选择性抗生素,混匀液体并倒入灭菌培养皿,待冷却 凝 固。 菌株保存液:含.%改良布氏肉汤粉、%甘油的溶液高压灭菌后分装。 ...细菌培养基 液体培养基 :酵母提取物 、蛋白胨 ,常温贮存。 /.×高压下蒸气灭菌 、 , 固体培养基: 液体培养基中加.%琼脂粉, /. 高压下蒸气灭菌 ,加相应抗生素,倒平板,?贮存。 ..主要仪器设备 公司 立式冷冻离心机 凝胶图象处理系统 通州市溏通制药机械设备厂 一电热恒温培养箱 上海琪特分析仪器有限公司 空气浴恒温振荡器 江苏省苏州净化设备有限公司 一型桌上式洁净工作台 江苏大学硕士学位论文 普通扩增仪 公司 南京新科技生物技术研究所 电泳仪,电泳槽 末端标记循环测序仪 超声波破碎仪 高速冷冻离心机 核酸仪荧光倒置显微镜 .方法 .. 临床株分离、培养 自转送液中取出胃粘膜标本,以接种环轻轻压住组织在固体培养基上反复涂 抹后,将培养皿置于厌氧培养罐中,在微需氧环境发生袋上加适量的水后迅 速密 。 封厌氧罐,置于?恒温培养箱培养~ .. 保存及处理 以接种环取足量的 菌落于保存液中,置于一?保存;菌量不足 时予传代数次。 ..细菌的提取 / 培养的菌落,用 液重悬细菌,?, 刮取 离心 ; 液重新悬浮细菌,加入 液混匀,冰上静 弃上清, . 置 : ; :入 .冰醋酸,冰上静置 /离心 ; 力入 氯仿混匀,?, 取上清,重复上述步骤; ; 入 的异丙醇,混匀,室温静置 ?, /离心 ;江苏大学硕士学位论文 %乙醇洗涤,?, /离心 : 弃上清,用 弃上清,重复上述步骤; 不盖自然晾干后适量液,?过夜溶解。于.?保存备用。 ..引物设计与合成 根据中已报道的 标准株的全序列,设计 引物: ::; ’?? :: ’。 在上游引物 端加 酶切位点;在下游引物 酶切位点。引 端加 物由上海生工基因有限公司合成。 .. 基因片段的扩增 反应体系如下:. . 酶 . . . . . :.“ ,? ,? ?预变性 ;? ,个循环,最 。 后?延伸 ..连接反应 反应体系如下: . ? . 产物 . . 江苏大学硕士学位论文 . 补至终体积 . 产物的用量视其浓度大小不同而异,调至与载体最佳的比例,载 体和产物的摩尔比一般为::~。 一 混匀反应体系在?反应 ,置于?下过夜以提高其转化效 率。 ..感受态细胞制备 单菌落; 从平板上挑取新活化的. 左右; 液体中,?一 /振荡培养 接种于~ 把该培养好的菌悬液以:的比例接种于 液体培养基中, ?,~ /振荡培养 左右,至其为.左右; 把培养液加入到只大的离心管中,?, ,离心 . / ; 弃上清,加入. ,悬浮菌体,冰上放置~ ; ?, ,离心 . / ; 弃上清,加入. ,悬浮菌体,冰上放置 再次?, ,离心; 弃上清,加入. 预冷的. /,用移液管轻轻吹打以悬浮 细菌沉淀; 分装到. 管,一?冰箱保存待用。 ..质粒转化 从.?冰箱中取出制备好的感受态细胞 ,在冰上融化; : 取 连接反应液至感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴 ,迅速冰浴 从冰中取出管,置于?中热激 ; /振荡培养 左右; 液体培养基,?~ 加 培养好的菌液辅至///.的平板上; ,即可见单菌落出现; 置平板于?中培养~江苏大学硕士学位论文 为了显色反应更为充分,此时可把平板置于?中充分显色色菌落一般 含有目的片段,蓝色菌落则为空载体。 .. .碱裂解法小量抽提质粒 挑单菌落接种于 /的液体中,?, 含 /振荡培养~ ; /, 离心收集 取. 培养液于管中,?, 菌体于管底; 去上清,将细菌沉淀重悬于 预冷的溶液中,振荡悬浮后置于室 温下放置~ ; 入 新配制的溶液,轻轻上下颠倒管~次至溶 ; 液变清,冰上放置 加入 冰预冷的溶液,将管轻轻上下倒置后温和地振 荡 ,置于冰上 ; /,离心 ? ,转移上清到另一新管中; /,离心 /与上清等体积的酚:氯仿:,振荡混匀,?, ,转移上清到另一新的管中; ; 加入上清倍体积的无水乙醇一?预冷混匀,一?