淋巴细胞亚群检测与临床肿瘤学的应用

淋巴细胞亚群检测与临床肿瘤学的应用 一、前言 肿瘤是否发生于机体的免疫状态，尤其是细胞免疫状态密切相关。肿瘤患者的免疫功能状态测定对于判断病情的发展，评价，评价手术和化疗的效果及判断肿瘤的预后具有重要的价值。一般情况下，免疫功能正常者预后较好，反之较差;晚期肿瘤或已经有广泛转移者，其免疫功能明显低下;在白血病缓解期，如免疫功能骤然下降，预示该病可能复发。因此在临床肿瘤治疗时，测定各种免疫功能是极为重要的。除动态监测如AFP、CEA等某些有预后意义的肿瘤标志物外，对肿瘤患者作系统的免疫学分析，特别是细胞免疫功能的测定有重要意义。肿瘤患者免疫功能状态评估指标包括T细胞及其亚群、B细胞、NK细胞和吞噬细胞等的计数及功能。以及血清中抗体、补体和某些细胞因子的水平等。 二、CD分子与所对应的淋巴细胞 CD(cluster of differentiation)指的是分化群或分化簇。根据国际人类白细胞分化抗原协作组(International Workshop or Human Leukocyte Differentiation Antigens,HLDA)对CD抗原统一编号命名;至今发现至少有350种CD分子。CD分子绝大多数是跨膜的蛋白或糖蛋白，少数是碳水化合物，有些与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接锚定在细胞膜上。 CD3:CD3分子是组成TCR复合物的重要成分，其功能是负责向细胞内转导抗原刺激信号。主要分布于各阶段T淋巴细胞面。 CD4:CD4为单链跨膜糖蛋白分子，主要分布于Th细胞和部分胸腺细胞表面;CD4是Th细胞TCR识别MHC-?类分子-抗原肽复合物的辅助受体(co-receptor)，参与TCR识别特异性MHC-?类分子-抗原肽复合物的信号转导。CD4也是HIVgp120的受体，可与其发生特异性结合。 CD8:CD8有两种表现形式:一是由α/β链借助二硫键连接组成的异二聚体，主要分布于αβT细胞亚群，即细胞毒性T淋巴细胞(TL或Tc)和部分胸腺 细胞表面;二是由α链组成的同二聚体，主要由γδT细胞表达，部分NK细胞也可表达CD8分子。 CD19:CD19与CD21、CD81构成B细胞活化的辅助受体，CD19/CD21/CD81复合物可降低BCR活化的阈值，其中CD21识别BCR结合抗原上的补体片段，使CD19与BCR交联，加强信号转导，从而促进B细胞活化，这对B细胞初次应答尤为重要。CD19分布于B细胞发育的各个阶段。 CD16:CD16分为CD16a和CD16b。CD16a表达于NK细胞和巨噬细胞上，属于免疫球蛋白超家族，是一种跨膜分子，是IgG复合物的低亲和性Fc受体，能促进IgG复合物与抗原结合。能调节吞噬作用，也能调节抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。CD16a作为NK细胞的标志物，其抗体可用于ITP的Fc受体阻断治疗。CD16b是GPI锚蛋白分子，临床上PNH患者的粒细胞上CD16b减少或缺失，是细菌感染和血中免疫复合物形成的原因之一。 :CD56别称为Leu-19、NKH1或神经细胞黏附分子(N-CAM)，表达于NKCD56 细胞，CD4/CD8T淋巴细胞亚型，脑和神经-肌肉接头及多种肿瘤细胞上。CD56作为NK细胞特异性标志，可用作临床检测NK细胞及相关疾病的诊断依据。 