一测多评法测定枣仁安神胶囊中丹参酮ⅱa、五味子醇甲与五

一测多评法测定枣仁安神胶囊中丹参酮ⅱa、五味子醇甲与五 一测多评法测定枣仁安神胶囊中丹参酮?A、五味子醇甲与五味子醇乙含量 尹创 ，安徽宿州市食品药品检验所,宿州,234000， 【摘要】目的:建立枣仁安神胶囊中丹参酮?A、五味子醇甲与五味子醇乙含量的一测多评方法。 方法:采用高效液相法测定丹参酮?A与五味子醇甲和五味子醇乙间的相对校正因子,考察其重现 性,比较计算值与测得值的差异。结果:用一测多评法对6批枣仁安神胶囊中丹参酮?A、五味子醇 甲与五味子醇乙进行测定,与外标法实测值基本一致。结论:该方法可靠,结果准确,可用于枣仁 安神胶囊的质量控制。 【关键词】一测多评;枣仁安神胶囊;丹参酮?A;五味子醇甲;五味子醇乙 Content Determination of Tanshinone IIA,Schisandrol A,schisandrol B in Zaoren Anshen Capsules by Quantitative Analysis of Multi- components by Single-marker Yinchuang (Anhui Suzhou Institute for Food and Drug Control,Suzhou 234000) ABSTRACT Objective:To develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS， for determination of Tanshinone IIA,Schisandrol A,schisandrol B in Zaoren Anshen Capsules. Methods:Based on the HPLC, the relative correction factor of Tanshinone IIA was determined using magnolol as an internal reference substance, the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared. Results: The quantitative results of six batches of Zaoren Anshen Capsules by QAMS was basically consistent with that by external standard method. Conclusion:The QAMS method was reliable and accurate, which might be used for the quality control of Zaoren Anshen Capsules KEY WORDS Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker ，QAMS，;Zaoren Anshen Capsules ;Tanshinone IIA;Schisandrol A;schisandrol B 枣仁安神胶囊由醋五味子、炒酸枣仁、丹参3味药材制得, 该药具有养血安神、补心养肝等功效, [1]临床常用心血不足所致的失眠、健忘、心烦、头晕;神经衰弱症等症状。其中酸枣仁具有养心安 神之功效;五味子具有生津敛汗、敛肺滋肾、宁心安神之功效,常用与酸枣仁配伍使用治疗心悸、 【2-4】[5-7]怔忡及失眠等症状。 据文献报道,枣仁安神胶囊主要含有酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、丹 参酮?A、五味子醇乙、酸枣仁皂苷B等成分,目前,对枣仁安神胶囊成分研究较多,但各种研究方 法中均牵涉到多种对照物质,这不仅增加实验成本,丐实验操作过程繁琐容易引入更多误差。王智 ,8,民等最早提出一测多评法,有效地解决对照物质繁多等缺陷,在中药检验领域得到很好地推广, 大大地缩减检验成本和提高工作效率。本研究以丹参酮?A为参照物,建立参照物与五味子醇甲和 五味子醇乙之间的校正因子,并对相对校正因子加以验证,然后利用校正因子计算药品中五味子醇 甲和五味子醇乙的含量,并利用数学统计方法比较一测多评法与外标法之间差异,得出一测多评法 准确、简便、快捷等结论。此方法最终实现以单一对照物质，丹参酮?A，同时对枣仁安神胶囊多 种有效成分进行质量控制,这为和考察枣仁安神胶囊质量提供全新参考模式,以便今后更好地 控制枣仁安神胶囊的质量。 