应用捕获ELISA法检测人巨细胞病素特异性IgM抗体的研究

应用捕获ELISA法检测人巨细胞病素特异性IgM抗体的研究 摘要 应用捕获 EL ISA 法检测人巨细胞病毒感染者血清特异性 IgM 抗体 。通过与间接 EL ISA 法 对 47 例临床标体的检测比较 ,该法灵敏度及特异性均高于间接法 ,且不受 R F 的影响 。试验明 , CMV IgM 捕获法特异敏感 、简便 、快速 、重复性好 。CMV IgM 捕获法试剂的研制成功 ,将为血清 学的检测 、流行病学的调查及临床诊断等提供可靠的科学诊断依据 ,有助于优生及优育 。 ( )捕获 EL ISA 法IgM 抗体关键词 巨细胞病毒 CMV 1 ( ) 巨细胞病毒 CMV属疱疹病毒科,CMV 种类 61 包被板的制备 :按常规包被法进行 。 71 血清样品检测 :很多 , 分 布 广 泛 , 婴 儿 先 天 性 CMV 感 染 发 生 率 为 2 ( 取出预包被板 ,按检测顺序编号 设空白对照 1 0152210 %,妇女怀孕早期巨细胞感染是引起先天 3 ) 孔,各孔加入相应血清 50ul ,37 ?温育 30 min ,弃去 性感染和先天性缺陷的重要原因,而判断巨细胞感 孔内液体 ,用 PB S T 洗板 36 遍 ,然后拍干 ;除空白对 染的一个重要依据是巨细胞病毒特异性 IgM 抗体的 () (照外 ,每孔滴加结合物 1 滴 或 50ul为特异性抗原 被检出 。因为 IgM 为抗原刺激机体后最早出现的抗 ) 和特异性抗体的混合物37 ?温育 30 min ;弃去孔内 体 ,且半衰期较短 ,血清内若出现特异性 IgM 抗体 , 4 液体 ,用 PB S T 洗板 5 遍 ,然后折干 ,各孔加入 TMB 表示有近期感染,病毒在体内复制 。而目前临床使 用的检测试剂盒基本是间接法 ,由于间接法易受 RF 底物 A 、B 各 1 滴 , 置 37 ?温 育 10 min 加 入 2N 因子影响 ,且灵敏度 、特异性不理想 ,因此我们根据 HSO50ul 终止反应 ,于 450 nm 波长下 ,用空白孔调 2 4 “抗人 IgM 链包被固相载体 + 被检血清 + 特异性抗 零 ,读取各孔 OD 值 。以 > 211 阴性平均值为阳性 。 原 + 酶标记特异性单克隆抗体 + 底物液显色”捕获 ( )Cot toff = 01084 EL ISA 法的原理研究检测 CMV 感染患者血清中特 81 特异性抗原及酶标记单克隆抗体浓度的确定 :异性 IgM 抗体 ,以达到建立一种灵敏度高 、特异性强 且不受 RF 因子干扰的检测方法 ,通过与间接 EL ISA 用特异性抗原按递度 1 ?200 ,1 ?400 ,1 ?800 , 1 ? 法的比较 ,得到了满意的结果 ,现报道如下 1000 ,1?1500 用 0105M P H916Cb 稀释后 100/ 孔包 被 PS 板 。4 ? 过 夜 , 次 日 甩 去 液 体 , 用 10 % B SA0101M PBB 液封闭 ,37 ?2 h ; 甩去液体 ,用 PB2 材料与方法 S T 洗板一次 ,拍干设空白对照 1 孔 ,将酶标记的单 μ克隆抗体按 1?200 、1?400 、1?800 、1?1000 、1?1500 稀 11 抗人 IgM 链抗体 、巨细胞病毒特异性抗原和巨 细胞病毒单克隆抗体 。北京美迪科生物技术有 释 ,按棋盘滴定 ,以 OD 值为 110 左右为最佳工作浓 限公司应用物生技术室提供 : 度 ,经确 定 , 抗 原 浓 度 为 1 ?800 , 酶 标 记 浓 度 为 1 ;21 参照标本 :阳性血清 20 份 ,弱阳性血清 12 份 ,阴 1000 ,两者按工作浓度用 0101M P H714 PB S 稀释在 ()性血清 20 份 用进口试剂筛选 一起即为结合物 。 31 间接 EL ISA 法试剂均由北京美迪科生物技术有结果 限公司提供 ,做法参照试剂盒中说明书 : μ( 41 被检血清 :来自安医大附院 用意大利进口试剂 11 抗人 IgM 链包被浓度的确定 : )μ 捕获法试剂初筛 抗人 IgM链按递度稀 释 后 100ul/ 孔 包 被 PS ()5 51 酶标抗体的制备 :采用改良过碘酸钠法标记 微孔板 ,用以确定的结合物对阳性 ,弱阳性 ,阴性参 μ 表 6CM V - IgM 检测的二种方法的比较 照标本进行检测 ,实验结果表明抗人 IgM链的包 捕获法 间接法 被浓度为 1?1000 合适 。标本数 阳性 阴性 阳性 阴性 21 特异性 : 47 例 2 例 例 例 例 45 3 44 211 用本试剂检出的阳性 ,用马抗人 IgM 进行阻 均 < 0 . 084 均 < 0 . 084 0 . 843 0 . 213 断实验 ,阻断率大于 50 % ,可知本法特异 。 OD 值 0 . 186 0 . 679 0 . 144 212 交叉实验 :试验室拟用以知阳性标本混在美迪 ( )2 种方法阳性编号为 :24 、33 、间接法中另一例阳性编号为 :45 ( ) 科公司肝炎参比试验室 中澳合作, TO RCH 试验 讨论 室提供的乙肝 、甲肝 、RV 、HSV IgM 阳性血清中 ,经 检测 ,除混入标本为阳性外 ,其余标本均为阴性 ,与 捕获法最早是 1977 年 Price 用来测定抗肺炎支 ()预期结果符合率为 100 % 。