突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠运动神经元上的表达

突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠运动神经元上的达 突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠运 动神经元上的表达 中国临床康复第卷第38朋2006—10—15出版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,October152006Vol0No.38 突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠运动神经元上的表达. 刘娟,臧大维,SurindarCheemao 103 ? 基础研究? 天津市第一中心医院,检验科微生物室,神经内科,天津市30ol92; '墨尔本大学医学院HFI研究所,澳大利亚墨尔本 刘娟,女,1965年生,辽宁省沈阳市人,汉族,1993年北京医科大学 毕业,主管检验师,主要从事微生物及分子生物学研究. 通讯作者:臧大维,博士,副主任医师,天津市第一中心医院神经内科, 天津市30ol92 中田分类号R746.4文献标识码:A文章编号:1671—5926(2006)38—0103—03 收稿日期:2006—03—31修回日期:2006—05—30(06—50—2一l132/W?Y) Expressionofsynaptophysinonmotorneuronsoftransgenic micewithamyotrophiclateralsclerosis LiuJuan',ZangDo.weF,SurindarCheema00 'DepartmentofMicrobiologyLaboratory,DepartmentofNeurology,Tianjin FirstCentralHospital,Tianjin300192,China;HFIInstitute,Melbourne UniversityMedicalCollege,Melbourne,Australia LiuJuan.Laboratorlan?in?charge,DepartmentofMicrobiologyLaboratory, TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300192,China Correspondenceto:ZongDo?wei,Doctor,Associatechiefphysician,De? partmentofNeurology,TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300192, China Received:2006-03—31Accepted:2006一O5—3O A玎:Toevaluatethenumberanddensityofsynaptophysnonmotorneu. rOBSintheanteriorhornoflumbarspinalcordandsensorimotorcortexof thetransgenicmousemodelofamyotrophiclateralsclerosis(ALS). M哐TH0DS:ExperimentwascarriedoutinBranInjuryandRepair Group.HFIInstituteofMelbourneUniversityfromNovember20o3toJune 2004.Transgenicmiceexpressingamutatedhumansuperoxidedismutasel (SOD-1)geneweretakenasALsgroup(n=36),whilethosederivedfrom theB6SJL-TgNgenelineweretakenascontrolgroup(n:36),accordingto thedifferenceofgenderandthreepostnataltimepoints(postnatal60,9O, and120days).twelvemiceofeithergenderwereallocatedineachsubgroup. ?Fluorogoldlabelingwasusedforthemotorneuronsinthelumbarand sensorimotorcortex;?Immunofluorescencewasappliedforthelabelingof