豆粕固态发酵提取分离大豆肽的研究（可编辑）

豆粕固态发酵提取分离大豆肽的研究（可编辑） 豆粕固态发酵提取分离大豆肽的研究 山东轻工业学院 硕士学位 豆粕固态发酵提取分离大豆肽的研究 姓名:李明 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:宋俊梅 2011-06-06山东轻工业学院硕士学位论文 摘 要 大豆肽是以豆粕或大豆分离蛋白为原料经蛋白酶水解或微生物发酵、分离并 精制而成的蛋白质水解产物,以小分子肽为主,还含有少量游离氨基酸、糖类和 无机盐等成分。大豆肽的蛋白含量为 85%左右,其氨基酸组成与大豆蛋白相同, 必需氨基酸的平衡良好且含量丰富。由于大豆肽具有很多优良的理化特性和生理 功能,因此在很多领域得到了广泛的应用。随着人们对大豆肽功能特性和营养价 值的认识的加深,越来越多的专家开始研究发酵法生产大豆肽,固态发酵生 产大 豆肽研究较少。 为了弥补酶解法和液态发酵生产大豆肽的不足,通过对提取、脱糖、脱色、 脱盐等过程的研究,本课建立一套豆粕固态发酵生产大豆肽的工艺。该工艺以 其发酵量大、产量大、成本低为特点为大豆肽生产开辟了新的途径。主要研究结 果如下: 1 提取:研究了不同提取剂提取多肽的提取效果,并最终选择盐酸为提取 剂。然后通过对单因素实验和正交试验的研究,确定了最优的提取条件为提取时 间 30min,提取温度 50?,提取剂(盐酸)浓度 0.5mol/L。多肽提取率为 48.5 % 2 脱色:研究了不同脱色剂对多肽提取液的脱色效果,并最终选择粉末活 性炭为脱色剂。然后通过对单因素实验和正交试验的研究,确定了最优的脱色条 件为活性炭用量 1.5%,温度 30?,pH2.5,脱色时间 2.0h。脱色过程中的脱色 率为 80.6%、肽损失率为 9.28%。 3 脱糖:本研究采用离子交换法进行脱糖,通过对吸附和洗脱工艺的优化, 然后采用 pH2.5-12.5 的缓冲液进行洗脱,脱糖率可达到 63.09%,同时多肽 回收 率为53.93%。 最终大豆肽的回收率为 23.72%,纯度达到 85.5%,符合大豆肽粉的标准(? 80%)。 关键词:固态发酵;大豆肽;提取;分离 I山东轻工业学院硕士学位论文 ABSTRACT Soybean peptides are separated and extracted from the soy protein meal or soybean protein isolate, which is hydrolysised by protease or microbial fermentationThese are mainly small molecule peptide-based, it also contains a small amount of free amino acids, sugars and inorganic salts and other ingredients. The protein content of soybean peptide is about 85% , its amino acid composition are the same as soy protein, essential amino acids are balance and abundant. Because soybean peptide has many good physical and chemical properties and physiological functions, in many areas has been widely used. With functional properties and nutritional value of soybean peptide are deepen understanding, more and more experts began to study the production of fermented soybean peptide, but solid-state fermentation of soybean peptide is lessTo make up for the lack of production of soybean peptides by protease hydrolysis and liquid fermentation method. Through processes like the extraction, desugar, bleaching, and desalination and so on, the subject has established a soybean peptides production process by solid-state fermentation of soybean meal. The process characterized by its fermentation capacity, yield, low cost open up new way for soybean peptides production. The main results are as follows: Extraction: Study on the effect with different extraction solvent to extract peptides, and ultimately select the hydrochloric