骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能要点

骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能要点 中国组织工程研究 第20卷 第50期 2016–12–02出版 www.CRTER.org Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 2, 2016 Vol.20, No.50 ?研究原著? 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能 赵 敏，李秀芬(郑州澍青医学高等专科学校基础医学部～河南省郑州市 450000) 引用本文:赵敏，李秀芬. 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能[J].中国组织工程研究，2016，20(50):7494-7499. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.007 ORCID: 0000-0003-0075-9845(赵敏) 文章快速阅读: 赵敏～女～1983年生～骨髓间充质干细胞对心脏移植大鼠免疫功能的调节作用 河南省郑州市人～汉族～ 硕士～讲师～主要从事微动物模型制备: 细胞移植组经尾静脉 生物免疫学方面的研究。 (1)Lewis大鼠20只作为注射Wistar大鼠骨髓 细胞移植组较空供体; 间充质干细胞悬液建模后随机分2组 中图分类号:R394.2 白对照组炎性反病理学观察 (2)Wistar大鼠20只作为应程度较轻 文献标识码:B 受体; 空白对照组经尾静脉ELISA文章编号:2095-4344 (3)采用套管法建立大鼠注射等量的生理盐水 (2016)50-07494-06 颈部心脏移植模型。 注射液 稿件接受:2016-10-31 法 检 测 T细胞占总淋巴细胞的比血清白细胞介素10水平 流式细胞术检测 例均显著高于空白对照组 显著高于空白对照组 文释义: 白细胞介素10:是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应， 是目前公认的炎症与免疫抑制因子。白细胞介素10来源于Th2和部分调节性T细胞，能抑制Th1细胞应答， 抑制巨噬细胞的抗原提呈功能及合成细胞因子，促进B细胞增殖、分化及抗体产生。 Foxp3:是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一，它的发现是Treg免疫生物学重要的进步。虽 然人们也发现Treg发育和功能也需要其他转录因子如AhR和STAT5的参与，但是Foxp3仍旧是Treg细胞 系的主要调节因子。实验表明，在体外或体内诱导初始T细胞表达Foxp3后可以出现Treg样的免疫抑制 作用，可见Foxp3是控制免疫抑制分子表达的关键因素。 摘要 背景:心脏移植是治疗终末期心力衰竭等疾病的有效手段，但移植后容易出现免疫排斥反应，严重影响 到移植效果。 目的:探讨骨髓间充质干细胞对心脏移植大鼠免疫功能的调节作用。 :Lewis大鼠20只作为供体，Wistar大鼠20只作为受体，采用套管法建立大鼠颈部心脏移植模型。 模型制备后，20只Wistar大鼠随机分为细胞移植组与空白对照组，每组10只。心脏移植后48 h，细胞 8-1 移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2×10 L)，空白对照组经尾静脉注射等量 的生理盐水注射液。细胞移植后7 d，ELISA法检测血清白细胞介素2、白细胞介素10水平，流式细胞术 +++++high+high+检测大鼠静脉血中CD4、CD8、CD4/CD8、CD4CD25、CD4CD25 Foxp3 T细胞百分含量， 获取心肌组织进行病理学观察。 结果与结论:?细胞移植组心脏存活时间显著长于空白对照组(P < 0.05);?两组血清白细胞介素2水平 差异无显著性意义(P > 0.05)，细胞移植组血清白细胞介素10水平显著高于空白对照组(P < 0.05);?细 ++++high+high+ 胞移植组CD4、CD4/CD8、CD4CD25、CD4CD25 Foxp3 T细胞占总淋巴细胞的比例均显+著高于空白对照组(P < 0.05)，CD8 T细胞占总淋巴细胞的比例显著低于空白对照组(P < 0.05);?细胞移植组心肌组织中有少量淋巴细胞浸润，心肌间质可观察到轻微出血和水肿，较空白对照组炎性反应程度较轻;?结果表明，对心脏移植大鼠实施骨髓间充质干细胞治疗可以有效减轻排斥反应。 关键词: 干细胞;骨髓间充质干细胞;心脏移植;器官移植;免疫功能;动物实验 主题词: 心脏移植;骨髓;间质干细胞移植;免疫调节;组织工程 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 7494 www.CRTER.org 赵敏，等. 