Smad1在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间质干细胞中的表达及意义

Smad1在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间质干细胞中的表达及意义 Smad1在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓 间质干细胞中的表达及意义 中国脊柱脊髓杂志2006年第l6卷第11期ChineseJournalofspineand 印inalc0,2006,Vo1.16,No.11847 Smadl在青少年特发性脊柱侧凸患者 骨髓间质干细胞中的表达及意义 孙强,,邱勇’,刘臻’,吴洁,陈军浩,陈蕾蕾,马薇薇’ (1南京大学医学院附属鼓楼医院脊柱外科;2科研部210008江苏省南京市) 【摘要】目的:探讨Smad1在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者骨髓间质干细胞(MSCs)中的表达及其在发病机 制中的作用.方法:30例12,18岁志愿者分为两组:AIS组20例,同年龄正常对照组10例.分别从髂前上棘处 骨穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝.采用密度梯度离心法分离MSCs,体外培养并传至P2代行表型鉴定,分别采 用RT—PCR及免疫蛋白印记法检测两组患者MSCs中Smad1的表达情况.结果:AIS组与对照组Smad1mRNA 水平的平均表达率分别为4.48~0.58和1.03~0.22,蛋白水平的平均表达率分别为2.62~0.55和0.84~0.22.不论 是核酸水平还是蛋白水平AIS组Smad1的表达均高于对照组 (P<0.01).结论:Smad1在AIS患者MSCs中表达 强度异常,可能与AIS发病的分子机制相关. 【关键词】Smad1;青少年特发性脊柱侧凸;骨髓间质干细胞 中图分类号:R682.3,O71文献标识码:A文章编号:1004--406X(2006) 一l1—0847—04 ExpressionandetiologicalsignificanceofSmadlinmesenchymalstemcellsfromadolescenti~opathic scoHosis/SUNQiang.QIUYong.LIUZhen.etal//ChineseJourn~ofSpineandSpinalCord,2006.16 (11):847~850 【Abstract】 Objective:Todiscussapossiblemolecularmechanismbetweenpathogenesisofadolescentidio— pathicscoliosis(AIS)andtheexpressionofSmad1fromhumanmesenchymalstemcells(hMSCs).Method:30 volunteersweredividedintotwogroups:AISgroupwas20,andtheotherswerenormalcontrolgroup.Thehu— manbonemarrowanticoagulatedbycalparinewasobtainedfromanteriorsuperioriliacspine,andthehMSCs wereisolatedbydensitygradientcentrifugefromthemononuclearcells,andthenwerecultivatedandserial subcuhivatedinvitro.P2generationwasanalyzedbytheflowcytometrytodet ectthesurfaceantigens,where aftertheexpressionofSmad1ofhMSCsfrom2groupsweredetectedbyusingRT-PCRandWesternblot— ting.Result:TheaveragemRNAexpressionofSmad1was4.48~0.58inAISgroupandwas1.03~0.22incon— trolgroup.TheaverageproteinexpressionofSmad1was2.62~0.55inAISgroupandwas0.84~0.22incontrol grouprespectively.ExpressionofSmad1hadincreasedobviouslyinAISgroupascomparedwithcontrolgroup (P<0.01)nomatterfromthenucleicacidlevelorfromtheproteinleve1.Condusion:Theabnormalexpression ofsmad1inAIS,anditmayberelatedtothepathogenesisofAIS. 