acid as extracting agent. Then the single factor experiments and orthogonal test were studied to determine the optimal extraction conditions for the extraction time is 30min, extraction temperature 50?, extraction agent hydrochloric acid concentration of 0.5mol / L. Peptide extraction rate was 48.5%Bleaching: Study on the effect with different bleaching agent, and ultimately select powdered activated carbon as bleaching agent. Then the single factor experiments and orthogonal test were studied to determine the optimum conditions for powdered activated carbon dosage of 1.5%, temperature 30?, pH2.5, bleaching time 2.0h. The bleaching rate was 80.6%and the loss rate of peptide was 9.28% in the process of bleachingDesugar: In this study, we use ion-exchange method to remove sugar, through the optimization of the adsorption and desorption process, and use pH2.5-12.5 elutionIABSRACT buffer to desorpt, desugared rate reached 63.09%, while recovery of peptides 53.93% The final recovery rate of soybean peptide was 23.72% and the purity was 85.5 %, in line with the standards of soybean peptide powder ? 80% Key words: solid-state fermentation; soybean peptide; extraction; separation 学位论文独创性声明 本人声明,所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。论文作者签名:日期: 年 月 日学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时, 署名单位仍然为山东轻工业学院。论文作者签名:日期: 年 月 日 导 师 签 名: 日期: 年 月 日 第 1 章 绪论 1.1 大豆肽简介 大豆肽是平均肽链长度为2~10的短肽以2~3的低分子肽为主,还含有少 量的游离氨基酸、无机盐和糖类等成分,相对分子质量以低于1000Da的为主体, 主要相对分子质量分布在300Da~700Da范围内。大豆肽的蛋白含量为85%左右, [1] 其必需氨基酸含量丰富且平衡良好,其组成和大豆蛋白完全相同 。同时研究发 现许多小分子量肽在经人体消化道时,不被水解可直接被人体吸收利用,并且具 有降血压、降低胆固醇等多种的生理活性,因此大豆肽也被称为大豆功能肽或活 性肽,目前对大豆肽的研究主要集中在短链肽上,并取得一定的研究成果。 1.1.1 大豆肽的营养特性 大豆肽的营养特性主要体现在“三高一低”,即高营养性、高吸收率、高吸 收速度和低抗原性。大豆肽是由大豆蛋白分解而来的,因此其氨基酸的构成与大 豆蛋白完全相同,不仅含有人体必需的8种必需氨基酸,而且其氨基酸含量均达 [2] 到WHO的推荐标准(甲硫氨酸为限制氨基酸除外) 。 现代生物代谢试验研究表明,多肽在小肠内的吸收,是不需要进一步降解成 [3] 氨基酸的,而是以多肽的完整形式被转运至肠粘膜细胞中直接被吸收 。多肽的 + 2+ [4] 吸收是一个独立的过程,吸收过程与 H 浓度、Ca 浓度、电导和耗能有关 。在 [5] 用合成肽所做的实验中发现 :二肽和三肽的吸收速率比同一组成的氨基酸的吸 收速率要快。因此,大豆肽在消化吸收性方面比蛋白质和氨基酸更佳。 大豆蛋白具有较大的抗原性,主要是大豆蛋白中含有具有抗原性的7s和2s球 蛋白,在大豆肽制备过程中将球蛋白进行了降解,使其低分子化。研究表明,当 蛋白质的分子量在3400u以下时抗原性大大降低不会引起过敏反应,而大豆肽的 分子量大多在1000u以下,基本无抗原性。通过酶免疫测定法测得大豆肽的抗原 性只有大豆蛋白的0.1%~1%。因此,大豆肽可以取代大豆蛋白或乳蛋白,以满 足对蛋白有过敏反应的人群对氨基酸的摄入,尤其是在生产低抗原性婴儿食品方 [6-8] 面前景广阔 。 1.1.2 大豆肽的加工特性 研究表明,大豆肽是由大豆蛋白降解而成的,因此失去了母体蛋白原有的空 间结构,最终造成了其加工特性的改变,使大豆肽拥有了许多大豆蛋白无法比拟 的加工特性,并在食品工业中具有广阔的应用前景。 