synaptophysinboutons;Positivecontrolsectionswererepresentedby addingthesynaptophysinantibodyandthestaining,showingapositivere— suit.Fornegativecontrols.thesynaptophysinantibodywasomitted.? Stereologicalcountingsyrstemwasadoptedinthestatisticalanalysis. RESULTS:?Fluomgoldlabelingofmotorneurons:Themotorneuronsin thelumbarandsensorimotorcortexwereclearlylabeledbyfluorogoldan— derthedetectionoffluorescentmicroscope.?Thenumberofsynapto. physinonthemotorneurons:Thenumberstatisticallydecreasedatthemid stage(postnatal90days)andlatestage(postnatal120days)[motorneuron somasatlumbarspinalcord:(0.75?O.06),(0.59?0.09)/Ixm;motorneuron dendriteatlumbarspinalcord:(0.7l?O.06),(0.55~0.03)/Ixm;motorneuron sonla8atsensorimotorcortex:(0.79?O.03),f0.63?O.08)/Ixm;motorneuron dendriteatsensorimotorcortex:(0.76?O.07),(0.6l?O.08)/Ixm,P<0.0l】. Thereductionofsynaptophysinwasparallelbetweenthegenderdiffer— ences. CONCLUSION:Lossofsynaptophysinonmotorneuronsisdirectedwith theprogressionofALS. LjuJ.ZangDW.SufindarCExpressionofsynaptophysinonmotorneuronsof transgenicmicewithamyotrophiclateralsclerosis.n鲳?LinchuangKan#u 2006;1ol381.1O3—5IChin0l 刘娟.臧大维,SurindarCheema突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因小鼠运动神经 元上的表达Ul_中国临床康复,2006,10(381:103-51wwwzglck'fcoml 摘要 目的:评估肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脊髓前角和大脑运动皮质运动 神经元上的突触蛋白在不同疾病阶段的数量变化. 方法:实验于20o3—1l/2004—06在墨尔本大学HFI研究所脑损伤与修 复组完成.表达突变人类超氧化物歧化酶1基因的转基因小鼠36只(肌 萎缩侧索硬化组),以及表达B6SJL基因的正常小鼠36只(对照组),两组 分别按性别及出生后6O,9O及120d随机分为每个时问点12只,雌雄 各半.?采用荧光金标记法标记腰段脊髓及皮层的运动神经元.?采用 免疫荧光方法标记突触蛋白,阳性对照为加人突触蛋白抗体并有阳性表 达;阴性对照省略此抗体.?采用共焦计数系统计数并行统计学分析. 结果:荧光金标记的运动神经元:经荧光显微镜检查确定腰段脊髓及皮 层的运动神经元均被荧光金清楚地标记.?运动神经元的突触蛋白计数: 在疾病中期出生后90d及后期出生后120d,运动神经元上的突触蛋白 的数量呈显着性降低(腰段脊髓细胞体:(0.75~0.06),(0.59~0.09)/Ixm; 腰段脊髓树突:(0.71?O.06)(0.55~0.03)/Ixm;大脑皮层运动神经元细 胞体:(0.79~0.03),(0.63~0.08)/Ixm;大脑皮层运动神经元树突:(0.76 ?0.07),(0.61?O.08)/Ixm,P<0.O1);同组别雌雄对照差异无显着性. 结论:肌萎缩侧索硬化运动神经元突触蛋白数量的降低与疾病及病程 的进展有直接关系. 主题词:突触蛋白类;肌萎缩侧索硬化;运动神经元;小鼠 0引言 肌萎缩侧索硬化是运动神经元病的一种常见类 型,累及上,下运动神经元系统.