1 仪器与试药 Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司;检测器:1260VWD;色谱工作站:Agilent ChemStation for LC systems，;液相色谱柱:Sunfire ODS (4.6mm×250mm,5um);JE703CE型电子天平，梅特勒仪器公司; D = 0.1mg，。 枣仁安神胶囊,觃格每袋装0.45克,共6个批次;丹参酮?A对照品，110766-200619,100.0%，,五味子醇甲对照品，110857-201010,99.4%，均购自中检院;五味子醇乙对照品，58546-54-6，,购自北京万佳首化生物科技有限公司。乙腈为色谱纯,水为纯化水,其它试剂为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 流动相:A-乙腈,B-0.1醋酸, 梯度洗脱程序:0～20 min, 乙腈比例48%?35%;20～70 min, 乙腈比例35%?80%.检测波长定为250nm,进样量:10μL。 2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取丹参酮?A、五味子醇甲、五味子醇乙对照品，P2O5真空干燥24h，各适量,加甲醇溶解并稀释制成每1ml含丹参酮?A 20mg、五味子醇甲30mg和五味子醇乙35mg的混合对照溶液,用0.22μm微孔滤膜滤过,即得。 【1】2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物适量,研细,取细粉约l g ,精密称定,置100mL具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50m l,密塞,称定重量,超声处理，功率500W,频率4 0kHz)3 0分钟,放冷,再称定重量,用,70%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。 2.4 阴性样品溶液的制备 按处方制备缺少研究三种目标成分的阴性样品,按2.3项下同法操作,制得阴性供试品溶液。 A B C 图1 对照品，A，、样品，B，和阴性样品，C，HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard (A),sample(B) and negative sample(C) 2.6 线性关系的考察 按“2.1”项下色谱条件,调节液相色谱仪,精密吸取5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、40μL、50μL注入色谱仪,色谱图,以进样量为横坐标，X，,峰面积为纵坐标，Y，,绘制曲线,得到线性方程分别为: 2丹参酮?A :Y=6.68X+2.68,R=0.9993，n=7， 2五味子醇甲:Y=3.14X+1.48,R=0.9995，n=7， 2五味子醇乙:Y=4.65X+3.01,R=0.9996 ，n=7， 结果明,丹参酮?A、五味子醇甲和五味子醇乙进样量分别在0.113～1.035μg、0.156～1.598μg 、0.168～1.668μng范围内与峰面积呈良好的线性关系。 2.7 稳定性试验 取同一批枣仁安神胶囊,按“2.3”项下供试品制备方法制备,室温放置0,5,8,15,20,24h后进样,记录色谱图,结果丹参酮?A、五味子醇甲和五味子醇乙峰面积的RSD 分别为0.6%、0.6%和0.2%,表明供试品溶液在24h内稳定。 2.8 精密度试验 取混合对照品溶液10μL,按“2.1”项下色谱条件,连续进样6针,测定峰面积,结果丹参酮?A、五味子醇甲、五味子醇乙峰面积的RSD分别为0.3%、0.2%和0.7%,表明仪器的精密度良好。 2.9加样回收率试验 取已知含量的同一批枣仁安神胶囊6份,分别加入一定量的丹参酮?A、五味子醇甲、五味子醇乙对照品,按“2.3”项下方法制备,依法操作,计算各成分回收率,结果见表1-3。 