【Keywords】 Smad1;Adolescentidiopathicscoliosis;Mesenchymalstemcells 【AuthorSaddress】 SpineSurgery,NanjingDrumTowerHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNanjingU— niversity,Nanjing,210008,China 青少年特发性脊柱侧凸(adolescentidiopath— icscoliosis,AIS)是脊柱侧凸中最常见的形式.其 病因及发病机理至今尚未阐明[tl.但生长发育与 AIS的发生发展有着肯定的联系『21.大体形态学及 影像测量学研究发现,AIS患儿在青春发育期可 基金项目:江苏省卫生厅资助项目(项目编号:NJGL一2003011) 第一作者简介:男(1975一),博士研究生.研究方向:脊柱外科 电话:(025)83304616E—mail:scoliosis30@hotmail.com 能存在以软骨内成骨增强为特征的生长发育异 常『314】.分子生物学研究表明[51.骨形态发生蛋白 (bonemorphogeneticproteins,BMPs)能够诱导骨 髓间质干细胞(mesenchymalstemcells.MSCs)分 化为成骨细胞及成软骨细胞.体内外实验研究证 实,Smad1蛋白是BMPs信号途经重要的受体调 节型蛋白,传导BMPs受体的下游信号.在核内调 节靶基因的转录『6’7】.我们推测Smadl蛋白的表达 848中国脊柱脊髓杂志2006年第16卷第11期ChineseJournalofSpineandspi,~uCord,2006,Vol?16,No?11 可能与软骨内成骨的分子机制存在密切关系.为 此本实验采用体外培养扩增hMSCs,通过检测 Smad1蛋白的表达,探求AIS患儿软骨内成骨异 常可能的分子机制. 1材料和方法 1.1研究对象 3O例志愿者,实验组20例,均为AIS患儿,其 中男3例,女17例,年龄12,16岁,平均14.2岁. 对照组1O例,为非脊柱侧凸患儿,其中男5例,女 5例,年龄12,18岁,平均14.6岁.AIS的诊断基 于站立正侧位全脊柱x线片及详细的临床检查. 对于可疑患儿行全脊髓MRI检查排除可能存在 的中枢神经系统病变.AIS组侧凸Cobb角40., 75.,平均54.5..其中右胸弯l5例,胸椎双弯3 例,胸腰双弯2例.正常对照组由同一名脊柱外科 医师负责体格检查,排除脊柱侧凸以及生长发育 障碍和其他慢性疾病.其中股骨干骨折3例.骨盆 骨折,耻骨联合分离1例,臀肌挛缩症2例,腰椎 间盘突出症2例,股骨上段骨囊肿1例.股骨干骨 折术后1例.所有研究对象均排除血液系统疾病, 恶性肿瘤,严重器质性内分泌疾病,神经系统疾病 和骨代谢疾病.麻醉成功后手术前在无菌条件下 从髂前上棘处行骨穿刺抽取lOml骨髓,肝素抗 凝. 1.2主要仪器和试剂 低糖DMEM培养液(含青霉素,链霉素各 lOOu/m1)(Hyclone公司),胎牛血清(PAA公司), O.25%胰酶(Hyclone公司),Ficoll—Paque分离液 (1.077×103g/LAmersham公司),TrizolReagent (Invitrogen公司),琼脂糖(Promega公司),荧光标 ii~d,鼠抗人抗体CD45一FITC,CD29一FITC,CD44一 FITC,CD14一PE,CD34一PE,CD105一PE,HLA—DR— PE(BD公司),一抗为羊抗人Smadl抗体(RD公 司),二抗为兔抗羊IgG抗体(RD公司),蛋白抽 提液(Pierce公司),PVDF膜(美国Roche公司), FACSCalibur型流式细胞仪(BectonDickinson公 司),CK40相差显微镜(Olympus公司),Megafuge 1.OR冷冻离心机(Heraeus公司),PTC一200型 PCR仪(MJ公司),RT—PCR试剂盒(BD公司). 1.3实验方法 hMSCs的体外分离和培养,表型鉴定及总 RNA抽提参照文献『8I.