见表 1 原菌 IgM , 随后 Flehning 和 duer meyer 等用其测定 表 1 CM V2IgM 捕获法检测的特异性( 均为 2 孔平 甲型肝炎的特异性 IgM ,并与传统的密度离心法比 均值) 较 ,符合率 100 % ,近年应用捕获法检测其他病毒屡 6 7 8 9RV IgM HSV IgM 乙肝 IgM 甲肝 IgM , 是 因 其 优 点 是 间 接 法 无 法 替 代见报 道 血清 血清血清 血清 混入血清 ( )( )( )( )5 份 5 份 5 份5 份 的 。间接法易受类风湿因子及特异性 IgM 的影响 ; 巨细胞 病毒 IgM 检11012 均 < 01084均 < 01084均 < 01084均 < 01084 R F 是一种抗变性 Ig G 的抗体 ,无种属特性 ,它能和 测 与预期 变性 、聚合或与抗原结合的 Ig G 发 生 凝 集 , 不 与 正 符合率 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 常的 Ig G 发 生 反 应 , 间 接 法 中 , 血 清 中 特 异 的 Ig G 31 灵敏度 与包被的特异性抗原结合 ,而后与 R F 反应造成假 10 把已确定的阳性参照标本用 0101M P H714 PB S,同时 ,特异性的 Ig G 与 IgM 竞争结合特异 阳性 11 进行倍比稀释后检测 ,其结果见表 2 :性抗原,以及易受人体象疫球蛋白影响而必须稀 12 释标本,故造成间接法的灵敏度不高 ,而捕获法 表 2 CM V2IgM 捕获法检测的灵敏度 μ 是利用抗人 IgM链直接从被检血清中捕获 IgM , 血清 原液 1/ 64 1/ 128 1/ 256 1/ 512 1/ 10241/ 20481/ 40961/ 8192然后才进行特异性的鉴定 ,这样避免了上述间接法 滴度 中影响因素的影响 ,在捕获法中 ,笔者认为主要决定 OD 值1112111014 01745 01632 01487 0131 01212 01186 01062 因素在单克隆抗体 ,单克隆抗体的特异决定与它相 由表 3 可知 ,当稀释度为 1 ?4096 时 ,仍可判断 连抗原的特异 ,从而决定了检出的 IgM 的特异 。这 样即使原纯度差一些 ,也不会太大影响结果而 ,间接 为阳性 ,而间接法只能检测到 1?512 的稀释度 ,可见 法中则是直接的影响因素 。 捕着法灵敏较高 。 PCR 法是最根本 、直接 、准确的方法 ,但由于其 41 稳定性 : 成本较高 ,对实验室及实验员的要求比较高而不易 按卫 生 部 的 考 察 要 求 , 将 整 套 试 剂 置 37 ?三 普及 ,随着全民素质的提高 ,优生优育以尤为重要 ,天 ,经平衡后与 4 ?试剂对照实验 ,其结果阳性 CV 巨细胞 IgM 捕获法的建立 ,将为临床巨细胞病毒的 = 716 % ,弱阳性 CV = 1311 % , CV 均在 15 %以内 , 检测提供一个科学的 、可靠的诊断依据 。 故本试剂盒稳定性好 ,且从阳性参照标本来看 ,几次 参考文献 结果相近 ,可知试剂重复性也很好 。 51 R F 因子的影响 : 任何检测 IgM 的试剂盒都应考虑类风湿因子1 黄祯详 ,医学病毒学基础及实验技术 ,科学出版社 ;1990 . 2 Anilo rsk ,国外医学流行病传染病分册 1 期 ;1985 . ( ) ( R F的影响 。本试剂盒对 10 份类风湿血清 用乳 ( ) 3 邓锡等 ,实验和临床病毒学杂志 ,48 ,3 1,1989 . ) 胶法测出进行检测 ,其结果均为阴性 ,可见本度剂 4 邵惠训 ,病毒性感染快速诊断 ,北京科学技术研究院北京生 ( )化免疫制剂中心 现北京美迪科生物技术有限公司 盒几乎不受 R F 的影响 。 5 沈关心 ,周汝麟等 ,现代免疫学实验技术 ,湖北科学技术出版 61 捕区法 EL ISA 、间接 EL ISA 对临床标本检测的社 ;1998 . ( ) 朱托夫 ,张礼壁 ,Chinese Jo urnal of virology 2,1989 . 6 的比较( ) 7 刘洪等 ,中华医学检验杂志 ,221 :14 41991 . 由表 6 可知捕获法准确 ,间接法中多出一 ( ) 张国新 ,中华医学检验杂志 ,353 :12 6,1989 . 8 ( ) 9 例阳性 ,经证实为非特异性造成的假阳性 。且同一 张国成 ,中华医学检验杂志 ,164 :14 3,1991 . 10 Ender G ,etal ,J Med virol 337 :19 ,1986 . 份阳性 ,间接法测定的 OD 值远远小于捕获法的测( ) 11 Eehevarria J M ,etal . J clin Micro biol 423 :22 3,1985 . ( ) 12 王京杭 ,上海医学检验杂志 ,48 :8 1,1993 定值 。可知灵敏度不如捕获法 。 77