【doc】小鼠间胶原和基膜成分在诱导排卵过程中的变化

【doc】小鼠间胶原和基膜成分在诱导排卵过程中的变化 小鼠间胶原和基膜成分在诱导排卵过程中 的变化 第32卷第1期 2001年1月 解剖 ACTAANAToMICASINICA V0IJ32.No.1 Jan.2001 小鼠间质胶原和基膜成分在诱导排卵过程中的变化 钱晓菁许增禄徐健徐园园 (中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所,北京100005) 【摘要】目的研究问质胶原和基膜成分在诱导排卵过程中的变化.方法苦味酸天狼星红偏振光诖?生 物素一抗生物素蛋白间接免疫荧光,原位杂交.结果排卵前后.1型胶原,?型胶原,层牯连蛋白的分布,数量, 以及?型胶原和同质金属蛋白酶一2mRNA的表达有一定改变培论间质胶原和基膜成分对捧卵过程有一定 调控作用 【美羹词】同质胶原;基膜成分?捧卵 【中啊分类号】R329.24'Q492.5【文献标识码】A【文章冀号】0529—1356(2001)01—43 THECHANGESOFINTER~I'ITIALCOLLAGENSANDBASEMENT MEMBRANECOMPONENTSDURINGINDUCEDOVULATIONINMOUSE QIANXiao—jing.XUZeng—lu*?XUJian+XUYuan—yuan t,knrt,n州nfHistologyandEmbryology,InttH把ofBnsicMedicals…,5? Chlnes~AcademyofMedicalScience~一Pehi~guDMedicalCatege,BeOing100005,China) [Abstract]ObjectiveToinvestigatethechangesottheinterstitialcollagensandbasementme mbranetom- ponentsdurinmouseovulation.MethodsPicrosirius—polarizationmethod,biotin—avidinDCSsystemindirectira- mun0fluorescencetechniqueandinsituhybridizationwereused.Resul~Thedistributionoft ype】collagen, type?collagen.LNchangedduringinducedovulation,andtheexpressionoftype?collagenandMMP一2mRNA alsochangedduringthisprocess.ConclusionTheextracellularmatrixmayplayanimportantr oleduringovula— tion. [Keywords]Interstitialcollagen;Basementmembranecomponents;Ovulation 卵泡壁的破裂,卵母细胞排出是生殖过程的一 个重要事件.卵泡壁及卵泡周围存在大量的细胞外 间质,其中卵泡基膜是由?型胶原,层粘连蛋白 (1aminin,LN)巢蛋白/制动素,硫酸乙酰肝素等构 成,而I,?型胶原则是白膜和次级卵泡外膜层的主 要成分.卵巢皮质和髓质中还散在着大量胶原纤维, 弹性纤维和网状纤维等.这些细胞外问质成分数 量和分布在排卵前后会发生变化],越来越多的实 验证实存在一个纤溶酶原激活剂一纤溶酶一间质金属 蛋白酶(matrixmeta11oproteinase,MMP)的级联反 应机制Is]参与这些细胞外间质的降解.但各细胞外 间质成分与其相关的水解酶是如何作用的,对排卵 【收曹日期】1999-12一鲫【俸回日期】20000}18 【基金珂目】高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(9704) 【作者俺舟】钱晓瞢(1972一).女(衩族).北京市人.硕士,助教 通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeadd~ssed) 过程起何种作用尚不清楚.