CD分子及其对应的细胞: CD3 T淋巴细胞(总T淋巴细胞)64.62~77.08, CD4 Th(辅助性T淋巴细胞)32.69~44.23, CD8 Ts(抑制性T淋巴细胞)24.81~35.99, CD19 B(B淋巴细胞)6.38~12.46, CD16+56 NK(自然杀伤细胞)14.47~30.27, CD4/CD8 1.04~1.72 三、淋巴细胞亚群的临床意义: 1、CD3+T淋巴细胞:为总T淋巴细胞，反映机体细胞免疫功能。 增高:见于CD3+表达的T系淋巴细胞白血病，某些自身免疫性疾病(如SLE)，重症肌无力，慢性活动性肝炎。 降低:见于恶性肿瘤，早期改变不明显，中晚期出现明显下降，放射治疗下降更明显;也可见于某些白血病(如B系细胞白血病)，先天性免疫缺陷病，获得性免疫缺陷综合征，多发性骨髓瘤，传染性单核细胞增多症，应用免疫抑制剂，以及过劳等造成机体免疫功能处于相对较低的其他一些情况。 2、CD4+T(Th)淋巴细胞:Th为辅助性T淋巴细胞，与表达MHC-I类抗原的细胞结合，分泌白介素等细胞因子，以刺激B淋巴细胞以及CD8+T细胞的增值分化，又可刺激B7因子等免疫启动因子的生成，使T细胞活力提高，免疫反应增强，阻止肿瘤细胞的生长与转移。反之肿瘤细胞可产生或分化出一些抑制细胞和抑制因子，可抑制CD4+T细胞的产生和活性，从而降低机体抗肿瘤的能力。 CD4+T(Th)淋巴细胞降低:见于恶性肿瘤，常表现为明显降低，且随肿瘤分期不同而下降幅度亦不同;也可见于遗传性免疫缺陷病、AIDS、应用免疫抑制剂(如环孢素A)等患者中皆可降低;肿瘤患者的放射治疗，随着剂量和疗程增多下降越明显。 3、CD8+T(Ts)淋巴细胞:抑制性T淋巴细胞，Ts细胞直接作用T、B淋巴细胞表面的同类受体，封闭与肿瘤细胞结合的受体，降低机体对肿瘤细胞的免疫反应，Ts细胞还可分泌多种免疫抑制因子，抑制机体的免疫反应。CD8+T细胞中还包含一群细胞毒性T淋巴细胞(Tc)，Tc细胞能直接识别MHC-I类抗原的肿瘤细胞，通过破坏靶细胞的细胞膜和细胞核，从而杀伤肿瘤细胞，而恶性肿瘤患者的Tc细胞的细胞毒性明显受到抑制，Tc细胞明显减少。因此，恶性肿瘤患者外周血Ts细胞增加，而Tc细胞相对减少，故CD8+T淋巴细胞常常表现为略升、正常或略降。CD8+T(Ts)减少:见于γ免疫球蛋白缺乏症，胸腺发育不良，严重联合免疫缺陷病，肿瘤放射治疗等。CD8+T(Ts)升高:单纯CD8+T升高多见于病毒感染，如HBV、HCMV、EB等。 4、CD19+(B)淋巴细胞:B淋巴细胞反映了患者的体液免疫水平。 升高:见于MM、巨球蛋白血症、淋巴瘤、AIDS等。 降低:见于原发性免疫缺陷病，如性联无丙种球蛋白血症，恶性肿瘤，恶性肿瘤患者早期改变不明显，晚期出现明显下降，说明恶性肿瘤晚期患者不仅表现为细胞免疫功能下降，亦表现为体液免疫功能的下降。 5、NK细胞(CD16+56+):NK细胞在免疫系统中起着举足轻重的作用。它不依赖抗体、补体及预先致敏即可快速杀死肿瘤细胞，并与单核细胞，粒细胞等协同作用，而起到抗肿瘤抗感染的免疫调节作用。但其活性可被肿瘤分泌的免疫抑制因子和免疫抑制细胞所抑制，而降低了机体对肿瘤细胞的清除力。 增高:见于某些病毒感染性疾病的早期，长期使用干扰素或干扰素的诱导物，骨髓移植术后，习惯性流产，IL-2治疗后。 降低:见于恶性肿瘤，特别是中晚期伴有转移的患者，免疫缺陷病及使用肾上腺激素等免疫抑制剂，部分病毒、细菌和真菌感染，某些白血病及白血病前期。 6、CD4+/CD8+(Th/Ts):目前大多数研究文献表明，肿瘤在形成发展过程中，产生或分泌可溶性免疫抑制因子，可诱导CD8+T(Ts)的产生同时，阻止CD4+T(Th)的形成和成熟而导致CD4+/CD8+的比值下降。