放置 ?, /,离心 ,弃上清,加入 /无水乙醇于 ?洗涤沉淀; /,离心 ,弃去上清,置于空气中干燥; ?, 用“含有无酶的胰酶 /的溶解沉淀,振 荡后贮于一?中备用。 ..质粒酶切鉴定 挑出单菌落扩增,用碱裂解法抽提质粒,用 和体 酶切,酶 切产物经%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。按下列成分混匀酶切的反应液: . 质粒 .?.“江苏大学硕士学位论文 协 . 出离子水 “ : 置十?恒温水浴,酶切~ 。%琼脂糖凝胶电泳检测,如果酶切出 的外源片段与目的片段大小一致,即可柬测序。 . 测序 由上海英俊生物技术有限公司完成。对基因序列进行分析同源性分析是采用 在线具:. //蛋白性质分析采 用的是在线:具://.叫/ 和://. 结果与分析. 菌株鉴定 曲落特点:典型者肉日可在固体培养基上见针尖样或水滴样透明萄落。 细菌形态:常规革兰染色,于高倍油镜下呈革兰阴性、海鸥状、形 弯状或短茼图 。 生化反应:尿素酶试验阳性细菌使尿素酶试剂变红;触酶试验阳性细菌使 %产生连续的气池;氧化酶试验刚性细蔺使浸有氧化酶试剂的滤纸变黑。 镜见弯曲形、短状红染的.酗 ?兰染也历镜?态’ 一?垂雷? 闩 『戈的林的州仆严物 永辑刊舯 .标准?/: 扛鼎々 严物靠 缸洱十二指腑渍狮的茼杯的嚣 渍喝々苗杯的州,产物: 辨 池的菌株的州什‘,物 ??”?“”叫。? ”‘岵。。。???『。, ?? ? 豁?“””麓’蚓麓怒跏 享歹 /菌株问的对比分析 编矾个钮’暖,川论分’赝:址 儿‖/?艇,】:州入小均山 ,,州.,怂.,“端.~川。.’切伸,扣靴年?钒一‘、隧处,江苏大学硕士学位 论叉 . 含有蛋白激酶结合结构域和.答氨酰转肽酶保结构域。采用 物软件对不同疾病米源的例菌株氨基酸与公布的 / 标准株和相应氪基酸序列进行序列比对。结果硅不,与标 准株和株比较,氨基酸同源性均高达%以。这些突变均发牛 在非功能结构区域,不同疾病来源的//菌抹中的结构区和功能区均 没有变化,该基因所编码的蛋【『质具有很高的保守性。 童;量筮 盖。型盖盖譬罡进登釜量翌攀鬻:攀匡篓 ” ,.型 【 塑三里兰里型?些 ,旦, .三?土划一旦卫山二。自‘ 塑。 ?: ?一?‘ 』。净 。【。;一。 ? 一 ”?。 .。【 唧?? ,。。 ??惮 . :『 ‘ 卫 ,。,? 一,“堕苎三耻?竺』二卫型 ” ’,?: 。肿 ,。斗? 净:强警ד“ 。‘‘‘ 二一一豫。 ”, ? 川二“?。 二;甲?::疆鬻 图. 株氨鉴酸序列的同源性 江苏大学硕士学位论天 ,为咎钮髋转肽酶保结构域,,为《茼株皤白澈酶结合结构域,,图中方框 析压是信号肤段.是采源干雌性胃是的菌株,是采源于目溃疡的菌株,是来菲 于十 二指肠溃痛的两株,是采源于计癌的菌株。 引.邗分茼株“编码氨臻酸功能结构域 . .本章小结 %的人’:垫染 ,,址干【【?“染色;盹的微.府瓴?,?。界地?内约 有,,』如染魁消化忡溃疡的蛭撕闻之,也足谢搠咀及搠前痫变的主婪 危险『罔崇。址谷氨酰循环。的芙键脯,可特异化一谷鲺酰坫的转移反施。 被发小【王几订棚似:特点。?新人引帆乳动物坌胞的已经 被纯化,乞们的性质耵功能也被确定。很多细菌的也已经被箍定垌调, ?足 如 戊嘏过’仍然小分清楚。 ?前,已扦肘儿旧『、诱导川索做了此研究。报道儿田 甘细胞州】?一活性】『被』泛拨受的脱魁线牲佛捌的酬?。】起到了关键 『线牲 的作川.通过诱甘线牲体介甘的棵序性细胞死.,:要足细胞也索 体释放进入细胞质刺胱夫冬嘶家腹成蚍的激,诱埒的细胞州“也敛痈过’ ,能起到了?明作用。川反的,缺旧的突变体小能诱甘川抛础【、:。这此结 显一参序一陀圳胞死.。 本文验七班足刈刚疾确术洲的刚如“坫川』行兜降,对其所编码的 钺 酸序列进比时分析。:川痰柏木溯的例儿,茼株;司组经 打增?肚?的特祭带,人小为 ,‘颅大小。效将所得 广物,拔休连接,转化到感
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