正常兔双眼视网膜电图对比及视网膜缺血再灌注模型的建立

正常兔双眼视网膜电图对比及视网膜缺血再灌注模型的建立 正常兔双眼视网膜电图对比及视网膜缺血 再灌注模型的建立        作者:丁建光～姜德咏～吴荣瀚～唐朝珍～李文生 【摘要】  目的  探讨正常兔双眼ERG有无差异～建立兔视网膜缺血-再灌注的血管结扎模型。方法  20只兔～双眼均行ERG测定后随机分成A、B两组～A组兔10只～均右眼暴露视神经后不结扎。B组兔10只～均左眼视神经结扎60min。分别测定再灌注0h～3h～24h～48h～168h ERG a、b波振幅(aA、bA)值。结果  (1)正常兔左、右眼ERG aA、bA值差异无显著性～但个体之间存在一定差异。(2)未结扎组视网膜缺血-再灌注0h～3h～24h～48h～168h的ERG aA、bA值差异无显著性。(3)结扎后兔ERG aA、bA值均明显下降～再灌注24h最低～后逐渐上升。结论  (1)正常兔双眼ERG差异无显著性～但不同个体间有较大差异。(2)成功地建立了兔视网膜缺血-再灌注的血管结扎模型～发现缺血60min～再灌注24h时视网膜功能受到进一步损伤。     【关键词】  视网膜  缺血-再灌注损伤  视网膜电图  兔     Comparison of ERG in both normal eyes and establishment of experimental retinal ischemia-reperfusion injury model in rabbits     【Abstract】  Objective  To compare electroretinogram(ERG)in both normal eyes and establish a retinal ischemia-reperfusion injury model in rabbits.Methods  20 healthy rabbits were randomly divided into two groups(A～B)after ERG of both eyes.The retinal ischemia in the left eye of 10 rabbits in group B was induced by temporary ligation of the optic nerve for 60min～and a sham procedure was performed on the right eye of 10 rabbits in group A.The amplitudes of a～b-wave of(aA～bA)ERG were recorded at 0～3～24～48～168h of reperfusion.Results  (1)No significant difference was found in aA～bA of ERG between left and right eye in normal rabbits～but difference existed in individuals.(2)No significant difference was found in aA～bA of ERG at 0～3～24～ 48～168h of reperfusion in rabbits served as a non-ischemia control.(3)Both aA and bA were significantly decreased after a ligation.The aA～bA of ERG were decreased to the bottom at 24h of reperfusion～ then gradually increased in the following time.Conclusion  (1)No significant difference is found in ERG between left and right eye in normal rabbits～but difference exists in individuals.(2)A retinal is chemia-reperfusion injury model in rabbits is established successfully.The retinal function aggravated is found at 24h of reperfusion after 60min ischemia.     