采用BD公司的Titanium 一 步法RT—PCR试剂盒在MJ一200型PCR仪上 进行RT—PCR反应,Smadl上游引物序列:5一 GGCAACCGAGTAACTGTGT一3,下游引物序列: 5一ATGGAACGCTTCACCCACAC一3.扩增cDNA 长度为689bp.RT—PCR反应条件为:5O?1h,94? 5min,94oC30s,55?lmin,72oC1min,再循环34 次(从第3步始),72oC延伸lOmin,12oC结束.PCR 扩增产物在浓度为2%的琼脂糖凝胶上进行电 泳,TBE缓冲液终浓度为0.5x.采用Smartview 2001生物电泳图像系统对电泳条带灰度值 进行半定量分析.免疫蛋白印记检测参照文献【8J. 1.4统计学处理 各组电泳条带灰度值以均数?标准差(互?s)表 示,采用单因素方差分析法行两组间Smadl表达 强度的比较分析.全部数据处理采用SPSS13统 计软件,设定P<0.05有统计学差异. 2结果 AIS组及对照组hMSCs均分离培养,传代成 功.两组P2代单个核细胞膜表面CD45一FITC CD14一PE,CD34一PE,HLA—DR—PE检测均为阴 性,CD29一FITC,CD44一FITC,CD105一PE检测均为 阳性(图1). RT—PCR反应及电泳检测,两组hMSCs抽提 的总RNA经比色法测定OD260/OD280值均在 1.8,2.0范围内.AIS组与对照组Smad1蛋白 mRNA的平均表达率分别为4.48---0.58和1.03? O.22.AIS组hMSCsSmad1蛋白mRNA的表达水 平明显强于正常对照组(F=328.89,P<0.001)(图 2). 免疫蛋白印记检测Smad1蛋白的分子量为 58KDa,AIS组与对照组Smadl蛋白水平的平均 表达率分别为2.62_+0.55和O.84?O.22.AIS组 hMSCs受体调节型蛋白Smad1的表达水平明显 强于正常对照组(F=94.27,P<0.001)(图3). 3讨论 3.1Smad1蛋白在BMPs信号调控软骨内化骨分 子机制中的作用 机体内大多数骨尤其是躯干和四肢骨的形成 主要是通过软骨内成骨途径完成的.而参与软骨 内成骨的关键细胞——成骨细胞与软骨细胞来源 , , ?队l’… 一下 bM 849 一. 一 i? . 于hMSCs的增殖舒化分子生物学研究丧明, BMPs能够防导hMSCs分化为成骨圳胞及成轼骨 细胞I,冈此BMPs信呼途径很nJ能与软骨向化骨 的啊控帆制密柑戈研究丧驯.求届fSrnads 萤lLI家旌的Smad】嚣I’l是BMPs信号传导过程中 起重要作用的细胞子.传导的是1型手n? 蝗博氡酸激酶受伴的l,游信Smml1长 个结构域,N端的MHlC端的MH2和_f部的富 含脯氯酸的连接区?般认为.Sma,:t1蛋内被 BMI型受体澈后与共同介导型蛋IqSmad4 形成芹聚傩,胞浆进人恢内.以其(,端的MH2 直接与DNA结合+从m嗣靶基1嗣的转录71讲 究证实.Smadi蚩r1下游与BMI’s信号传递有是 的最重要的两个转凶子为Runx2盟S增强除促进成骨细胞分化外, 还可加速已增 殖分化的软骨细胞肥大化,同时刺激肥大型软骨 细胞表达更多的血管内皮细胞生长因子,诱导血 管侵入.从而上调软骨内化骨进程101.而Sox9转 录活性增强可加快hMSCs的聚集和向软骨细胞 分化.这对于骨骼的软骨内化骨进程来说同样也 是一种上调作用181.上述对软骨内化骨进程强势 调控的结果可能是导致AIS患儿青春期生长发育 异常的主要原因之一.具体表现在大体形态学方 面.AIS患儿的身高,坐高,臂长要高于同年龄健 康对照组11.Ganey等1”1研究发现,女孩在青春发 育期,脊柱前后柱的生长存在不同的骨化机制.前 柱的生长主要是生长板以软骨内化骨形式进行. 并持续到16,18岁.而后柱的软骨内化骨在10 岁时就已完成,之后主要以膜内化骨的形式环行 生长.据此我们认为.在青春发育期,AIS患儿软 骨内化骨的异常发生于脊柱主要表现为椎体高度 的增加,前柱相对过长于后柱,前后柱出现生长发 育不平衡.这一结论不仅与Guo等141报道的AIS 脊柱形态学变化一致.而且从分子生物学角度为 Dickson的脊柱前后柱生长不平衡假说提供了证 据. 本研究从BMPs信号通路人手.推测hMSCs 水平受体调节型蛋白Smad1的表达可能与BMPs 信号调控的骨骼生长的软骨内化骨分子机制间存 在相关性.初步结论基本可以解释AIS患儿脊柱 前柱过度生长以及身长相对较高的可能原因.