1 高溶解性1大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 由于酶解使蛋白质分解为多肽,相对分子质量减小,端基极性基团大幅增加, 因此大豆肽具有良好溶解性。一般大豆蛋白在等电点附近便会形成沉淀,而大豆 [9] 肽在任何条件下都具有良好的溶解性 。通过对多肽在蛋白质等电点(pH4.2-4.3) 处的溶解度测定,表明大豆肽不仅在一般pH下具有较高的溶解度,而且大大提 高了其等电点处的溶解度,再加上大豆肽的溶解性不受温度的影响,因此作为蛋 白质补充剂,拓宽了其在饮料行业中的应用范围。 2 低粘度 大豆蛋白降解为大豆肽以后,粘度大大降低,主要是因为蛋白质的空间结构 遭到破坏,相对分子质量减小,大豆肽的膨胀性与大豆蛋白相比大大减小。溶液 的粘度受浓度和pH值的影响,研究表明,大豆肽的粘度受浓度和的影响较小, 在不断改变大豆肽溶液浓度和pH的条件下大豆肽的流动性基本无差异。10%大 豆蛋白溶液与30%的大豆肽溶液的粘度相当,当大豆蛋白含量超过10%以后溶液 粘度随浓度直线上升,而50%的高浓度多肽溶液仍呈现较低粘度,在不影响质量 [1] 和口感的前提下,此特性可用于生产高度蛋白饮料 。 3 抗凝胶性 大分子蛋白质具有热凝胶性,在加热情况下蛋白质间会通过二硫键相互结合 形成凝胶。大豆肽通过抑制游离氨基形成二硫键,使凝胶强度减小。在高蛋白果 冻、豆腐等的生产中,可通过大豆肽的这种特性来调整类似高蛋白食品的硬度和 口感。 4 高吸水性 由于大豆蛋白被水解后大量亲水基团裸露在外,因此大豆肽的吸水性明显高 于大豆蛋白的吸水性。研究表明,当溶液pH发生变化时会导致大豆肽净电荷的 变化,这种电荷变化所产生的作用力不足以改变水与大豆肽分子之间的作用 力, 因此,当溶液pH变化时对大豆肽的吸水性影响不大。 1.1.3 大豆肽的生理功能 1 促进矿物质的吸收 大豆蛋白中存在的草酸、植酸、单宁和其他多酚类物质,这些物质会抑制矿 物质的利用。由于大豆肽可与多种金属离子形成有机金属络合物,使金属离子和 微量元素处于良好的可溶状态,因此大豆肽可以保护金属离子,促进金属离子的 吸收。 2 能降胆固醇、降血脂、降血压 [10] 20 世纪初,人们发现了大豆蛋白具有降低胆固醇和血脂的作用 ,进一步 的研究表明其水解产物大豆肽同样具有降低胆固醇和血脂的作用,且效果更佳。 大豆肽能够刺激甲状腺素的分泌,抑制肠道内胆固醇的吸收,促进胆汁酸化并排 2出体外。其中含有的多种功能肽,能防止血凝块的产生,降低血脂的粘度,从而 [11] 达到降低胆固醇和血脂的目的。胡可心 等通过对小白鼠长期喂服大豆肽的研究 [12] 表明大豆肽能有效减少机体对胆固醇的吸收。许多动物实验和临床试验表明 : 分子相对质量大于 5000Da 的大豆肽具有明显降低胆固醇的作用;并且只对胆固 醇值高的人有降低胆固醇的作用,对正常人没影响。另外,大豆肽能抑制血管紧 [13] 张素转换酶的活性 。 3 大豆多肽促进脂肪代谢和减肥的作用 经过多年研究发现,大豆肽有增加脂肪基础代谢和减少皮下脂肪的沉积的作 [14] [15] 用 。日本学者伏木 等通过对负荷游泳的小白鼠的研究发现,服用含有5%大 豆肽的水溶液,对体内脂肪量有明显的消耗作用。1.2 国内外研究现状 1.2.1 大豆肽的生产方法研究现状 大豆肽的生产方法主要有酸水解法、酶水解法和生物发酵法。酸水解法由于 [16] 存在各种弊端,逐渐被淘汰;近年来由于酶制取及提纯工艺的日益成熟 ,现在 工业生产上一般采用酶水解法来生产大豆肽;生物发酵法是把蛋白酶的发酵生产 和多肽的酶解生产有机地结合在一起,降低了大豆肽的生产成本,应用前景 较好, 是近几年的研究热点。 1 酸水解法 上世纪 60 年代,为了提高大豆蛋白质的功能特性,人们利用酸等化学试剂 对大豆蛋白质在进行水解,促使蛋白质分子断裂形成小分子的多肽类物质。但是 酸水解法在水解过程中存在着诸多弊端,比如营养成分损失、副反应多,且生产 中不能按规定的水解程度进行水解,再加上对设备的材料要求高,因此酸水解法 研究进展缓慢,目前生产上一般不采用酸水解法来制备大豆肽。 2 直接酶解法 直到上世纪 80 年代酶化学得到快速发展,美国、日本对大豆蛋白的酶解工 艺和酶解过程的感官特性、功能特性改善的研究取得了较大的进展。国内上世纪 90 年代起对大豆蛋白酶解工艺进行了大量的研究和探讨,并取得一定的研究成 果。水解大豆蛋白生产大豆肽的酶主要是蛋白酶,理论上讲,无论是植物蛋白酶、 动物或微生物蛋白酶都可以用于水解大豆蛋白,但实际应用中,受到客观条件的 限制较多。由于酶制剂价格较高,直接酶解法生产大豆肽成本与产值不成正 比, 限制了其工业化的生产规模和推广进程。对于酶解法,主要研究酶的筛选和酶解 条件的优化。 在酶水解法生产大豆肽的初期研究中,一般采用单酶水解生产大豆肽,单酶 [17] 水解具有水解不彻底的缺点。孙云霞等 以脱脂大豆粉为底物采用AS1398#中性 3大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 蛋白酶酶解制备大豆肽的研究中,通过色谱,得到了制取大豆肽的最佳条件 为:底物浓度11%,加酶量EPS5%,最适pH 7,温度50?,时间4h。研究表明, 在此酶解条件下制取的大豆肽具有较明显的苦味,加入外切酶继续水解后,苦味 变弱。 [18] 现在大多采用多酶复合水解法 ,以提高水解度和水解效率。与单酶水解相 比,多酶复合水解要复杂得多。通过对多酶复合水解蛋白与单酶水解蛋白的研究, 研究表明,两者最显著的差别是多酶复合水解的水解度要明显高于单酶水解的水 [19] 解度 。