【doc】高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5—羟色胺
高效液相色谱,电化学检测法测定大鼠下
丘脑的组胺和5—羟色胺 第23卷第6期
2004年11月
分析测试
FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)
Vo1.23No.6
36,39
-__-一
Cj
同效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的
组胺和5.羟色胺
李伟荣,黄天来,王宁生
(广州中医药大学临床药理研究所,广东广州510405)
摘要:采用高效液相电化学检测的方法测定了大鼠下丘脑内组胺和5.羟色胺.色谱柱为NUCLEOSILC18(250
10um),流动相:磷酸二氢钠溶液(25nmlol/L,内含乙二胺四乙酸二钠0.5nunol/L,辛烷磺酸钠3
mmol/L,pH4.8)一乙腈=100:14(体积比),流速0.8mL/min,检测电位0.6V.大鼠下丘脑匀浆液经低温高速
离心,上清液直接进样测定5一羟色胺,另取上清液衍生后进样测定组胺.组胺在
1.8t~g/mL,5羟色胺 0.075,
在0.0625,1.25g/mL浓度范围内,线性关系良好.组胺测定的日内和日间相对
偏差分~J14,于1.0%和
11.4%,5一羟色胺测定的日内和日间相对标准偏差分别小于3.4%和6.3%,两者回收率分别为94.1%,102.3%
和72.8%,89.1%.正常雄性sD大鼠下丘脑内组胺和5一羟色胺的平均含量分别
为0.280?0.029t~g/mL和
0.224?0.068fzg/mL.本法简便,准确,快捷,可用于大鼠下丘脑内组胺和5一羟色胺
的测定.
,关键词:高效液相色谱;柱前衍生化;电化学检测;组胺;5一羟色胺
.中图分类号:0657.72;R338.27文献标识码:A文章编号:1004—4957(2004)06—
0036—04
DeterminationofHistamineand5一HydroxytryptamineinRatsHypothalamus
bvHPLC—ECD
LIWei—rang,HUANGTian—lai,WANGNing-sheng
【InstituteofClinicalPharmacology,GuangzhouUniversityofTCM,Guangzhou510405,China)
Abstract:Ahighperformanceliquidchromatograph(HPLC)withanelectrochemicaldetector(ECD)andaNU—
CLEOSILCl8column(250nlInx4nllyl,i.d.10ym)wasusedforthedeterminationofhistamine(HA)and
5一hydmxytryptamine(5一
HT)inratshypothalamus.ThemobilephasewasamixtureofNail2PO4(25nunol/L containing0.5nunol/LdisodiumEDTAand3nunol/Lsodium1-octanesuffonateatpH4.8)andacetonitrilein
aratioof100:14(byvolume).Theflowratewas0.8mL/min.andthedetectorvoltagewassetat0.6V.
Thehomogenateofratshypothalamuswascentrifugedat4oC.Apartofthesupematantfractionwasinjected
forthedirectdeterminationof5一
HT.andanotherpartofthesupematantwasallowedtoreactwithaderivatiz~ tionreagentbeforetheanalysisofHA.Goodlinearitywasfoundintherangeof0.075,
1.8ftg/mLforHA
and0.0625,1.25ftg/mLfor5一HT.Thewithin—dayandintra—
dayRSDsofthemethodwere?1.0%and
l1.4%forHA,and?3.4%and6.3%for5一HT,respectively.TherecoveriesofHAand5一HTwere
94.1%,102.3%and72.8%,89.1%.respectively.TheaveragecontentsofHAand5HTinhypothala
BUSofnormalmaleSprague—Dawleyratswere0.28040.029ftg/mLand0.224?0.068~g/mL.
respec—
tively.Themethodissimple,accurateandrapid,andcanbeusedforthedeterminationofHAan
d5一HT
inratshypothalamus.