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能 Zhao Min, Master, Immune function regulation by bone marrow mesenchymal stem cells in rats Lecturer, School of Basic undergoing heart transplantation Medicine, Shuqing Medical College, Zhengzhou Zhao Min, Li Xiu-fen (School of Basic Medicine, Shuqing Medical College, Zhengzhou 450000, Henan 450000, Henan Province, Province, China) China Abstract BACKGROUND: Heart transplantation is an effective method for treatment of end-stage heart failure, but immune rejection that seriously impact therapeutic effacicy is easy to occur after transplantation. OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the immune function of rats undergoiong heart transplantation. METHODS: Twenty Lewis rats were enrolled as donors, and 20 Wistar rats as recipients. Heart transplantation models were established in the Wistar rats. These 20 model rats were randomized into cell transplantation and control group with 10 rats in each group. Forty-eight hours after heart transplantation, rats in the cell transplantation group were given bone marrow mesenchymal stem cell suspension 8(1 mL, 2×10 cells/L) via the tail vein, while rats in the control group were given normal saline in the same ++dose. Then, the expression levels of serum interleukin-2, interleukin-10 and percentage of CD4, CD8, +++high+high+CD4/CD8, CD4CD25, CD4CD25 Foxp3 T cells in the venous blood were detected in the two groups at 7 days after cell transplantation. Additionally, rat myocardial tissues were taken and observed pathologically. RESULTS AND CONCLUSION: The survival time of the cell transplantation group was significantly longer than that of the control group (P < 0.05). The expression level of interleukin-2 showed no significant difference between the two groups (P > 0.05), but the level of interleukin-10 in the cell transplantation group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, +++high+high++the percentage of CD4/CD8, CD4CD25, CD4CD25 Foxp3 and CD4 T cells was significantly +higher, and the percentage of CD8 T cells was significantly lower in the cell transplantation group (P < 0.05). Histopathological findings showed that there were a small amount of infiltrated lymphocytes in the cell transplantation group with the presence of slight bleeding and edema, and these inflammatory reactions were milder than those in the control group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can effectively reduce the rejection in rats undergoing heart transplantation. Subject headings: Heart Transplantation; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Immunomodulation; Tissue Engineering Cite this article: Zhao M, Li XF. Immune function regulation by bone marrow mesenchymal stem cells in rats undergoing heart transplantation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7494-7499. 