磁共振波谱分析已经 证实,肌萎缩侧索硬化患者在脊髓,脑干,皮层等处的 运动神经元存在神经变性改变『li.至今,国内外学者已 经作了大量的患者及动物实验,但神经元变性的确切 机制仍不清楚.目前在国际上公认的研究肌萎缩侧索 硬化的动物模型是转基因SOD1嘞?小鼠模型[21.突触 蛋白特征性地存在于中枢神经和周围神经系统的突触 前膜,已经被证实在突触的形成中充当重要的角色,同 时间接控制其他与突触功能有关的递质功能p0,神经 系统功能的改变通常伴随着突触蛋白的变化I.本实 验通过检测突触蛋白在不同疾病阶段的改变,进一步 明确肌萎缩侧索硬化的发病机制,寻找新的评估此病 发展程度及治疗效果的方法. l和方法 设计:随机对照动物实验. 单位:墨尔本大学HFI研究所脑损伤与修复组. 材料:实验于2003—11/2004—06在墨尔本大学 HFI研究所脑损伤与修复组完成.起源于B6SJL-TgN (SOD1一G93A),表达突变人类超氧化物歧化酶1基因 的转基因小鼠36只(肌萎缩侧索硬化组),由美国 Jackso.n实验室获得,所有小鼠实验前均经过基因型检 测及筛选,基因突变完全一致,以及表达B6SJL基因的 正常小鼠36只(对照组),两组分别按性别及出生后 60,90及120d随机分为每个时间点12只,雌雄各 半,见表1. 104 表1实验动物的数量及分组 ISSN167I一5926CN2I一1470/R "m:~Omkf23385083@sina.com刘娟,等突触蛋白在肌萎缩侧索硬化转基因/J\鼠运 动神经元上的表达 设计,实施,评估者:为全部作者,均经过正规实 验培训. 方法: 切片制备:对照组及肌萎缩侧索硬化组小鼠分别 于出生后57,87及117d,经腓肠肌或颈髓注射5L 荧光金,标记腰段脊髓及皮质的运动神经元.于第60, 90和120天腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后室温灌注生 理盐水,随后灌注40L多聚甲醛,分离脑及腰段脊 髓,用相同固定液固定24h,随后用300g/L糖溶液脱 水24h,石蜡包埋,连续切片,厚8m,每隔5片取3 片,2套用于synaptophysin免疫荧光实验,另一套部分 用于阳性对照,部分用于阴性对照.阳性对照为加入 突触蛋白抗体并有阳性表达;阴性对照省略此抗体. 免疫荧光实验:切片常规脱蜡,洗净,然后采用 MOMImmunodetection试剂盒(FMK一2201;Vector Laboratories,Burlingame,CA),步骤如下:放入MOM 鼠Ig阻断剂;1h后清洗并加入MOM稀释液;5min 后清洗,加入鼠抗synaptophysin单克隆抗体(MAB368, Chemicon,Temecula,CA,稀释1:2o00),4?冰箱内 保存过夜,阴性对照省略此抗体;第2天清洗后加入 MOMbiotinylated抗鼠IgG试剂;1h后清洗加入荧光 蛋白DCS;30min后充分清洗,干燥,封固. 计数方法:共焦计数系统对结果进行分析,每个 切片选10个同时被荧光金及synaptophysin标记良好 的运动神经元,计数突触蛋白数量及其密度. 主要观察指标:?荧光金标记的运动神经元.? 运动神经元的突触蛋白计数. 统计学分析:各组数据均采用Prism软件处理,进 行非配对t一检验及单因素方差分析及Tukey'Spost. hoc检验,数值以~_-ts表示,P<0.05时认为差异具有 显着性意义. 2结果 2.1实验动物数量分析实验选择小鼠72只,分为 两组,进入结果分析72只. 2.2荧光金标记的运动神经元荧光金注射3d后, 检测发现所有小鼠在脊髓和大脑皮质的运动神经元 均被荧光金清楚地标记,免疫荧光Synaptophysin表达 清楚. 2_3运动神经元的突触蛋白计数对脊髓和大脑皮 层运动神经元的细胞体及树突上的突触蛋白进行了 立体共焦计数.在疾病的初发出生后60d阶段,肌萎 缩侧索硬化组与对照组进行比较,在上述部位均未检 测到统计学差异(P>0.05).在疾病中期出生后90d 阶段,在肌萎缩侧索硬化组小鼠脊髓和大脑皮层的 细胞体及树突分别检测到突触蛋白计数降低14%及 17%(细胞体)和17%及22%(树突),具有统计学意义(P <0.01).在疾病后期出生后120d阶段,在肌萎缩侧 索硬化组小鼠脊髓和大脑皮层的细胞体及树突分别 检测到突触蛋白计数进一步明显降低,分别为33% 及38%(细胞体)和41%及36%(树突),具有统计学意 义(P<0.01),同时与出生后90d肌萎缩侧索硬化组 比较差异亦有显着性意义.见表2,3.同组别雌雄组对 照未发现显着性差异. 