Keywords:HPLC;Pre—columnderivatization;Electrochemicaldetection;Histamine:5
一Hydmxytryptamine
组胺(hist扪ine,HA)~I5一羟色胺(5一hydmxytryptamine,5一HT)同属单胺类神经递质,参与多种生理病理
活动过程,如对睡眠,摄食,体温,精神情感性疾病的调节.但二者在脑内的含量极低,如何准确测定
脑内HA和5一HT的含量,对于神经科学的研究具有很重要的意义. 涉及}IA,5一HT检测的报道有很多,检测方法也多种多样,如荧光分析法,气相色谱法,液相
色谱法等,目前应用最广泛的是液相色谱法.HA在化学上属咪唑类,作为原始态的胺,不能直接
收稿日期:2003—10—29;修回日期:2004—07—22
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(980644)
作者简介:李伟荣(1975一),男,江西宜丰人,博士;王宁生,联系人
第6期李伟荣等:高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5.羟色胺 进行荧光或电化学检测,须经衍生化反应以后才在电化学检测器(ECD)上有响应.过去测定HA较多的
生物样品是血液,胃肠组织,腐败生物体等,而脑中HA的测定不多.在HA测定过程
中较常采用的衍
生试剂是邻苯二甲醛(OPA)一硫醇类,但存在衍生试剂易失效,衍生产物不稳定等不足之处.Jacobs_7
曾报道用亚硫酸盐代替硫醇试剂可使OPA与伯胺化合物生成N.烷基.异吲哚磺酸盐衍生物,生成物无
味,稳定,具有电化学活性.以前用此法测定的都是一些氨基酸类,尚未见用于HA的测定.本实验
采用OPA一亚硫酸钠作为衍生试剂,对大鼠下丘脑匀浆上清液内的HA进行柱前衍生后进样分析,效果
优于OPA一硫醇类衍生试剂.5.HT属吲哚胺类化合物,电活性高,它的检测大多可使用ECD直接检
测,但需要注意5HT见光易分解,测定应及时,低温,避光.HA,5.HT结构如图1. 1实验部分
1.1仪器
Waters510高效液相色谱仪(美国Waters公司),Baseline810 色谱工作站(美国Waters公司),HP1049A电化学检测器(美国
安捷伦公司),RC5C高速低温离心机(美国杜邦公司),PHS2C 精密酸度计(上海理达仪器厂).
1.2动物与试剂
H0
5-羟色胺
5一HT
图1HA,5-HT结构图
Fig.1ThestructuresofHAand5-HT sD大鼠,舍,体重250?20g(广东省医学实验动物中心提供,合格证号2002A024),HA(美国Sigma公
司,批号042K5017),5.rrr(美国Sigma公司,批号121K7059),OPA(美国Sigma公司,批号052K5002),乙腈
(美国天地公司),辛烷磺酸钠(广州艺能色谱材料厂),其余试剂均为市售分析纯,实
验用水为三蒸水.
1.3标准溶液配制
精密称取HA约1.2mg,5.HT约1.0nag,分别用1mL三蒸水溶解,配成1.2mg/mL的HA储备液和
1.0mg/mL的5.HT储备液,分装后于一30c【=冻存.
1.4衍生试剂配制
精密吸取100LOPA溶液(1mg/mL),加入6L亚硫酸钠溶液(1mol/L),涡旋混匀,当日配制,当
日使用.
1.5衍生化反应
反应于室温下进行.吸取HA标准品溶液或样品溶液50L置聚乙烯管中,加入衍生试剂10L,
涡旋10s,反应1rain后置冰浴中终止反应,进样50L.
1.6色谱条件
色谱柱:NUCLEOSILCI8(250mill×4l砌10m,德国MACHEREY—NAGEL公司,批号901034);流动
相:磷酸二氢钠溶液(25mmol/L,内含乙二胺四乙酸二钠0.5mmol/L,辛烷磺酸钠3rnm0l/IJ,pH4.8)一乙
腈=100:14(体积比),用前经0.45/.tm滤膜真空抽滤,流速0.8mL/min;玻碳工作电极,Ag/AgCl参比
电极,检测电位0.6V;实验在室温下进行.