【Key words】  retina  ischemia-reperfusion injury  electroretinogram  rabbit     视网膜缺血-再灌注损伤是目前研 究的一个热点～由于视网膜缺血-再灌注损伤的机制较为复 杂～因此～通过建立视网膜缺血-再灌注损伤模型～研究其 发生机制以及预防和治疗方法是目前最行之有效的手段。目 前～国外常用的视网膜缺血-再灌注损伤模型有血管结扎模 型和升高眼内压模型,1，4,～本研究以视网膜电图(ERG)为 指标～探讨了正常兔眼ERG以及结扎兔视神经建立视网膜缺 血-再灌注损伤模型的可行性。     1  材料与方法     1.1  实验动物及分组  中南大学湘雅二医院实验动物中心提供的新西兰大白兔20只～体健无眼疾～体重1.8，2.5kg～雌雄不限～双眼均行ERG测定后随机分成A、B两组～A组兔10只～均右眼暴露视神经后不结扎,B组兔10只～均结扎左眼视神经60min。     1.2  正常兔眼视网膜电图的测定  检查前～用脱毛剂脱去兔额正中部体毛～用1%阿托品和10%新福林眼药水交替点眼3次～使其瞳孔充分放大～暗适应40min～自兔耳缘静脉注射3%戊巴妥钠溶液(1ml/kg)麻醉～实验眼充分开睑～置于全视野刺 1激球内中央处正前方～小心遮盖对侧眼～避免一切光刺激～兔眼滴0.5%丁卡因眼药水表麻后～将角膜接触电极放置于角膜表面～参考电极与接地电极分别固定于额正中、耳缘皮肤表面。电生理诊断仪参数:刺激光闪光强度为13.7cd〃m-2〃s～闪光间隔为2″～检测b波通频带为0.1，75Hz～记录波形放大5倍～结果由计算机自动处理分析并打印～记录a、b波振幅(aA、bA)值～检查结束后结膜囊内滴 0.3%氟哌酸眼药水。     1.3  兔视网膜缺血-再灌注损伤模型的制作  麻醉后将兔固定于操作台上～剪除眼睑附近的毛发～结膜囊内滴入0.5%丁卡因眼药水～0.3%氟哌酸眼药水冲洗结膜囊～用经戊二醛器械消毒液浸泡消毒的眼科剪剪开外眦部皮肤至眶缘软骨～沿角膜缘360?剪开球结膜～钝性分离暴露4条直肌～做直肌牵引吊线～自颞上方向眼球后钝性分离～暴露视神经～小心地钝性分离视神经周围的包膜～充分暴露视神经～在眼球后约1.5mm处用0号黑丝线结扎视神经。用直接检眼镜观察眼底～见后极部视盘周围视网膜变白～动脉变细～静脉扩张～血管搏动消失。60min后松开结扎线～10min后用直接检眼镜观察眼底～见后极部视网膜恢复红色～动、静脉管径趋于正常。ERG测定结束后～用5/0丝线缝合球结膜～用3/0丝线缝合外眦部皮肤伤口～结膜囊内滴0.3%氟哌酸眼药水～涂0.5%四环素眼膏～送回兔笼饲养。     1.4  兔视网膜缺血-再灌注期间ERG的测定  兔眼手术后～立即行暗适应30，40min～1%阿托品和10%新福林眼药水交替点眼3次～测定ERG(即再灌注0h)～检查结束结膜囊内滴0.3%氟哌酸眼药水。再灌注 3h～24h～48h～168h ERG测定时～麻醉～散瞳～暗适应同前。     1.5  统计学方法  所有数据均用均数〒差(x〒s)表示～采用SPSS for Windows 10.0统计软件包处理～P,0.05为差异有显著性。     2  结果     2.1  正常兔左、右眼ERG的比较  正常兔左、右眼ERG的aA、bA值未见统计学差异～但个体间差异较大～可以由aA、bA值的最大值、最小值和极差反映出来～见表1。     表1  正常兔左、右眼ERG的aA、bA值  (μV～n=20)     注:aA左眼vs右眼～P,0.198,bA左眼vs右眼～P,0.063     2.2  兔视网膜缺血-再灌注不 同时间ERG的恢复情况  未结扎组各时间段ERG的aA、bA值均无下降～表明手术操作对ERG无影响。结扎60min组aA、bA值在再灌注0h、3h时差异无显著性～24h时aA、bA值均下降～48h又上升～且高于3h水平～168h高于48h水平～见表2。     表2  兔视网膜缺血-再灌注ERG aA、bA值的恢复情况  (x〒s～%～n,10)      注:与同时间段未结扎组比较～?P,0.01,与同组前一时间段比较～P,0.01     3  讨论         & nbsp;目前～研究视网膜缺血-再灌注损伤的动物模型主要有血管结扎模型和升高眼内压模型。