0 引言 Introduction 1.3 材料 心脏移植是临床治疗各种心脏病终末期患者的有1.3.1 实验动物 ?心脏移植供体:健康雄性Lewis大 [1]效方法。为避免出现免疫排斥现象，心脏移植后需要鼠20只，体质量250 g左右，8周龄，由北京维通利华实 长期服用各种免疫抑制药物，容易发生高血压等药物相验动物有限公司提供，许可证号SCXK(京)2002-0003; [2-4]关并发症。为此，需要采取有效的措施来调节移植后?心脏移植受体:健康雄性Wistar大鼠20只，体质量 的免疫功能，以获得更好的移植效果。骨髓间充质干细240 g左右，8周龄，由上海斯莱克实验动物有限公司 胞具有一定的免疫调控作用，通过骨髓间充质干细胞移提供，许可证号:SCXK(沪)2003-0003;?骨髓间充质 植方式，提高心脏移植后机体免疫耐受程度，具有十分干细胞供体:健康雄性Wistar大鼠10只，体质量240 g [5-6]重要的临床意义。实验即探讨骨髓间充质干细胞对心左右，8周龄，由上海斯莱克实验动物有限公司提供， 脏移植大鼠免疫功能的调节情况。 许可证号:SCXK(沪)2003-0003。所有动物饲养于郑州 澍青医学高等专科学校实验动物中心SPF环境中，常规 1 材料和方法 Materials and methods 喂养。研究相关均提交医学伦理部门审核，符合相 1.1 设计 随机对照动物实验。 关伦理学要求。 1.2 时间及地点 实验于2016年3至6月在郑州澍青医1.3.2 主要试剂与仪器 速眠新注射液(上海育播宠物 学高等专科学校基础医学部实验室完成。 用品有限公司);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(上 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 7495 www.CRTER.org 赵敏，等. 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能 +++海博升生物科技有限公司);抗大鼠CD4、CD8、CD25、、CD8、CD4/ 1.4.5 流式细胞术检测大鼠血液中CD4 ++high+high+Foxp3单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);大鼠CD8、CD4CD25、CD4CD25 Foxp3 T细胞百白细胞介素2、白细胞介素10 ELISA试剂盒(上海弘顺生物分含量 移植后7 d，麻醉状态下抽取下腔静脉血1 mL科技有限公司);光学显微镜(上海哈灵生物科技有限公置于EDTA抗凝管中，采用流式细胞术检测大鼠血液中 +++high+high+司);石蜡切片机(北京科誉兴业科技发展有限公司)。 CD4、CD8、CD4CD25、CD4CD25 Foxp3 T ++1.4 实验方法 细胞百分含量，计算CD4/CD8比值。 1.4.1 骨髓间充质干细胞的体外分离、培养 取Wistar1.4.6 病理学观察 移植后7 d，两组各取5只大鼠，麻大鼠10只，无菌分离股骨和胫骨，剪断骨干骺端，暴露醉处死后获得心脏标本进行病理学观察，剩余大鼠继续骨髓腔，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液观察存活天数。每日观察大鼠精神状态，按时触诊移植反复冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液并反复抽吸吹打，获心脏，观察移植物搏动幅度、节律及速度，停跳者移植得单细胞悬液。用注射器接4.5号针头回收细胞悬液于物存活时间视为到停跳的前一天。 10 mL离心管中，离心后去上清，将沉淀用体积分数为1.5 主要观察指标 ?心脏的存活时间;?白细胞介15%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，加入密度为素2、白细胞介素10水平;?T细胞占总淋巴细胞的比例;1.085 g/mL的Percoll淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心?病理学观察结果。 20 min，吸取中间的乳白色细胞层，用含体积分数为1.6 统计学分析 实验数据利用SPSS 18.0软件处理， 215%胎牛血清的DMEM培养液重悬，接种于25 cm塑料计量资料行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性培养瓶中，置于37 ?，体积分数为5%CO饱和湿度培意义。 2 养箱中培养，3 d后第1次换液，以后每周换液2次，倒 置显微镜下观察细胞约80%融合时传代培养，收集第2 结果 Results 4-6代细胞备用。 2.1 实验动物数量分析 20只Wistar大鼠进入最终的1.4.2 实验方案 Lewis大鼠20只作为供体，Wistar大结果分析。 