表1 丹参酮?A回收率测定结果，n=6， Tab.1 Results of recovery test for Tanshinone IIA，n=6， 测出总量 回收率 RSD 编号 取样量/(g) 样品中含量/(mg) 加入量/(mg) 平均回收率/，%， /(mg) /，%， /，%， 1 1.0230 1.5648 1.5728 3.1226 99.52 2 1.1134 1.5023 1.5103 2.9996 99.57 3 1.0358 1.5834 1.5334 3.1068 99.68 99.7 0.1 4 1.0689 1.6015 1.6095 3.1960 99.53 5 1.0768 1.6138 1.5638 3.1696 99.75 6 1.1032 1.5538 1.5618 3.1146 99.97 表2 五味子醇甲回收率测定结果，n=6， Tab.2 Results of recovery test for Schisandrol A，n=6， 测出总量 回收率 RSD 编号 取样量/(g) 样品中含量/(mg) 加入量/(mg) 平均回收率/，%， /(mg) /，%， /，%， 1 1.0230 2.5344 2.4844 5.0058 99.74 2 1.1134 2.5534 2.5614 5.1048 99.80 3 1.0358 2.5687 2.5187 5.0574 99.41 99.8 0.2 4 1.0689 2.5021 2.5101 5.0082 99.92 5 1.0768 2.4958 2.4458 4.9411 99.99 6 1.1032 2.6982 2.7062 5.4024 99.96 表3 五味子醇乙回收率测定结果，n=6， Tab.3 Results of recovery test for Schisandrol B，n=6， 测出总量 回收率 RSD 编号 取样量/(g) 样品中含量/(mg) 加入量/(mg) 平均回收率/，%， /(mg) /，%， /，%， 1 1.0230 2.0231 1.9731 3.9852 99.72 2 1.1134 2.1358 2.1438 4.2736 99.86 3 1.0358 1.9852 1.9352 3.9181 99.94 99.9 0.1 4 1.0689 1.9982 2.0062 4.0026 99.96 5 1.0768 2.0468 1.9968 4.0426 99.97 6 1.1032 2.1245 2.1325 4.2551 99.96 2.10 相对校正因子计算 【5】本研究以丹参酮?A为内参物,分别计算五味子醇甲、五味子醇乙校正因子,计算公式为:f=fs/fi=AsCi/AiCs 。式中As代表内参物峰面积,Ci为待测成分浓度,Ai为待测成分峰面积,Cs为内参物浓度。分别精密量取混合对照溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、40μL依法测定, 计算出五味子醇甲和五味子醇乙的校正因子平均值分别为1.365和4.023,RSD分别为0.5%和0.8%。 2.11 相对校正因子的重现性考察 ? 高效液相色谱仪及色谱柱考察:考察的高效液相色谱仪型号分别为:UltiMate 3000 、SHIMADZU LC-10tvp和Waters 2695-2489;色谱柱种类及型号分别为:Thermo Hypersil BDS C(4.6×250mm，185μm)、Agilent ZORBAX 300StableBond SB-C(4.6×250mm，4.5μm)和Shim-pack VP-ODS C，4.61818×250mm,5μm，。考察数据及结果见表4。 表4 高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子的影响 Tab.4 High performance liquid chromatograph and chromatographic column on the influence of relative correction factor 相对校正因子 高效液相色谱仪 色谱柱 五味子醇甲 五味子醇乙 1.362 4.028 Thermo Hypersil BDS C 18 戴安UltiMate 3000 1.356 4.021 Agilent ZORBAX 300StableBond SB-C 18 1.358 4.031 Shim-pack VP-ODS C 18 1.360 4.018 Thermo Hypersil BDS C 18 SHIMADZU LC-10tvp 1.374 4.038 Agilent ZORBAX 300StableBond SB-C 18 1.370 4.031 Shim-pack VP-ODS C 18 1.372 4.021 Thermo Hypersil BDS C 18 Waters 2695-2489 1.350 4.028 Agilent ZORBAX 300StableBond SB-C 18 1.360 4.021 Shim-pack VP-ODS C 18 平均值 1.362 4.026 RSD/% 0.5 0.1 从表4可以看出:五味子醇甲及五味子醇乙相对校正因子差异较小,RSD分别为0.5%和0.1%,该方法适合不同型号仪器和色谱柱,耐用性强。