冰冻切片

冰冻切片 冷冻切片的方法是一种最省时最快速的制片方法。因此主要用于临床手术中的病理诊断上。其原理很简单:冷冻使组织变硬，以代替石蜡做浸蜡。组织中的水分起着浸 蜡的作用，用OCT做包埋剂，将组织固定在冷冻头上，在短时间内冻好，可以立即在冷冻机上进行切片，不需要经过脱蜡，可随时染色，节省了时间。另外，在冷 冻切片的过程中，没有一个步骤使组织接触到任何有机溶剂或其他试剂能溶解或破坏组织中的脂肪、酶以及抗体。因此，冷冻切片也常用于:?显示组织中的脂质和 中性脂肪;?显示酶的活性;?神经组织的染色;?免疫荧光技术。 冷冻切片种类很多，以前有氯乙烷法、二氧化碳法、半导体冷冻法等。这些方法在使用 过程中都存在着一定的难度和不方便，制做出的切片质量也不好，直接影响到诊断。随着医学技术的发展，以上方法已淘汰，现在使用的冷冻切片机(恒冷切片 机)，从根本上解决了不利于切片的难。能更快、更方便地切出较好的切片，而且人为的缺陷也少。 冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断，手术医生根据病理诊断结果决定手术范围，因此做出一些高质量的冷冻切片至关重要。 冷冻切片操作程序: 1.冷冻切片机要始终处于运行状态，即使在不做冷冻切片时也要开着致冷，不能时开时关，以免影响机器寿命。 2.手术取下的新鲜组织不要固定，因固定过的组织不利于切片，而且还会影响染色。 3. 用OCT做包埋剂，起到支撑的作用。先将OCT标在固定头上再将组织放在OCT上，OCT不要太多，以免流到固定头外，组织表面露在OCT外。 4. 外固定头放在冷冻机内的速冷台上，在-25?左右，冻10min，视组织不同而时间略有差异，组织较大或脂肪组织时间可长一些，一般情况下10min左右即 可。如果冷冻不足，则切片可呈粥糜状或切不下来;如果冷冻过分，则切片呈碎悄状或切片上呈条痕状，都得不到良好的切片。 5.高速刀的角度，固定好，切片刀要快。 6. 把冻好的冻头夹到切片机上，用精调修平组织，使其暴露最大切面，将微调刻度调在5μm，放下抗卷板开始切片，得到满意切片后，打开抗卷板，将组织贴在载玻片上。载玻片要放平。动作要稳，一次完成，这样才能将切片完整的贴在载玻片上。 7.切片晾干后用95,乙醇固定10s，水洗后进行常规染色。 8.冷冻切片完成后取下冻头组织，固定后做常规切片。将冷冻机内的组织碎屑清扫干净，定期打开紫外线消毒。 (一)冷冻切片的种类 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 (二)冷冻切片的目的 (1)在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 (2)了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 (3)对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 (4)在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 (5)显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 (6)某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 (7)神经病理学技术中的某些染色法如:Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 (8)对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 (三)冷冻切片的制作方法 (1)低温恒冷箱冷冻切片制作法 1(本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60?左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30?间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。 2(操作方法及步骤: ?取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ?取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ?将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ?调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5,10um间。 ?调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 ?应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如:切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15?左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15,20?左右，切带脂肪的组织时，应调至-25?左右，切含大量的脂肪时，应调至-30?。 3(冰冻切片时的注意事项: ?防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 ?多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 ?放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置， 就不能收到很好的效果。 ?组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 ?当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ?用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。 4(冰冻切片的快速染色法 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。 方法: ? 切片固定30秒,1分钟。 ? 水洗。 ? 染苏木素3,5分钟。 ?分化。 ? 于碱水中返蓝20秒。 ? 伊红染色10,20秒。 ?脱水，透明，中性树胶封固。 冰冻组织1,2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。 冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述