1.7样品采集与处理
sD大鼠断头,于冰浴下迅速分离出下丘脑,称重,置玻璃匀浆器中,按一定比例(0.5mL/100mg)]JH
入2%三氯乙酸溶液(预冷至4c【=),温和匀浆,匀浆液用吸管小心转移入离心管中,用一定比例(0.2
mL/100mg)的NaI-I2PO溶液(0.33mol/L,pH6,内含0.5mmol/LNa~DTA)荡洗匀浆器,洗液并入离心
管,混旋均匀,低温高速离心(4oC,10000r/min,20min),取上清液50L直接进样测定
5.HT,另取上
清液50L与10L衍生试剂进行衍生化反应后进样50L测定HA. 2结果与讨论
2.1色谱条件的确定
在色谱条件的选择上,考察了流动相组成,pH值对色谱分离的影响.实验选用了
25mmol/L的磷
c
卧
分析测试第23卷
酸盐缓冲液作为缓冲介质,并同时比较了柠檬酸盐,醋酸盐,发现采用磷酸盐时基
线最平稳,但需要注
意的是,缓冲盐的浓度不能太大,否则会加大噪音的本底值.流动相中离子对试剂
的浓度对HA,5.HT
的保留值有较大影响,特别是对5-HT,最后选定3mmol/L,此时HA和5一HT的保
留时间分别为9.26rain
和l6.34min,且HA,5.HT能与其它峰达到完全分离.见图2 1.O
0.8
>0.6
0.4
0.2
0
0l020
f/rain
1.O
0.8
>0.6
0.4
0.2
0
0l020
f/min
O?8
>
0?6
0.4
0?2
0
图2标准品和样品的色谱图
Fig.2ChromatogramsofHAand5一HTinstandardsolutionsandinratShy—pothalamus A.HA标准品衍生后进样(derivatizedHAstandaM,HA:0.2t~g/mIJ).B.下丘脑匀浆上清液经衍生后进样(defivatized
supernatantofhypothalamushomogenate,HA:0.499Ixg/mL):C.5-HT标准品直接进样(5一HTstandard,5-HT:1.2t~g/mL); D.下丘脑匀浆上清液直接进样
(supematmltofh.,,-pothalamushomogenate,5-HT:0.544ILg/mL)
2.2最佳检测电位的选择
采用电化学检测器进行检测,需要寻找一个最佳的检测电位,以确保样品含量的准确测定.通过逐步
增加检测电位(每次0.1V),HA衍生物和5一}{T的响应值逐步增加,与此同时,噪音也在增大.最终选择
0.6V作为检测电位,此时响应值已有足够大,同时噪音又不超过l0nA,不会对样品的检测产生干扰.
2.3OPA用量考察
用50L下丘脑匀浆上清液与不同量的OPA(1mg/mL)一亚硫酸钠衍生试剂进行反应,在HA的衍
生化反应中,要严格控制衍生试剂的量,如果衍生试剂量太少,可能会使衍生化反应不完全;若量太
多,衍生试剂中OPA和亚硫酸钠的峰拖尾很严重,会影响HA 衍生物的出峰,造成定量不准.峰面积变化见图3.当衍生试 剂用量到达l0L时,HA衍生物的响应值渐趋平稳,说明此时 衍生化反应已达完全,所以选择衍生试剂的用量为10L. 2.4HA衍生产物稳定性考察
取50LHA标准品溶液与l0L衍生试剂反应1min后置 冰浴中终止反应,观察在反应后不同时间衍生产物的含量变化, 结果见图4.从图中可见,HA衍生物在反应后20min内含量基 本稳定,因此实验要在衍生反应完成后20min内进样分析,以 确保结果的准确.
2.5标准曲线的制备
分别吸取HA和5一HT储备液各100L,用三蒸水逐步稀释 至系列浓度的HA和5一HT标准溶液.取50LHA各标准稀释 液分别与l0L衍生试剂反应后进样5OL制备HA的标准曲 线;取50L5一HT各标准稀释液直接进样制备5一HT的标准曲 线.计算峰面积与质量浓度l0的线性回归方程,HA回归方 程为A=5.15×10lD一1.11×10,r=0.9996,线性范围为 0.075,1.8/~g/mL;5一HT回归方程为A=4.38×10p一1.23× 10,r=0.9966,线性范围为0.0625,1.25g/mL. L
图3衍生试剂用量对组胺衍生物响
应值的影响
Fig.3Effectofthedosageofthedefiva-
tizationreagentontheHAresponse
第6期李伟荣等:高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5.羟色胺
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2.6精密度试验
取同一份下丘脑匀浆上清液,在同一天内取样4次测定,HA和5一HT的日内相对
标准偏差(RSD)分
别小于1.0%和3.4%;一周内不同日期取样4次测定,HA和5一HT的日间相对标准偏差(RSD)分别小于
11.4%和6.3%.
2.7回收率试验
向已知浓度的下丘脑样品中加入一定量的HA和5一HT标准溶液,再按"1.7"样品处理项下进行测定,
扣除样品中原有的含量,求出HA和5一HT的加样回收率.结果HA的回收率为
102.3%,5.HT 94.1%,
的回收率为72.8%,89.1%.见表1.
表1大鼠下丘脑内HA和5-HT测定的加样回收率
Table1RecoveriesofHAand5-HTinratShypothalanms
2.8正常大鼠下丘脑的测定结果
取雄性sD大鼠8只,按1.7项下方法进行样品收集与处理,在前述色谱条件下进行测定,结果大鼠
下丘脑内HA和5一HrI1的平均含量分别为0.280?0.029~g/mL和0.224?0.068~g/mL.
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