研究表明,由于多酶水解法水解度较单酶法高,能将大豆蛋白水解到相 对分子质量更小的短肽,所以多酶法水解大豆蛋白所得大豆肽苦味明显弱于单酶 水解法。 [20] 朱海峰等 研究了双酶(酸性蛋白酶和碱性蛋白酶)协同作用,不断非人为 改变pH的条件下水解大豆蛋白制备多肽,在此基础上并探讨了双酶加入方式对 大豆肽得率和水解度的影响。 [21] 周利亘等 利用三种蛋白酶酶解大豆蛋白,并对提取大豆肽的工艺进行了研 究,得到了三酶复合法生产大豆肽的新工艺。 [22] 吴建中等 研究了采用两种蛋白酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味大豆 肽的工艺。研究结果表明,双酶法生产的大豆肽水解液清澈透明,苦味较低,水 解度可达到13%左右,且水解过程中氨基酸含量明显提高。3 生物发酵法 [23] 生物发酵法 则采用现代生物发酵技术,通过发酵过程中微生物分泌的 酶将豆粕中的蛋白酶解为大豆肽。目前以豆粕为原料通过发酵生产大豆肽的研究 已经成为新的研究热点。微生物在发酵过程中分泌蛋白酶和羧肽酶,分别作用于 大豆蛋白和肽链末端的疏水性氨基酸,使蛋白的水解和多肽的脱苦在发酵过程中 一步完成。生物发酵法生产大豆肽,主要是以大豆蛋白和豆粕为原料,通过微生 物发酵来制取大豆肽。大豆蛋白发酵生产大豆肽的研究已经比较成熟,但成本较 高,目前研究者正在探索用产蛋白酶的霉菌或细菌发酵豆粕生产大豆肽。豆粕是 油制品的副产物。豆粕一般当作动物饲料来处理,这就造成了一定程度上的浪费。 微生物发酵法制备大豆肽主要是利用发酵菌株产生的蛋白酶对大豆蛋白进 行酶解,目前研究和应用较多的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉等。与 酶解法生产大豆肽的工艺相比,原料成本低廉、工艺过程简单、发酵效率高、条 件温和、多肽品质好主要为300Da~1000Da短肽。 [24] 我国近年来在生物发酵法制备大豆肽领域开展了较多研究。李理和潘进权 等对一株真菌进行液态发酵来制备大豆肽的工艺进行了研究。结果表明,在发酵 24-30h,pH6.0,28?的条件下得到的大豆肽水解液,色泽良好,通过质谱分析, 4多肽分子质量主要分布在4000Da,表明液体发酵法生产大豆肽效果较理想,可 用于工业化生产。 [25] 万琦等 通过反复实验筛选到一株产外肽酶和蛋白酶的枯草芽孢杆菌,利用 此菌在发酵过程中产生的羧肽酶和蛋白酶的作用将大豆蛋白酶解为多肽,通过将 短肽末端的疏水性氨基酸切除,从而使蛋白的水解和多肽的脱苦在发酵过程中一 步完成。 [26] 邵伟等 将一株经诱变处理的枯草芽孢杆菌用于发酵制备大豆多肽; [27] 在工业化生产的实际应用中,张雁平 通过成本核算,与酶解法相比,采用 发酵法生产大豆肽得率可由10%增加到20%,而成本仅为直接酶解法的50%左 右。因此,生物发酵法制备大豆肽具有良好的推广前景。 1.2.1 大豆肽的分离纯化方法研究现状 随着人们对大豆肽营养价值和功能特性的认识加深,越来越多的新型提取分 离方法也随之产生。目前,关于多肽的分离纯化大多采用的是凝胶过滤层析、大 孔吸附树脂、高效液相色谱、超滤、凝胶电泳等方法。1 凝胶过滤色谱 凝胶层析色谱中的凝胶起着分子筛的作用,根据样品分子量大小分级分离, 因而又称为分子筛层析或排阻层析,其突出优点是凝胶为惰性载体,不带电荷, 吸附力弱,操作条件温和,可在相当广的温度范围内进行,不需要有机溶剂,是 目前最广泛使用的肽的分离方法之一。用于肽类分离的凝胶种类较多,主要包括 , [28 29] 交联丙烯基葡聚糖、聚丙烯酰胺、交联琼脂糖和琼脂糖凝胶 。 [31] 邹存媛等 采用超滤法对大豆肽的酶解液进行初步分离,将酶解液通过葡聚 糖凝胶G-15进行分离,分离出了分子量小于1200Da的大豆肽产品。 [30] 孔青等 利用葡聚糖G-15分离得到一种胶原蛋白酶解物,该酶解物可以抑 制高血管紧张素转化酶的活性。 2 大孔吸附树脂 大孔树脂吸附是上世纪 70 年代发展起来的一种新工艺。大孔吸附树脂是一 类不含交换基团的非离子型高分子吸附剂,具有吸附和筛选性能,在分离纯化氨 基酸、多肽和蛋白质等生物活性物质时具有条件温和、操作方便和设备简单 的特 性。研究证明,在多肽的分离中常用 DA201-C 型非极性的大孔吸附树脂可得到 较好效果,该树脂孔表的疏水性较强,可通过与分子内的疏水部分的作用吸附溶 , [32 33] 液中的有机物 。 [34] 吴金鸿 采用大孔吸附树脂提取分离乙醇分级的丝胶肽,分离得到不同极性 的具抗氧化活性的醇沉丝胶肽,取得了较满意的效果。 3 高效液相色谱5大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 高效液相色谱因为其柱效高,选择性好,已成为多肽类物质分离纯化和分析 [35] 的强有力手段 , 利用高效液相色谱不仅可以在短时间内完成分离分析的目的, 而且还可制备生物活性多肽, 因此分离纯化的条件选择已成为学者研究的热点。 [36] Chin等 在研究蛋白质水解得到亲水性肽的过程中发现, 回收肽所采用非 挥发性缓冲液会干扰肽的后续鉴别。他们改用多孔石墨碳固定相使肽脱盐,同时 选择挥发性流动相。这样既能很好地分离分子量小的分子肽,又可以解决后续分 析的干扰难题。 [37] Desportes等 研究了一种从酒中分离小分子肽分子量小于3000Da并进行 纯度检测的方法。先把酒经中空纤维超滤得到分子量小于3000Da的小分子肽混 合物,然后通过Sephadex LH20的柱色谱,得到的组分用HPLC分离,最后用毛细 管电泳检测样品纯度。 [38] Said等 通过胰蛋白酶水解K 酪蛋白得到4种生物活性肽分子量500Da~ 2 800Da,用强离子交换液相色谱分离,同时考察pH值、洗脱液的影响,发现洗 脱顺序取决于肽的pH值。尽管这4种肽的物化性质非常接近,用Hyper DIEIC柱 分离仍取得了分离效果。 4 反相高效液相色谱 在肽的分离纯化中,最常用最有效的方法是RP-HPLC,它是根据肽的极性大 小而达到分离的目的。在运用PR-HPLC时,溶剂的极性大于固定相。由于操作简 单,分离技术的灵活多变性,加之色谱过程稳定,反相高效液相色谱已成为高 压 液相色谱应用中最广泛的一个分支。 RP-HPLC对于从多肽混合物中分离出功能性 多肽片段和功能性片段的氨基酸起了关键的作用。其它方法分离得到的肽经 RP-HPLC后,仍会得到数十个到几十个峰,因此,RP-HPLC是分离纯化多肽和 [39] 氨基酸最有效的方法 。 [40] 卢鹤等 采用RP-HPLC,建立了大豆肽的RP-HPLC的分离方法。根据实验 结果,通过对分离效果的比较,确定了采用凸形梯度方式为最佳的洗脱方式。具 体实验条件为流动相从水:TFA100:0.1到乙腈:TFA100:0.1,凸形梯度; 进样量为5μL;检测波长为220nm;时间为80min;流速为1mL/min。 [41] Roturier等 发现传统的RP-HPLC不能分离食物中的亲水性小分子肽混合 物。若先用92芴甲基羰基氯对肽样品做柱前衍生化,再通过RP-HPLC分离,可达 到满意的分离。他们将从奶制品水溶液中提取的肽按上述过程分离后,用哌啶衍 生,最后通过埃德曼降解鉴别成分,实验最终成功分离得到15个二、三、四肽。 5 离子交换色谱 离子交换色谱是基于溶质分子带不同性质的电荷和不同电荷量,并可在固定 相和流动相之间发生可逆交换的分离方法。离子交换剂是由带电基团和基质构 6成,其基质主要包括离子交换琼脂糖、离子交换交联葡聚糖、离子交换树脂和离 子交换纤维素,根据基质上所带的基团的种类又可分为阳离子和阴离子两类交换 剂。由于洗脱剂的离子强度等对分离纯化影响显著,故研究主要集中在大豆肽性 [42] [43] 质、洗脱条件等方面 。韩香等 报道了多肽分子分离纯化的正负吸附离子交 换色谱及各自的优点。 1.3 立题依据及研究内容 1.3.1 立题依据 目前我国对大豆肽的生产研究较多,但工业化生产进展较慢、规模较小。其 主要原因在于生产成本较高,产值效益较低,在市场中难以得到推广。传统的大 豆肽生产模式是以大豆分离蛋白为原料,利用各种蛋白酶酶解分离蛋白制取大豆 肽。此方法生产成本较高,一方面生产所需的酶制剂用量大且价格昂贵,另一方 面作为主要生产原料的大豆分离蛋白成本较高,这是生产成本较高的两个主 要原 因。本研究直接以豆粕为原料,利用米曲霉产生的蛋白酶酶解大豆蛋白生产大豆 肽,从酶制剂和原料方面考虑,大大降低了生产成本。 大豆肽的发酵生产方法主要有液态发酵法和固态发酵法两种,液态发酵法研 究较多,固态发酵生产大豆肽研究相对较少,固态发酵豆粕提纯大豆肽国内未见 报道。固态发酵法较液态发酵法主要有一下优点:?培养基含水量少,废水废渣 少,环境污染少,容易处理;?消耗低,设备简易;?设备技术简易,后处理方 便;?产物浓度较高。因此本研究采用固态发酵法,以豆粕、麸皮为发酵培养基, 用米曲霉对其进行固态发酵,直接从豆粕固态发酵物中提取分离大豆肽,此法生 产的大豆肽单位产量大、成本低,推广前景广阔。 1.3.2 研究内容 本研究采用产蛋白酶的米曲霉 A-9005,在最优的发酵条件下对豆粕和麸皮 的混合物进行固态发酵生产大豆肽。然后通过对提取、脱糖、脱色等过程的研究, 制定出一套适合大豆肽固态发酵提取分离的方法。在大豆肽提取过程的研究中, 将通过考察不同提取剂的提取效果,选择合适的提取剂,然后通过单因素和 正交 试验对提取条件进行了优化;在大豆肽分离纯化过程的研究中,主要包括脱色和 脱糖等过程。脱色过程研究了不同脱色剂的脱色效果,选择合适的脱色剂以后对 脱色条件进行了优化;对于脱糖过程的研究,本课题采用离子交换法,通过对吸 附和洗脱工艺的研究和条件优化,制定了一套大豆肽脱糖的方法。 本课题的主要研究内容包括: 1. 大豆肽提取剂的选择和提取条件的确定; 2. 大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定; 3. 大豆肽提取液脱糖工艺的研究 7大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 第 2 章 大豆肽提取剂的选择及提取条件的确定 2.1 引言 提取是指在分离纯化前将经过预处理的样品置于溶剂中,使被分离的生物分 子充分释放到溶剂中,并尽可能保持原来的天然状态和原有生物活性的过程。这 一过程是将目的提取物与样品中其它化合物和生物分子分离,即由固相转入液相 [49] 。凡能影响物质溶解度的因素均能影响提取效率,大致涉及溶剂本身及提取 操 作方法和条件两个方面。主要包括以下因素:1、溶剂的性质。一种物质溶解度 的大小与溶剂的性质密切相关。物质溶解性质主要有三个规律:极性物质易溶于 极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性溶剂中;酸碱物质易于互溶,即酸性物质 碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中;降低溶剂的介电常数可降低溶质的溶 解度。在做溶剂提取时,溶剂的性质是首要考虑的。2、离子强度。