血管结扎模型是以尼龙线或丝线将视网膜中央动、静脉～连同视神经一起结扎,1～2,。也有少数学者在手术显微镜下剪开视神经鞘膜～分离出视网膜中央动脉～单独钳夹视网膜中央动脉～但操作复杂,5,。还有少数学者同时结扎双侧颈总动脉造成视网膜缺血,6,。升高眼内压模型是由前房刺入连有灌注瓶的灌注针头～通过 升高灌注瓶～使眼内压超过体循环收缩压或达到一定的数值～造成整个视网膜缺血～该模型由于操作简单而被广泛使用,3～4,。而这两种模型各有其缺点～血管结扎模型由于不能同时结扎后睫状动脉～因此并不能造成整个视网膜完全缺血～外层视网膜仍有血液供应。升高眼内压模型在造成视网膜完全缺血的同时～升高的眼内压对视网膜也造成了严重的损伤～这必然混淆了缺血引起的视网膜的损伤变化。Gehlbach,7,等在用这两种模型诱导猫视网膜缺血-再灌注损伤的研究中发现～缺血相同时间～再灌注390min后～血管结扎模型ERG b波的恢复比升高眼内压模型要高20%，25%。为排除眼内压升高对视网膜的影响～在本研究中笔者选择了兔血管结扎模型进行视网膜缺血-再灌注损伤的研究。     ERG是客观有效地反映视网膜功能变化的一个敏感的指标～正常的ERG反应有赖于视网膜和脉络膜结构的完整性。其中a波起源于感光细胞的内节～反映了光感受器的电活动～是光刺激后发生的最初反应,b波起源于Muller胶质细胞～反映了视网膜内核层区域细胞的电活动。目前～国内外均把ERG作为反映视网膜功能变化的指标。本研究中～笔者通过对正常兔眼ERG的测定发现～正常兔左、右眼的ERG aA、bA值差异无显著性～但个体之间差异较大。 为避免个体差异对实验结果造成的影响～笔者以每只兔的正常ERG为标准～以缺血-再灌注各时间段的ERG数值与之相比所得的结果来反映ERG的变化规律～即以自身对照的方法来消除个体差异对实验结果的影响。     本研究中发现～手术钝性分离暴露视神经对视网膜ERG的aA、bA值无明显影响～说明手术操作对视网膜功能未产生明显影响。结扎视神经后～ERG aA、bA值均明显下降～说明视网膜缺血后其功能受到明显影响。在国外以鼠、猫为实验对象的血管结扎模型中～结扎血管后造成ERG波形熄灭,7，9,。由于鼠、猫的眼底为全血管型～即全部视网膜直接由视网膜中央动脉及睫状动脉血液供给营养～血管位于神经节细胞层～故结扎血管后视网膜缺血较重。兔的眼底为部分血管型～即只有一部 分视网膜有血管供养～血管局限于有髓神经纤维分布的区域～且位置浅～限于神经纤维层～故血管结扎后尚有部分视网膜有血液供应～ERG波形仅表现为下降而并不熄灭,10,。本研究中笔者在结扎血管前后以及再灌注后均用直接检眼镜观察眼底～确认视网膜缺血与再灌注。     在本研究中～缺血后ERG aA、bA值明显下降～再灌注3h～ERG aA、bA值与再灌注0h差异无显 著性～再灌注24h反而下降～提示再灌注期间可能发生了视网膜功能的进一步损伤～再灌注48h又上升～且高于3h水平～再灌注168h～ERG aA、bA值进一步上升～但未能完全恢复。Lam,11,等在鼠升高眼内压模型缺血60min后发现～视网膜DNA电泳与视网膜节细胞层、内核层TUNEL阳性细胞的数量均在再灌注12，18h达到最高水平～48h后明显下降～此时节细胞层、内核层未见TUNEL阳性细胞～表明视网膜缺血-再灌注期间存在神经细胞的凋亡～且很快被清除。而Nonaka,2～12,等发现在鼠血管结扎模型缺血60min后～再灌注24h时视网膜内的白细胞聚集达到最高峰～48h又明显下降。由于白细胞可以与血管内皮细胞黏附～使之激活～激活的血管内皮细胞和中性粒细胞可释放大量化学介质～引起视网膜的损伤。这些研究结果与笔者的结果相符合～进一步支持了缺血60min后再灌注损伤的发生。该视网膜缺血-再灌注损伤的动物模型的建立～为进一步研究其机制奠定了坚实的基础。     【参考文献】     1  Tsujikawa A.Retinal ischemia-reperfusion injury attenuated by blocking of adhesion molecules of vascular endothelium.IOVS～1994～ 40(6):1183-1190.     2 Nonaka A.Administration of 17 beta-estradiol attenuates retinal 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