斐林试剂甲乙两液使用方法探索

斐林试剂甲乙两液使用方法探索 苏宏鑫 （浙江省温州中学生物组  325014） 摘  要  本文通过理论分析和实验验证相结合，比较分析了在鉴定可溶性还原糖实验中斐林试剂甲乙两种试剂的不同使用方法及其效果。结果显示，在鉴定可溶性还原糖的实验步骤中，斐林试剂甲液(2mL)和乙液(4滴)无论是先混合马上使用，还是两液依次加入被鉴定的可溶性还原糖中都能得到相同的实验效果。 1  问的提出 全日制普通高中教科书(必修)《生物》第一册第18页，在鉴定可溶性还原糖的方法步骤中，特别强调“必须将斐林试剂的甲液和乙液混合均匀后使用，切勿分别加入生物组织样液中进行检测”。 笔者在为学生上这一节实验课时，由于对上述步骤难以找到合理的解释，所以就想到在鉴定可溶性还原糖时，斐林试剂的甲液2mL和乙液4滴分别加入，或斐林试剂的甲液(2mL)和乙液(4滴)混合24小时后使用，能否得到同样的效果？带着这两个问题笔者进行了以下探讨。 2  实验探索 2.1  实验仪器和试剂 仪器和试剂与教材中完全相同。 2.2  实验设计 2.2.1  在以下各组实验中，都是苹果样液2mL，斐林试剂甲液2mL、乙液4滴，即使是甲、乙液混合配制的斐林试剂也按照这个比例。 2.2.2  设计四组实验 利用加入2mL刚配制的斐林试剂(甲液2mL与乙液4滴混合均匀)作为对照；另外再做三组实验：①加入24h前配制的斐林试剂(甲液2mL与乙液4滴混合均匀)；②先加入2mL斐林试剂甲摇匀后再滴入4滴斐林试剂乙；③先加入4滴斐林试剂乙摇匀后再加入2mL斐林试剂甲。 2.3  实验的具体方法及步骤 在其他实验方法及步骤不变的前题下，分别在A、B、C、D四支试管中各加入2mL苹果组织样液，然后在A试管中加入2mL刚配制的斐林试剂，在B试管中加入2mL24h前配制的斐林试剂，在C试管中先加入2mL斐林试剂甲摇匀后再滴入4滴斐林试剂乙，在D试管中先加入4滴斐林试剂乙摇匀后再加入2mL斐林试剂甲。 上述四支试管摇匀后一同放入100℃的沸水中加热，并观察四支试管中溶液颜色的变化。 重复上述实验三次。 2.4  实验结果 三次重复实验的结果完全一致，重复性好，结果可靠。具体是：A、C、D三支试管的颜色变化，从颜色的变化速度与程度两方面都完全一样，凭肉眼根本无法区别；颜色变化顺序是：从蓝色→棕色→砖红色，其中棕色不太明显，时间又短；变色的时间为：约20s钟有明显的变色，80s钟砖红色显著。B试管的颜色变化明显缓慢，并且15min时，还是呈黑红混合色。 3  理论依据 3.1 查阅资料 《有机化学》东北师大等(1997年12月版)下册第586页：葡萄糖、果糖和甘露糖三者在稀碱液中能发生酮式-烯醇式的互变异构；氢氧化铜或氧化铜在碱性溶液中能将单糖氧化，同时氢氧化铜或氧化铜被还原成砖红色的氧化亚铜沉淀。《生物化学》王镜岩等(2002年9月第三版)上册第16页：在碱性溶液中，重金属离子(Cu2+、Ag+、Hg2+或Bi3+等)如斐林试剂中的Cu2+是一种弱氧化剂，能使醛(还原剂)的醛基氧化成羧基，产物称醛糖酸，金属离子自身被还原。单糖在碱的催化下，醛糖与酮糖之间能够通过“酮-烯醇”的互变异构。碱性条件会引起糖碳架的断裂和分解。 综合以上文献所述，斐林试剂与单糖混合后只会发生三种化学反应：⑴是Cu2+或氢氧化铜和氧化铜中的铜在碱性条件下与单糖之间发生氧化还原反应；⑵是碱催化醛糖与酮糖之间通过“酮-烯醇”的互变异构；⑶是碱性条件会引起糖的碳架断裂和分解。二书都没有提到单糖与Na+和SO42-会有什么反应。 3.2  理论分析 在2ml苹果样液中单独加2ml斐林试剂甲液，与加2ml斐林试剂(甲乙混合液)相比，苹果样液中的pH值相差甚微，因此对单糖的还原性、裂解和醛酮异构都不会造成差异性影响。因为在斐林试剂甲液(0.1g/mLNaOH溶液)2mL中滴入3～5滴(约0.2mL)乙液(0.05g/mLCuSO4)，通过计算得知NaOH只减少0.005mg左右,溶液中的NaOH浓度仅降低约0.0023g/mL。 另外，在苹果样液中先加入4滴斐林试剂乙液(还没加甲液)时，溶液中的SO42-和Cu2+浓度虽然比另外三种加法会高出一倍，但是SO42-与单糖不发生反应，Cu2+与单糖之间在中性条件下起码不会有除了氧化还原反应以外的其他反应。 斐林试剂甲、乙液混合后时间较长容易产生黑色的氧化铜沉淀，用这种具有大量黑色氧化铜沉淀的斐林试剂加入单糖溶液中，虽然氧化铜在碱性溶液中能将单糖氧化，但速度很慢；而且，如果时间没有足够的长，黑色的氧化铜没有全部被还原成砖红色的氧化亚铜，还会干扰氧化亚铜的显色效果。 3.3  理论分析的结论 综上所述，先单独加入斐林试剂甲液或斐林试剂乙液，马上再加斐林试剂的另一种试剂，这两种方法对单糖的结构不会造成有差异的影响，同时也能为氢氧化铜、氧化铜或Cu2+提供一个合适的碱性环境，因而与斐林试剂甲乙两液先混合再使用具有相同的实验效果。 由于碱性条件会引起糖碳架的断裂和分解，因此利用斐林试剂只能对单糖进行定性的检定，而不能进行定量的分析。 4  结论 在鉴定可溶性还原糖的方法步骤中，斐林试剂甲液(2mL)和乙液(4滴)无论是先混合马上使用，还是两液依次加入试管都具有相同的实验效果；但斐林试剂甲液(2mL)和乙液(4滴)混合时间过长，不宜用作鉴定可溶性还原糖的试剂。 实验还明，对乙液滴数的要求不需太严格。 笔者在鉴定蛋白质的实验中，通过实验证明，双缩脲试剂A(2mL)与B(3～4滴)分别加入蛋白质溶液的次序或先混合再加入，都能够得到相同的实验效果。