鼠20只作为受体，参照文献[7-10]，采用套管法建立大2.2 两组移植心脏的存活时间 细胞移植组心脏存活鼠颈部心脏移植模型。供受体动物肌肉注射速眠新注射时间为(14.25?2.15) d，空白对照组心脏存活时间为液麻醉，注射剂量2 mg/kg。动物保持仰卧位，四肢固(7.15?1.35) d，细胞移植组显著长于空白对照组(P < 定保持伸展状态。受体颈部及供体胸腹部剃毛，体积分0.05)。 数为75%乙醇消毒后切取供体心脏，于10倍镜下用10-02.3 两组大鼠血清白细胞介素2、白细胞介素10水平 无损伤血管缝线将供心主动脉与受体右颈总动脉行端两组血清白细胞介素2水平差异无显著性意义(P > 侧吻合，用9-0无损伤血管缝线将供心主肺动脉与受体0.05)。细胞移植组血清白细胞介素10水平显著高于空右颈外静脉行端端吻合，移植心脏位于右侧颈部皮下，白对照组(P < 0.05)，见表1，图1。 每日观察大鼠心跳、精神状态，如果移植心跳动48 h2.4 两组静脉血中T细胞占总淋巴细胞的比例 移植 ++++ high以上，即可视为模型建立成功。 7 d，细胞移植组CD4、CD4/CD8、CD4CD25、后 [11-12]+high+1.4.3 实验分组及干预 颈部心脏移植模型制备CD4CD25 Foxp3 T细胞占总淋巴细胞的比例均显著 +完毕后，20只Wistar大鼠随机分为细胞移植组与空白对高于空白对照组(P < 0.05)，CD8 T细胞占总淋巴细胞的照组，每组10只。术后48 h，两组动物肌肉注射速眠新比例显著低于空白对照组(P < 0.05)，见表2。 麻醉，细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬2.5 两组心肌组织病理学观察结果 移植后7 d，空白 8-1液，每只1 mL，细胞浓度为2×10 L，空白对照组经尾对照组心肌组织有淋巴细胞以及单核细胞大量浸润现静脉注射等量的生理盐水注射液，无其他特殊干预。 象，有末梢小血管内血栓形成这一超急性排斥反应的特1.4.4 ELISA法检测白细胞介素2、白细胞介素10水 征病变，存在明显的心肌间质水肿、出血，存在不同程[13-15]平 移植后7 d，麻醉状态下尾静脉取血，分离血度的心肌黏液性坏死和心肌细胞变性坏死;细胞移植组清，利用双抗体夹心ELISA法检测白细胞介素2、白细心肌组织中存在少量的淋巴细胞浸润，出现灶性心肌细胞介素10水平，严格按照说明书进行操作。重复检测3胞损害，心肌间质可观察到轻微出血和水肿，较空白对次，取平均值。 照组炎性反应程度较轻(图2)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 7496 www.CRTER.org 赵敏，等. 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能 细胞移植组 空白对照组 表1 移植后7 d 两组大鼠血清白细胞介素2、白细胞介素300 _ 10水平 (x?s，n=10，ng/L) 250 P < 0.05 Table 1 The expression levels of serum interleukin-2 and 200 interleukin-10 in the two groups 7 days after cell 150 transplantation 100 50 细胞因子水平(ng/L) 组别 白细胞介素2 白细胞介素10 0 a细胞移植组 248.15?25.23 160.23?18.75白细胞介素2 白细胞介素10 空白对照组 230.25?20.35 80.25?12.26 图1 两组大鼠血清白细胞介素2、白细胞介素10水平 a表注:与空白对照组比较，P < 0.05。 Figure 1 The expression levels of serum interleukin-2 and interleukin-10 in the two groups 表2 移植后7 d 两组静脉血中T细胞在淋巴细胞中所占比 _ 例 (x?s，n=10，%) A B Table 2 Proportion of T cells accounting for lymphocytes in the venous blood at 7 days after cell transplantation 指标 细胞移植组 空白对照组 +a CD4 48.85?5.12 30.23?2.75 +aCD8 40.59?3.85 60.23?2.89 ++a图2 两组心肌组织病理学观察结果(苏木精-伊红染色，×200) CD4/CD8 1.15?0.08 0.50?0.06 +highaFigure 2 Pathological changes of the myocardial tissues in the CD4CD25 2.58?0.55 0.95?0.15 +high+atwo groups (hematoxylin-eosin staining, ×200) CD4CD25Foxp3 2.10?0.65 0.85?0.05 图注:图中A为细胞移植组，B为空白对照组。细胞移植组较空 a表注:与空白对照组比较，P < 0.05。 白对照组炎性反应程度较轻。 +3 讨论 Discussion Foxp3调节性T细胞可特异性下调大鼠T细胞对异体 心脏移植是治疗终末期脏器功能衰竭唯一有效的大鼠抗原刺激的反应性。所以，Foxp3是目前公认的 ++[32]治疗手段，移植后会出现不同程度的免疫排斥现 CD4CD25 Treg细胞的特异性表面标志。 [16-18]象。