本实验通过对诱导排卵 过程的观察,研究排卵过程中小鼠部分细胞外间质 成分蛋白和mRNA的定位和表达的改变. 和方法 1.实验动物及动物模型的制备 中国医学科学院动物所提供4,6周健康雌性昆 明小鼠,体重为16,20g.每只腹腔注射孕马血清 (PMSG)5IU/0.1ml生理盐水,42,48h后注射人 绒毛膜促性腺激素(hCG)5Iu/0.1ml生理盐水. hCG注射后每隔3h(即0,3,6,9和12h)断颈处死, 分别取左右卵巢做常规石蜡切片和恒冷箱冰冻切 解剖32卷,1期 片.对照小鼠每次注射相同体积的生理盐水 2.试剂 兔抗小鼠?型胶原和兔抗小鼠LN抗体(北京 医科大学细胞生物室提供),生物素化山羊抗兔 lgG,荧光素抗生物素蛋白DCS(美国VectorLabo— ratories,Burlingame,购于北京中山生物技术有限 公司),地高辛DNA标记和检测试剂盒(德国 BoehringerMannheim).含人n『型胶原al(?)链 eDNA插入片段的重组质粒和含人MMP一2cDNA 插入片段的重组质粒,均由芬兰TuomoKarttunen 教授和HelenaAutio—Harmainen教授惠赠. 3.苦昧酸天狼星红染色一偏振光法 石蜡切片脱蜡至水后,0.1苦味酸一天狼星红 溶液中染色1,2h,流水冲洗5min,苏木素复染核 30s,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片.偏振光 显微镜观察并摄片. 4.生物素一抗生物素蛋白间接免疫荧光染色 冰冻切片室温干燥后,组织上滴加用PBS稀释 的正常山羊血清,4?孵育20min.分别加兔抗小鼠 ?型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体,4c孵育过夜. 对照切片,此步以山羊血清代替第一抗体.冷PBS 冲洗.加入生物素化的山羊抗兔lgG,4?孵育1h. 冷PBS冲洗.加入以碳酸氢钠缓冲液稀释的荧光素 一 抗生物素蛋白DCS,4c孵育1h.冷PBs冲洗用 含PBS和对苯基二胺(Pphenylenediamine,PPd) 的甘油做介质封片.标本在0lympus反射式荧光显 微镜下观察并摄片. s.石蜡组织切片原位杂交及统计学分析 含人?型胶原的n1(?)链eDNA和MMP2一 cDNA片段的重组质粒,人与小鼠的iV型胶原1 (?)链以及MMP一2均有很高同源性一.两种重组 质粒分别用氯化钙法转化太肠杆菌DH5a菌株,碱 裂解法进行质粒DNA的大量制备,PEG法纯化,相 应的限镧性内切酶消化,低熔点琼脂糖回收cDNA 片段,测定和值.计算DNA浓度.eDNA探 针用地高辛试剂盒标记和检测. 石蜡组织切片以0.04DEpc水裱贴于圆玻 片上.52c过夜烤干.新鲜二甲苯37?30min,室温 10min,梯度酒精脱水,PBS洗2次.新配的0.3 Tritonx—i0010min,PBS洗2次.蛋白酶K(1rag/ L)37?30min,冷PBS洗3次.0.25乙酸酐室温 10min,PBS洗2次.余下按常规原位杂交方法 操作],终止显色后梯度酒精脱水,二甲苯透明,树 脂封片,镜检并摄片.对照:以杂交液中免去探针作 阴性对照. 利用PharmaeiaLKBUhroscanXL激光密度 扫描分析系统,对阳性杂交信号单位面积平均灰度 进行半定量扫描分析,结果以SNK(StudentNew- man—Keuls)检验进行统计学分析,P<O.05为差异 显着. 结果 1.苦昧酸天狼星红染色,偏振光显微镜观察结果 偏振光显微镜下可见经天狼星红染色的胶原显 示不同的干涉色和不同强度的双折光.1型胶原纤 维有很强的双折光性,较粗大的纤维呈红色,而较细 的纤维则呈黄色;?型胶原为绿色的细纤维. 将要排卵的卵泡,其近卵巢表面一倒的红色,黄 色I型胶原纤维,绿色11型胶原纤维呈小片段分布, 分布不连续.卵泡基底面多为红色1型胶原纤维,双 折光强度较弱. 2.间接免痤灾光观察结果 2.1?型胶原:对照组小鼠卵巢中次级卵泡个体 较小,卵泡基膜荧光较弱.hCG作用O,3h期间,次 级卵泡基膜处间接免疫荧光清晰,完整,连续.6h 时,卵泡基膜仍较完整,但边界逐渐模糊,卵泡基膜 与白膜之间的膜细胞荧光仍较强(图lA).