表2脊髓运动神经元细胞体及树突的突触蛋白计数'/m) 600.88+0.090.86i0.020.85~0.050.84~0.07 900.88~0.030.75?0.O0.86~0.030.7liO.06 1200.88~0.020.59~0.O0.86iO.050.55iO.03 与对照组比较.P<0.0l:与出生后90d比较..<0.01 表3大脑皮层运动神经元细胞体及树突的突触蛋白计数/m) 与对照组比较,<0.01;与出生后90d比较.P<0.0 3讨论 肌萎缩侧索硬化的发病机制目前还不明确,现在 已有的学说包括:铜/锌超氧化物歧花酶基因突变,氧 化应激,兴奋性氨基酸介导的神经毒性,神经营养因 子缺乏,重金属中毒,免疫或病毒感染,细胞凋亡等等, 但其确切机制尚不清楚. 运动神经元的损害可能是由于运动神经元突触的 信号传递受到影响,累及其功能,最后出现神经元变 性,死亡,从而出现一系列临床症状和体征151.如果突 触信号传递受到影响,最可能的原因就是突触膜蛋白 随疾病的发生及进展而受到影响『3,. 转基因SOD1??小鼠模型是目前国际上最广 泛应用的研究肌萎缩侧索硬化的动物模型,因为此动 物模型价格昂贵,要求技术水平高,目前在国内还没 有得到应用,因此国内在此方面的研究远远落后于西 方国家.此动物模型表达了人类突变的超氧化物歧化 酶1基因,Gly—Ala,高表达TgN(SOD1一G93A)G1H, 由美国Jackson实验室(BarHarbor,ME)最早成功建 立,为肌萎缩侧索硬化及其他神经变性病的研究创造 了非常可靠的平台. 本实验通过对事先用荧光金标记的神经元的突触 ISSN1671—5926CN21—1470/Rt屁中国临床康复2006年10月15kl第10卷第38 期 蛋白在不同发病阶段的对照检测,明确了在疾病不同 阶段时运动神经元受到的损害及突触蛋白随病情发 展而受到的影响,为了解神经元损害的机制提供了客 观可靠的证据Synaptophysin存在于中枢神经系统的 突触前膜,其免疫荧光染色已被证明是能非常准确地 反映突触前膜蛋白的一种有效的方法l8】,应用此方法, Masliah对患有轻,中,重度Alzheimer's病的患者进行 了尸检研究,发现此蛋白在轻度Alzheimer's病的患者 有25%的丢失,中,重度患者有更进一步的降低19].有个 例报道,在肌萎缩侧索硬化患者尸检中发现其脊髓前 角运动神经元的突触前膜蛋白数量降低【l0】.迄今为止, 还没有针对肌萎缩侧索硬化疾病突触蛋白数的系统 性检测报道,本实验采用了目前国际上最先进的共焦 计数系统,对此进行了客观系统的研究. 在生后60d,尚属于疾病前期的肌萎缩侧索硬化 组小鼠脊髓及大脑皮层的运动神经元,突触蛋白数量 与对照组比较,差异无显着性.在生后90d属疾病中 期的肌萎缩侧索硬化组,突触蛋白数量与对照组比较, 差异有显着性.在生后120d属于疾病后期的肌萎缩 侧索硬化组,出现进一步的加重,突触蛋白丢失的机 制目前尚不清楚,可能与病理状态下膜的完整性被损 坏有关【ll1'Renshaw细胞可能也与其丢失有直接或间 接的关系,还需要进一步的实验加以明确.另外,Fis. cher等【l21曾报道,此动物模型肌萎缩侧索硬化组小鼠 在生后10od才开始出现运动神经元的丢失.因此可 以从中清楚地发现此病的病理顺序,即早在运动神经 元死亡之前,突触蛋白就已经受到了影响,并因此引 发了一系列神经功能障碍和临床表现.Frick及其同事 105 Fernandez等I'"发现,通过物理治疗或其他方法干预, 能够减缓突触蛋白的丢失速度. 综上所述,本实验的新发现其意义不仅在于进一 步明确了此病的发病机制,同时也为临床对此病的早 期治疗提供了理论根据及新的治疗靶点,未来临床治 疗应集中在缓解和改善突触蛋白的丢失及其功能的恢 复. 4参考文献 lKalraS.AmoldDLCashmanNR.Biologicalmarkersinthediagnosisand treatmentofALs.JNeurofSci1999;165(Suppl11p:$27—32 2GurneyME.Transgenicanimalmodelsoffamilialamyotrophiclateralsclero— sis.JNeurol1997;244(Supp121p:S15—20 3TarsaL,GodaYSynaptophysinregulatesactivity?dependentsynapseforma- tioninculturedhippocampalneuronsProcNatlAcadSciUSA2002;99(2): 1012—6 