离子强度是 影响物质溶解度的主要因素之一,但离子强度对不同物质的溶解度的影响不同。 3、pH值。溶剂的pH值对生化物质的提取有两方面的影响,一是影响生物高分子 的结构与活性。二是通过影响溶质的解离状态而改变其溶解度。一般来说非解离 的分子状态易溶于有机溶剂,而离子状态的物质都易溶于水。对于酸性或碱性物 质,可利用一定pH的水溶液提取出来,再改变溶液pH抑制其解离,使其曾分子状 态,再转溶于有机溶剂,这样对其进一步分离纯化十分有利。然而像氨基酸这 样 的两性物质,除了在等电点时溶解度最低外,在任何pH条件下都曾离子状态,所 以一般不用有机溶剂提取氨基酸(乙醇除外)。4、温度。温度的升高可增加物 质的溶解度。对热比较稳定的生化物质可用加热的方法提取,但对绝大多数生物 高分子来说,一般尽可能在低温下提取,以便最大程度的保持其生物活性。 多肽的提取方法主要有水溶液提取和有机溶剂提取两种方法。肽类的提取一 般情况下以水溶液为主,常用的水溶液包括稀盐、稀酸、稀碱,稀盐溶液或缓冲 液对肽类的稳定性好、且溶解度大,是提取肽类的最常用的溶剂。用水溶液提取 肽类时应注意pH值、温度和盐溶变化等对提取肽类的影响,可通过控制这些因素, 以减少其它杂质对目的提取物的干扰。一些分子中非极性侧链较多、与脂类结合 较牢固的多肽,难溶于水、稀酸、稀碱、稀盐中,常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂包括丙酮、已醇、正丁酮和异丙醇等。这些有机溶剂与水互溶或 部分互溶,同时具有亲脂性和亲水性,因此常用来提取含有非极性侧链较多 的肽 [50] 类 。8豆粕经固态发酵后,水溶性的成分很多,除了包括分子量大小不同的氨基酸、 多肽类外,还包括豆粕本身含有的无机物、有机物、盐类、糖类等成分,因此豆 粕发酵基质是一个混合体系。大豆肽在不同pH、温度、离子强度等条件下都是可 溶的,其比未经水解的大豆母体蛋白溶解度有极大的提高。这主要是因为蛋白酶 使蛋白质分解,相对分子质量减小,端基极性基团增加,进而使溶解度增大。用 酸、碱、盐提取可以分别去除一些碱溶、酸溶、和对离子强度有要求的物质,在 保证多肽含量的前提下,尽量减少提取液中的杂质。 目前多肽提取的研究主要集中在提取某一种或某一类多肽,同时提取大量多 肽的研究较少。本章选用不同浓度的酸、碱、盐和蒸馏水作为提取剂,以提取液 中多肽含量、总糖含量、提取液透光率为指标,研究各种提取剂的提取效果,选 定提取剂以后,然后对提取条件进行优化。 2.2 材料和设备 2.2.1 菌种和材料 米曲霉 A-9005,山东大学微生物提供 豆粕,山东禹王实业有限公司提供 麦麸,市场购买 2.2.2 培养基 [44] 1 斜面培养基(察氏培养基 ):NaNO 0.2g,KCl0.05g,K HPO 0.1g, 3 2 4 MgSO 0.05g,FeSO 0.001g,蔗糖 3.0g,琼脂 2.0g,蒸馏水 100mL,自然 pH 值。 4 4 [44] 2 液体活化培养基(察氏培养基 ):NaNO 0.2g,KCl0.05g,K HPO 0.1g, 3 2 4 MgSO 0.05g,FeSO 0.001g,蔗糖 3.0g,蒸馏水 100mL,自然 pH值。 4 4 3 发酵培养基:含水量 65%、pH6.4、豆粕含量(豆粕/麸皮)93%的发酵 培养基,取 60g分装于 500ml 三角瓶中,121?,20min灭菌,待用。 2.2.3 试剂 盐酸、氢氧化钠、氯化钠、3,5-二硝基水杨酸、葡萄糖、丙三醇、硫酸、过 氧化氢、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铜、硫酸钾、硒粉等。 2.2.4 试剂的配制 1 葡萄糖标准溶液: 准确称取葡萄糖0.50g(预先在105?烘至恒重),用水溶解后,移入50mL 容量瓶中并稀释至刻度、摇匀,此溶液就是0.01g/mL的葡萄糖标准溶液。2 3,5-二硝基水杨酸: 准确称取 6.5g 3,5-二硝基水杨酸、26.0g氢氧化钠,分别加热溶解、冷却 后, 9大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 置于 1000mL 容量瓶中。然后再加入 45.0g 丙三醇,摇匀,冷却,用蒸馏水定 容 至 1000mL。 3 浓硫酸-H O -水混合液(2:3:1): 2 2 将 100 mL 水置于 1000mL烧杯中,缓慢加入 200 mL 浓硫酸,不断搅拌, 冷却后再加入 300 mL 30%过氧化氢,混合备用。 4 硼酸指示剂吸收液: 10L 2%硼酸加入 70mL 0.1%甲基红指示剂,再加入 100 mL0.1%溴甲酚绿, 混合备用。 5 混合指示剂: CuSO ?5H O 10g,K SO 100g,硒粉 0.2g,分别在研钵中研细,使通过 40 4 2 2 4 目筛,混匀后备用。 6 盐酸溶液: 0.05 mol/L盐酸溶液:4.5 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.1 mol/L盐酸溶液:9 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.2 mol/L盐酸溶液:18 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.3 mol/L盐酸溶液:27 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.4 mol/L盐酸溶液:36 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.5 mol/L盐酸溶液:45 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 0.6 mol/L盐酸溶液:54 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 1 mol/L盐酸溶液:90 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 6 mol/L盐酸溶液:540 mL盐酸加 1000 mL水,混匀。 