排卵前 (12h),近卵巢表面的卵泡基膜和卵巢表面上皮下 方基膜的荧光减弱,出现断裂,白膜与卵泡基膜之间 的少量基质细胞仍有较强荧光.基底面卵泡基膜的 荧光比近卵巢面弱,但未见明显不连续(图1B). hCG作用0,12h过程中,颗粒细胞周围一直有弱 荧光. 2,2层粘连蛋白层粘连蛋白的荧光分布与变化 基本与?型胶原相似,颗粒细胞周围LN的间接免 疫荧光比?型胶原的强(图2A,2B). 2,3阴性对照片无荧光(图2B插图). 3,原位杂交观察结果 3,1?型胶原mRNA的表达卵泡壁层的颗粒 细胞?型胶原mRNA的表达在PMSG作用48h后 明显增强,hCG注射0,6h期间逐渐增强,6h达峰 值(图3A),至12h时表达明显减弱(图3B).对照组 表达水平较低.统计结果表明,对照组与0h组,6h 组间,0h组与12h组问,6h组与12h组间差异显 着(尸<O.05);其他各组之间无显着差异(P>O.05) (表1,图4). Vo1.32.No钱晓菁等.小鼠问质胶娘和基膜成分在诱导排卵过程中的变化 卵丘的颗粒细胞?型胶原mRNA表达从hCG 注射O,12h逐渐增加.对照组表达水平较低对照 组与6h组,12h组之间.0h组与12h组之问差异 显着(P<O.05);其他各组间无显着差异(P>0.05) (表1,图4). 3.2MMP2mRNA的表达:卵泡壁层的颗粒 细胞MMP一2mRNA的表达强度从注射开始到12h 逐渐增加,但各组问无显着差异(P>0.05).卵丘颗 粒细胞的表达也呈增加趋势,到12h时表达最强. 统计结果表明,6h组(图5A)与对照组间,12h组 (图5B)与对照,和6h各组问差异显着(P<0.05); 其他各组间无显着差异(尸>O.05)(表2,图6). 3.3阴性对照片无蓝色颗粒(图5B). 表1hCG注射不同时问卵泡壁层和卵丘的颗粒细胞?型腔原原位杂交统计分析 Table1Densitometrlcquantificationanalysisofinsituhybridizationoftypew collagenal(,)mRNAexpressionatdifferenttimeafterbCGinjection ? P<0.o51"~oh.*P<o.O5N6h,#P<0.05~112h(~rP<005vs0h*P<0?05vs6h#P <o?05Vs12h) 表2bCG注射不同时间卵泡壁层和卵丘的颗粒细胞MMP-2原位杂交统计分析 Table2Densltometriequantificationanalysisofinsituhybridizationof MMP一2mRNAexpressionatdifferenttimeafterbCGinjection *P<O05和6h.#P<o.05和12h(*P<20.05vs6h#P<O.05s1zh n1 n120o 宣0.10? 0.0800 0.0600 篓0~4f10 0.0m;厂I广c0612 时间【d叶c) 图4hCG注射不同时问卵泡壁层和卵丘的 颗粒细胞?童胶原原位杂交统计分析 Fig.4Densitometriequantificationanalysisof"situhybridiza— tionoftype?collagenal(?)mRNAexpressioninmembrana granulosa(MG)andcumulusoophorusgranulosa(COG)atdiffer— enttimeafterhCGinjection 讨论 小鼠超排卵实验中,我们观察到IV型胶原mR— NA在壁层颗粒细胞的表达经历了一个由弱到强再 到弱的过程.PMSG作用48h后,?型胶原mRNA 的合成明显增加(P<O.05),hcG作用0,6h期间 ?型胶原的转录一直在增加,到6h达顶峰,以后迅 速下降,12h达最低值,排卵前壁层颗粒细胞中基 O1oDD O?? 主oD 嚣0.0400 O2? O6 ? 