4FrickKM,FernandezSMEnrichmentenhancesspatialmemoryandincreases synaptophysinlevelsinagedfemalemice.NeurobiolAng2003;24(4):615— 26 5ZangDW,CheemaSS.Degenerationofcorticospinalandbulbospinatsystems inthesuperoxidedismutase1fG93AG1H1transgenicmousemodeloffamitial amyotrophiclateralsclerosis.NeuroscLett2o02;332(2):99—102 6EvansGJ,CousinMA.Tyrosinephosphorylationofsynaptophysininsynaptic vesiclerecyclingBiochemSocTram2005;33(Pt61:l350—3 7ChiuA.ZhaiP.DailCantoMC.eto1.Age-dependentpenetranceofdiseasein atransgenicmousemodeloffamilialamyotrophiclateralsclerosisMolCell Neuroscl995;6:349—62 8WalaasSI,JahnR,GreengardP.Quantitationofnerveterminalpopulations: synapticvesicle-associatedproteinsasmarkersforsynaptiedensityintherat neostriatum.Synapse1988;2(5):5l6—20 9MasliahE,MalloryM,AlfordM,eto1.Alteredexpressionofsynapticproteins occursearlyduringprogressionofAlzheimer'sdiseaseNeurology2001;56(1): l27-9 10lkemotoA,AkiguchiI,HiranoA.Differentialexpressionbetweensynaptic vesicleproteinsandpresynapticplasmamembraneproteinsintheanterior hornofamyotrophiclateralscterosis.ActaNeuropatholfBerll2002;103(2): 179-87 11HimedaMizunoK.ArakiTEffectsofageonimmunohistochemical changesinthemousehippocampus.MechAgeingDev2005;126(6--7):673—7 12FischerLR.TennantP.DavisAA.etolAmyotrophiclateralsclerosisisa distalaxonopathy:evidenceinmiceandman.ExpNeurol2004;185(2):232—40 13FrickKM.FernandezSM.ButinskiSC.Estrogenreplacementimprovesspati~ referencememoryandincreaseshippocampatsynaptophysininagedfemale mice.Neuroscie//~e2002:115(2):547—58 i龙譬教匠誊亩志罢差嚣丰莫篓嘉墨所{IIt4~j李. 强医学博士副一一-医师曼篓警军第医院南京军区文翥至磊辜辜写环境科学学院: 十品榭署越由Ji\…m一t :竺圭l师+譬.三干房陆立鹤医学硕士讲师军:j竺三圭专妻跫妻:磊茎辜嚣圭荔磊 二人民医院骨三科::竺研究墨妻墼院毒物药物研究所rzl一~'T" 茎辜嚣圭究蓄础研究所::妻繁圭:鬈曼 .睦吕学敏甚辜蔷圭.;:耋耋譬圭熹l师 抽刊三茎辜蔷圭三高吴;.::竺 l绿标兰圭主治医要经外科磊茎辜嚣圭副主任医萎辜第二医院骨外科:~T 漫,ta~..--/r医学博士教授浙江大学医学院解剖学教研室1_一q'X………… 一…….T { T承茎嚣圭教鬟肇嚣云妻墨芸;刘承宜医学博士教授华南师范大学激光运动医学 实验室; ;圭鍪,翼罾奎董学在本月审稿工作中.本刊执行编委针对每篇文章的科研设.{I-j德 兰圭篓星譬 +计,';;:'的,:;;譬圭誉变差星术系'; T,0TT-;冀圭研究墨究所磊蓄 时:茹,';誉苎圭篓譬苎兰氅:'; ,]x-~ . 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