可以得出,一测多评法可用做检测枣仁安神胶囊中丹参酮?A、五味子醇甲和五味子醇乙含量,方法简便、快捷、准确、可靠。 ? 色谱峰丏属性考察:准确定位目标成分是本研究的前提,目前定位方式有相对保留时间值法和保留时间差值法,本研究采用相对保留时间值法进行峰定位。在紫外光谱图定性前提下,以丹参酮?A峰为参考峰,分别计算五味子醇甲和五味子醇乙的相对丹参酮?A峰的保留时间,并对两相对保留时间用不同高效液相色谱仪和色谱柱来考察其耐用性。结果,五味子醇甲和五味子醇乙相对保留时间值分别为0.4%和0.2%,误差很小,可以得出,不同高效液相色谱仪和色谱柱对相对保留时间值影响甚微,三种成分相对位置，色谱峰中相对保留时间，比较稳定。因此,在已知丹参酮?A保留时间的前提下,可以准确定位五味子醇甲和五味子醇乙色谱峰,进而可以采用一测多评法计算各组分含量,能更好地控制枣仁安神胶囊质量。 2.12 样品测定 取枣仁安神胶囊6批,按照“2.2”项下方法制备,分别采用外标法和一测多评法测定并计算丹参酮?A、五味子醇甲和五味子醇乙含量,结果见表6。经成组t检验,两组差异均无统计学意义,可以认为两种方法测得结果基本一致,一测多评法可以作为枣仁安神胶囊考察这三 种成分的质控方法。 表5 样品的测定结果 Tab.5 The determination results of the samples 五味子醇甲含量/，mg/g， 五味子醇乙含量/，mg/g， 样品 丹参酮?A含量/，mg/g， 外标法 一测多评法 外标法 一测多评法 1 1.5648 2.5344 2.5424 2.0231 2.0311 2 1.5023 2.5534 2.5614 2.1358 2.1438 3 1.5834 2.5687 2.5867 1.9852 2.0032 4 1.6015 2.5021 2.5101 1.9982 2.0062 5 1.6138 2.4958 2.5138 2.0468 2.0648 6 1.5538 2.6982 2.7062 2.1245 2.1325 均值 2.5588 2.5701 2.0523 2.0636 SD 0.0739 0.0727 0.064 0.0619 两组比较 t,P 0.267,0.795 0.311,0.762 3 讨论 3.1 关于波长选择 为选择较佳检测波长,实验采用紫外分光光度法全波长扫描混合对照溶液发现,本品在250nm及270nm附近有较强紫外吸收。但采用270nm波长进行试验时发现,五味子醇甲和五味子醇乙峰不能完全分离,而使用250nm分离度完好,丐其吸收强度能达到定量分析,所以本研究选择250 nm波长为实验波长。 3.2 关于流动相选择 流动相选择中,共考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.1%磷酸溶液等诸多流动相,结果只有采用乙腈-0.1%冰醋酸溶液三个对照物质才同步出现信号并实现完全分离,但是五味子醇乙保留时间过长,所以最终采用梯度洗脱程序。通过了解三种物质理化性质,样品提取介质选取甲醇,通过比较浸泡法和超声法两种方法,最后采用超声30min即可完全实现成分提取,达到实验制备要要求。 [8]-[11]目前,一测多评法在中药材及饮片质量评价中应用广泛。一测多评法，QAMS，有着简便、快速、经济合理等诸多优点,在对照品不易得到的情况下,能实现用一种对照品测定多种成分的目的,更好地考察和控制药品质量。本研究采用丹参酮?A为对照,同时测定枣仁安神胶囊中多种有效成分的含量,这对评价和考察枣仁安神胶囊质量提供全新参考模式,以便今后更好地控制枣仁安神胶囊的质量。 参考文献 [1] 中国药典【S】.2015版.一部.1036 [2]祝连生,谭倩,武锋,枣仁安神胶囊辅助治疗脑卒中后抑郁症,J,,浙江中西医结合杂志,2007,17( 8) : 463-464, [3] 刘勇,南达元.枣仁安神胶囊治疗心理生理性失眠的临床观察,J,,中国中药杂志,2009,34( 13) : 1730, [4] 郭彦蕊,王晓光,枣仁安神汤治疗失眠,J,,中国民间疗法,2009,17( 11) : 70 [5] 谭晓虹,王志宝,赵倩, HPLC 测定南、北五味子中五味子甲素和五味子乙素的含量,J,, 中成药,2010,32( 1) : 155, [6] 侯广杰. 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