7 NaCl 溶液: 0.05 mol/L NaCl 溶液:准确称取 2.925gNaCl,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 0.1 mol/L NaCl 溶液:准确称取 5.85gNaCl,加水稀释并定容至 1000 mL, 混 匀。 0.3 mol/L NaCl 溶液:准确称取 17.55gNaCl,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 0.5 mol/L NaCl 溶液:准确称取 29.25gNaCl,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 1.0 mol/L NaCl 溶液:准确称取 58.5gNaCl,加水稀释并定容至 1000 mL, 混 匀。10 8 NaOH溶液: 0.05 mol/L NaOH 溶液:准确称取 2.0gNaOH,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 0.1 mol/L NaOH溶液:准确称取 4.0gNaOH,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 0.3 mol/L NaOH溶液:准确称取 12.0gNaOH,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 0.5 mol/L NaOH溶液:准确称取 20.0gNaOH,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 1.0 mol/L NaOH溶液:准确称取 40gNaOH,加水稀释并定容至 1000 mL, 混匀。 2.2.5 实验仪器与设备 SW-CJ-2G型双人净化工作台(苏州净化设备有限公司) MJPS-150型霉菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司) DHZ-型大容量恒温振荡器(上海福玛实验设备有限公司) AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) DZKW-C型电子恒温水浴锅(黄马市卸甲综合电器厂) GHX-9000B-1隔水式恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司) P8-10 酸度计 KJELTEC 2300全自动凯氏定氮仪(福斯分析仪器公司) LG10-2.4A高速离心机(北京医用离心机厂) HWS-250型恒温恒湿培养箱(上海精宏实验设备有限公司) Spectrumlab 22PC 可见光分光光度计(上海棱光技术有限公司) 2.3 实验方法 2.3.1 发酵方法 1 菌种活化:将冰箱中冷藏的斜面菌种转接到液体查氏培养基中,在 30 ?,200r/min的条件下振荡培养 36h,即可用于发酵,此时液体培养基中应有小 菌丝球出现。2 豆粕发酵:灭菌发酵培养基按 10%接种量接种,在 33?的温度下发酵 96h。11大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 2.3.2 提取液的制备将发酵豆粕混合均匀,准确称取 10g 样品,加入 30mL 提取剂,搅拌提取 30min,离心(4000rpm,10min),上清液定容至 50mL,滤纸过滤,滤液即为提 取液。 2.3.3 总糖的测定?3,5-二硝基水杨酸比色法 1 原理 还原糖是指分子中含有游离醛基、酮基或半缩醛羟基的糖类。单糖都是还原 糖,双糖和寡糖有一少部分显还原性,如乳糖和麦芽糖。凡分子中含有游离半缩 醛羟基者有还原性。利用单糖、双糖和寡糖的溶解度的不同可把它们分开;并且 可用酸水解法使没有还原性的双糖和寡糖彻底分解为具有还原性单糖再进行测 定,这样就可以分别测出样品中还原糖和总糖的量。 测定还原糖的方法有折光率法、比旋度法、斐林试剂法、碘量法、3,5-二 硝基水杨酸比色法。本实验利用糖的还原性质,将 3,5-二硝基水杨酸与还原 糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定浓度范围内,还原糖的量和棕红 色物质颜色的深浅程度比例关系,可用分光光度计进行测定。优点:快速、杂质 干扰较少。 2 操作方法 ? 葡萄糖标准曲线的绘制 准确吸取0.01g/ml的葡萄糖标准溶液0、2、4、6、8、10mL,分别置于10mL 容量瓶中,用水稀释到刻度并摇匀。吸取上述不同浓度的标准溶液各1mL,分别 置于10mL比色管中,加入3,5-二硝基水杨酸溶液2mL,将比色管置于沸水浴 中显色2min,冷却。定容至10ml后,于分光光度计波长580nm处测定吸光度,绘 制标准曲线。 ? 总糖测定(酸解法) 吸取样品 5ml,用 5ml 6mol/LHCl+5ml的蒸馏水沸水浴酸解 20min,调 pH7.0 后移入 50ml 的容量瓶中,定容,吸取 2ml 于 25ml 比色管中,加入 3,5-二硝基水 杨酸 2ml,沸水浴加热 2min冷却并定容至 10ml,在 580nm处测定吸光度。 计算: -3 总糖(%)=C×10 ×B×100/V/W 公式(2.2) 式中 C??测定样品溶液查得相当于葡萄糖量(g); B??样品溶液稀释倍数; V??比色时吸取样液的量(mL); W??样品的重量(g)。122.3.4 多肽含量的测定 凯氏定氮原理(全自动凯氏定氮仪) 蛋白质和多肽是含氮的有机化合物,与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白 质分解,释放出氨、二氧化碳和水。消化完成后在凯氏定氮仪中加入强碱消化液, 使硫酸铵分解放出氨。氨与硫酸结合生成硫酸铵,然后碱化蒸馏使氨游离,用硼 酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋 白质含量。其中硫酸铜为催化剂,过氧化氢能加速反应,硫酸钾能提高消化液的 沸点。 2.4 结果与讨论 2.4.1 大豆肽提取剂的选择 用酸、碱、盐提取可以分别去除一些碱溶、酸溶、和对离子强度有要求的物 质,同时不同浓度的酸、碱、盐对部分多肽的溶解度有一定影响。在保证多 肽含 量的前提下,尽量减少提取液中的杂质。 2.4.1.1 不同浓度提取剂对提取的多肽含量的影响 20 18 酸 碱 16 盐 14 12 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 提取剂浓度mol/L图 2.1 不同浓度酸、碱、盐提取多肽的含量变化趋势图 由图2.1可知:从三种提取剂的提取多肽的含量上看,NaOH的提取效果比 NaCl和盐酸要好。用盐酸做提取剂时,多肽的提取量先下降后上升,当盐酸的浓 度在0.2mol/L时,提取多肽的量达到最低值;用NaOH做提取剂时,提取多肽的 含量随着NaOH浓度的增加,多肽的提取量基本趋于平稳,开始上升,之后呈平 缓的下降趋势,当NaOH浓度在0.1mol/L时,提取多肽的含量达到最大值;用 NaCl 做提取剂时,随着盐浓度的增加,多肽的提取量总体上呈下降趋势。 从图中可以看出当盐酸、NaOH、NaCl三种提取剂浓度在0-0.2mol/L范围内 13 提取液多肽含量mg/mL大豆肽提取液脱色剂的选择及脱色条件的确定 变化时对提取多肽的含量影响较大。随着提取剂浓度的增加,含量变化分别 趋于 平稳。 2.4.1.2 不同浓度提取剂对提取液的透光率的影响 大豆肽提取液原色为棕黄色或者褐色,其中含有异黄酮、皂甙、酚类、美拉 德反应产物等显色物质,经分析其最大吸收峰在480nm处。透光率可作为检 测提 取液色度、杂质含量的指标。 45.00% 40.00% 35.00% 30.00% 酸 25.00% 碱 20.00% 盐 15.00% 10.00% 5.00% 0.00% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 提取剂浓度mol/L 图 2.2 以不同浓度酸、碱、盐做提取剂,提取液的透光率变化趋势图 由图 2.2可知:从三种提取剂的总体水平上看,用盐酸做提取剂时,透光率 明显优于用 NaOH 和 NaCl 做提取剂时的效果,NaOH 和 NaCl 做提取剂时的透 光率相差较小。用盐酸做提取剂的时候透光率在 25%-40%范围内变化,随着盐 酸浓度的增加透光率呈上升趋势;用 NaOH 做提取剂时,透光率在 2%-10%范 围内变化,随着 NaOH 浓度的增加透光率呈下降趋势;用 NaCl 做提取剂时,透 光率在 5%-9%范围内变化,随着氯化钠浓度的上升透光率呈略微上升的趋势。 2.4.1.3 不同浓度提取剂对提取液的总糖含量的影响 1 葡萄糖的标准曲线的绘制 以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,在 580nm 波长下测定三次取平 2 均值,绘制标准曲线,其回归方程为:y1.742x-0.008 r 0.9994,线性关系良 好,按公式 2.2计算糖含量。葡萄糖的标准曲线如图 2.3所示。14 透光率480nm1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 葡萄糖浓度mg/mL图 2.3 葡萄糖的标准曲线 2不同浓度提取剂对提取液中糖含量的影响 大豆中含有水苏糖、棉籽糖、蔗糖等多糖,这些多糖都易溶于水,最后进入 提取液中,糖和多肽具有相似的溶解性质,在多肽的分离纯化中,糖类是一类 较 难除去的杂质,因此提取液中糖的含量是选择提取方法的重要指标。 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 HCl 1.5 NaOH 1 NaCl 0.5 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 提取剂浓度mol/L图 2.4 以不同浓度酸、碱、盐做提取剂,提取液的糖含量变化趋势图 由图 2.4 可知:从三种提取剂的总体水平上看,糖含量的变化不大,用盐酸 和 NaOH做提取剂时,提取液的糖含量在4mg/mL左右;用NaCl做提取剂时,提 取液的糖含量在3-4mg/mL之间;可以看出酸碱度对糖的溶解性影响不大。 综合多肽含量、透光