图6hCG注射不同时甸卵泡壁层 和卵丘的颗粒细胞MMP一2原位杂交统计分析 Fig6Densitometricquantificationanalysisofinsituhybridiza tionofMMP一2mRNAexpressioninmembranagranulosa(MG) andcumulusoophorusgranulosa(CoG)atdifferenttimeafterhCG injection 本无信号.PMSG/hCG诱导卵泡发育,排卵的过程 中,由于卵泡体积的增大,不断会有新合成的?型胶 原补充到基膜中去.以后随排卵的临近,?型胶原的 mRNA转录下降,合成的?型胶原减少.补充到基 膜的ECM也就相应减少;另外卵泡顶壁的颗粒细 胞也在逐渐脱落,进一步减少顶壁基膜的合成. Murdoch口也检测到排卵前胶原的含量在减少,尤 其顶壁的胶原量降低更明显].这一改变可能与 MMPs的表达密切相关.我们观察到MMP一2mR— 解剖32卷.1期 NA在壁层颗粒细胞的表达随排卵的临近一直在增 加,但未发现明显差异(P>0.05).其他实验中也检 测到排卵前MMP一2的无论是mRNA水平还是酶 活力都在增加,尽管增加的倍数并不多"一方面+ 合成并补充到基膜的?型胶原越来越少.另一方面 降解?型胶原的MMP一2越来越多,卵泡基膜逐渐 减少,尤其是卵泡顶壁,基膜也变得不连续.这与我 们在问接免疫荧光实验中获得的结果一致hCG作 用6h前,基膜处IV型胶原和LN的免疫荧光边界仍 清晰,连续+以后逐渐变模糊,到排卵前,卵泡顶壁的 卵泡基膜之间不连续,卵泡其他部分变化无顶壁明 显在大鼠,猪牛和人等的实验也得到相似的结 果"].这样导致基膜的强度减弱,利于排卵. 我们还观察到排卵前卵泡顶壁外膜层中的问质 胶原明显减少,并出现断裂.这与在大鼠,兔和人卵 巢组织中观察到的一致u'问质胶原含量的减少既 与胶原的台成量下降有关,也与间质胶原酶类降解 胶原纤维的作用增加有关大鼠,兔和人卵巢组织都 发现有间质胶原酶类的活性,尤其是MMP一1.临近 排卵时MMP一1无论从mRNA的转录水平,还是酶 的活力方面都有所升高],提示它可能参加排卵 前间质胶原的降解.也有实验结果显示排卵前降解 卵巢间质胶原的可能是中性粒细胞来源的MMP 8.由于血管通透性增加,中性粒细胞进入卵泡腔,它 分泌的MMP一8参与卵泡壁中I,I型胶原的降 解0 当排卵时,部分细胞外间质蛋白的合成和mR— NA的表达,以及相应的MMPsmRNA的表达在排 卵过程有明显变化,提示部分细胞外问质的台成和 降解对排卵过程可能起重要作用 本文图1A,3B和5A.B见插瞬第12更 图版' 围1注射hCG后卵泡中IV型胶原间接免疫荧光×200 A:6hB:12h 围2注射hOG后卵泡中LN间接免疫荧光分布×200 A:6hB12h右下角为阴性对JfII 图3往射hCG后卵泡中?型腔原mRNA原位杂交X200 A:6hB12h 圉5注射hCG后卵泡中MMP一2mRNA原位杂交×200 A:6hB:12h右下角为阴性对照 Exp]anmionoffigures Fig.1Indirectilnmuflof]uo/'4*~centphotomlerographsoflype? co1]ageninfollicleafterhCGinjection.×200 A.6hB.I2h F.2 F嘻.3 F.5 Indirectimmunof]uoreseentphotomicrographsofLNinfolli— cleafterhCGinjection.×200 A.5hB,l2hinsert[ndieat~negativecontrol Distributionoftype?collagenmRNAinfollicleafterhCG injection.insituhyhridization.X200 A.6hB,12h DistributioaofMMP一2mRNAinfollieleafterhCGinjet— lion—in?hybridization.X200 A,6hB,12hinsertindicatesnegativecontrol 参考文献 [1]LuckMR.Thegonadalextraeellularmatrix口]OxfRevReprod Bio,1994.16(1):35—85. 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