但 Smad1蛋白作为BMPs信号通路中一个重要环 节,对于hMSCs软骨内化骨调控的影响只是其中 的一个方面,且BMPs信号通路也只是与软骨内 成骨相关的众多信号通路中的一条.因此从细胞 分子水平探求AIS生长发育异常确切的发病机制 还需大量的工作. 4参考文献 1.HeidariB.FitzpatrickD,SynnottK.eta1.Modellingofannulus fibrosusimbalanceasanaetiologicalfactorinadolescent idiopathicscoliosis[J].ClinBiomech.2004,19(3):217-224. 2.GotoM,KawakamiN,AzegamiH,eta1.Bucklingandbone modelingasfactorsinthedevelopmentofidiopathicscoliosis 【JJ.Spine,2003.28(4):364—371. 3.YlikoskiM.Heightofgirlswithadolescentidiopathicscoliosis 【JJ.EurSpineJ,2003,l2(3):288—291. 4.GuoX.ChauWW.ChanYL,eta1.Relativeanteriorspinal overgrowthinadolescentidiopathicsciliosis:resultsofdispro? portionateendochondral-membranousbonegrowth【JJ.JBone JointSurg(Br),2003,85(7):1026—1031. 5.RoelenBA.DijkeP.Controllingmesenchymalstemcelldiffer? entiationbyTGFI3familymembers【JJ.JOrthopSci,2003,8 (5):740—748. 6.MiyazonoK.Signaltransductionbybonemorphogeneticprotein receptors:functionalrolesofsmadproteins【JJ.Bone.1999,25 (1):9l一93. 7.WanM,ShiX,CaoX.TGFI3/BMPsignalingincartilageand bonecells[J].Orthop.2002,l3(5):368-374. 8.孙强.邱勇.刘臻.等.SOX9在青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓 间质干细胞的表达及意义【J】.中国脊柱脊髓杂志,2006,16(3): 2l5-219. 9.SandellLJ.TowlerDA.Transcriptionofboneandcartilage genes[J].Orthop,2002,l3(5):375-381. 1O.孙强,邱勇.刘臻.等.RUNX2在青少年特发性脊柱侧凸患者 骨髓间质干细胞的表达及意义【J】.中国脊柱脊髓杂志.2005, 15(10):616—619. 11.GaneyTM.OgdenJA.Developmentandmaturationoftheaxi— alskeleton.In:WeinsteinSI.ed.ThePediatricSpine:Principles andPractice【M】.Philadelphia:LippincottWilliamsand Wilkins.2001.3-54. (收稿日期:2006—04—10修回日期:2006—06—05) (英文编审蒋欣) (本文编辑卢庆霞) 《中国脊柱脊髓杂志》创刊15周年纪念光盘出版 今年是中国康复医学会脊柱脊髓损伤专业委员会成立暨《中国脊柱 脊髓杂志》创刊15周年.15年来.在全国 广大脊柱外科医生的支持下,专业委员会的队伍不断壮大,其在脊柱 外科界的学术影响日益增高;《中国脊柱脊髓 杂志》在众多专家和读者的帮助和支持下也逐渐成为深受广大脊柱外科医生和相关专业人士欢迎的,具有较大影 响的杂志.为纪念杂志创刊15周年,编辑部委托清华同方光盘电子出版社制作了《中国脊柱脊髓杂志》创刊15周 年纪念光盘,收录了15年来历届学会委员和杂志编委名单,历次学术会议的纪要,部分编辑部活动纪实图片和杂 志创刊至2005年出版的所有期刊的,期刊内容可按”年,期,篇名,关键词,作者,单位,全文”进行检索.为您提 供方便,快捷的资料查询. 有需要者请与本刊编辑部联系.电话:(010)64284923,64206649;E—mail:cspine@263.net.cn