临床可通过服用各种免疫抑制药物来抑制免疫实验结果显示两组血清白细胞介素2水平差异无显排斥，但容易导致各种并发症的出现，不利于提高预后著性意义(P > 0.05)，细胞移植组血清白细胞介素10水 [19-22]效果。 平显著高于空白对照组(P < 0.05)。白细胞介素2属于促 间充质干细胞具有多向分化的能力，并具有很强的炎因子，白细胞介素10 属于抗炎因子，骨髓间充质干细 [23-25]免疫调节作用胞移植治疗可以有效提高大鼠白细胞介素10水平，说明。间充质干细胞进入机体之后，可以 结合不同的环境特点来发挥调节作用，对机体产生不同骨髓间充质干细胞可以发挥出很好的抗炎作用，产生免 [33-37]的免疫反应。间充质干细胞可以发挥出诱导免疫耐受作疫抑制和诱导免疫耐受，提高移植的耐受程度。通 ++++ 用，有效抑制移植物抗宿主病的出现，从而提高器官移过实验还发现，细胞移植组CD4、CD4/CD8、CD4 [26-30][31]high+high+植成功率，改善预后。王海涛对同种异体心脏移CD25、CD4CD25 Foxp3 T细胞占总淋巴细胞 +植大鼠进行骨髓间充质干细胞移植治疗，观察发现细胞的比例均显著高于空白对照组(P < 0.05)，CD8 T细胞移植可以有效减轻心脏的免疫排斥反应，促进移植心脏占总淋巴细胞的比例显著低于空白对照组(P < 0.05)，存活时间的延长，其机制可能与骨髓间充质干细胞调节说明骨髓间充质干细胞移植治疗后，免疫平衡发生了变T细胞转化进而发挥免疫抑制作用有关。 化，逐渐向免疫抑制方向偏移，进而有效降低急性排斥 [38-40]实验制备心脏移植动物模型，观察尾静脉注射受体反应程度，促进移植物的存活。实验中，细胞移植同系骨髓间充质干细胞对大鼠心脏移植免疫反应的影组心脏存活时间显著长于空白对照组，提示骨髓间充质响。器官移植后急性排斥反应的发生主要与T淋巴细胞干细胞移植治疗发挥出很好的促进移植物存活的效果。相关，是T细胞介导的免疫损伤导致迟发型变态反应，病理学观察也发现，细胞移植组心肌组织中存在少量的病理学特征表现为以单个核细胞浸润和细胞变性、坏死淋巴细胞浸润，心肌间质可观察到轻微出血和水肿，较 ++ 为特征的局部超敏反应性炎症。研究表明，CD4CD25空白对照组炎性反应程度较轻，提示对心脏移植大鼠实ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 7497 www.CRTER.org 赵敏，等. 骨髓间充质干细胞调节心脏移植大鼠的免疫功能 [8] 魏长江.骨髓间充质干细胞外周中枢联合预处理诱导异施骨髓间充质干细胞治疗可以有效减轻排斥反应。 种心脏移植免疫耐受的研究[D].苏州:苏州大学,2009. 综上所述，骨髓间充质干细胞移植可以发挥出良好[9] 刘奎利,刘德忠,金建刚,等.异体脐带间充质干细胞对大鼠的免疫调节作用，关于其在临床器官移植后免疫调节方心脏移植的免疫调节[J].中国组织工程研究与临床康复, 面的应用，值得在今后予以进一步分析。 2010,14(6):1048-1052. 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Impact of preoperative left ventricular function and time from 作者声明:第一作者对研究和撰写的中出现的不 infarction on the long-term benefits after 端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算intramyocardial CD133(+) bone marrow stem cell 机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁～transplant. J Thorac Cardiovasc Surg. 2011;142(6): 可接受核查。 1530-1539. [13] 朱震,沈振亚,陈海军,等.MSCs修饰受体胸腺对异种心脏文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授权人签署 移植免疫排斥反应的作用研究[J].中国医药科学,2012, 了版权相关协议。 2(21):35-38. [14] Ruf S, Behnke-Hall K, Gruhn B, et al. Comparison of 4 参考文献 References six different specimen types for Epstein-Barr viral load [1] 沈兴,余更生,田杰,等.兔骨髓间充质干细胞心脏移植治疗quantification in peripheral blood of pediatric patients 扩张型心肌病的实验研究[J].第三军医大学学报,2008, after heart transplantation or after allogeneic 30(12):1159-1162. hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Virol. [2] 赵桂峰,范英昌,姜希娟,等.丹酚酸B对内皮祖细胞与骨髓2012;53(3):186-194. 间充质干细胞联合心脏移植后增殖状况的影响[J].中国[15] Nakane T, Nakamae H, Muro T, et al. 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