Th/Ts的比值更能反映机体细胞免疫功能受抑制的情况，同时可以用观察肿瘤患者的治疗情况和肿瘤细胞的转移情况。Th/Ts的比值还可以用来评价自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患者免疫缺陷的病人的免疫状态，还用于监测接受移植患者的免疫状态。增高:可以是Th淋巴细胞增高或Ts淋巴细胞减少所致，见于某些自身免疫病(如:SLE)、多发性硬化症、器官移植排斥反应等。降低:可以是Th淋巴细胞减少或Ts淋巴细胞增高所致，见于再障、某些白血病、传染性单核细胞增多症、获得性免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤、结核等。一般的病原微生物感染不同程度上将引起Th淋巴细胞数量上的降低，导致Th/Ts比值倒置，且以全身性感染时Th亚群的这种变化幅度最为明显，另外以侵袭和破坏机体免疫系统的感染引起的变化幅度最大。临床抗感染治疗有效时，可以观察到Th细胞数量上的增加以及Th/Ts的比值逐渐恢复。器官移植术后，CD4+/CD8+的比值较移植前明显增加，则预示可能发生排斥反应，比值降低时预后良好。 四:不同治疗方式对淋巴细胞亚群的影响 1、手术治疗:手术治疗时，手术创伤和有无肿瘤残余病灶，对外周血淋巴细胞亚群分布的影响是有差异的。手术创伤较小时，各淋巴细胞亚群恢复较快，反之较慢;进行根治术后其恢复亦比有小残余病灶快。 2、化疗:许多化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时也损害宿主的淋巴细胞并降低机体的免疫力。化疗对淋巴细胞亚群的影响，主要与化疗药物的作用机制、化疗、疗程有关。 3、放疗:放疗对淋巴细胞是一种特异性损伤，以前认为放疗对CD4+的影响较大，而CD8+对放疗不太敏感且恢复也较快。最近pilloai等报道，放疗后患者B、CD3+、CD4+和CD8+均明显减少。各亚群的恢复时间随肿瘤负荷的增加而减缓，CD4+/CD8+的比值在放疗初期变化不明显，随放疗增加、时间的延长逐渐升高。复发者明显减低，且维持在较低的水平。 4、免疫治疗(生物治疗):免疫调节剂，可以对机体淋巴细胞亚群促进其数 (PSK:云芝多糖，量增加、功能增强。比如在化疗时或化疗结束后加用PSK是 可诱生干扰素)，CD8+绝对数明显减少，而CD4+明显增加，则CD4+/CD8+的比值明显升高，说明免疫调节剂可以加快化疗引起的免疫伤害的恢复速度。通常肿瘤患者在放疗或化疗后淋巴亚群都会处于一个低水平，给予?-干扰素治疗后，患者CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+都有很大改善，说明干扰素可以促进淋巴细胞亚群的分化、成熟与释放。 5、放射免疫治疗(同位素治疗):放射免疫治疗后，患者外周血CD3+、CD4+明显增多、CD4+/CD8+的比值明显升高、机体的免疫功能明显增强，放射免疫治疗还可通过机体免疫功能来杀伤肿瘤细胞。 五、临床评价: 1、了解机体(宿主)的免疫情况: 恶性肿瘤的生长是由于肿瘤细胞增殖与宿主免疫调节的平衡失调所致。免疫调节的中心枢纽是CD4+和CD8+细胞，CD4+细胞具有辅助、诱导其它免疫细胞如Tc、B细胞和巨噬细胞等的功能，而CD8+除能抑制上述免疫细胞外，还可有细胞毒作用，可杀灭其它靶细胞。肿瘤最重要的免疫紊乱之一是由CD8等抑制 细胞引起的免疫抑制增强，表现CD4减少，CD8增加，CD4/CD8降低，而且这些变化常常与肿瘤负荷的变化相关，如晚期肿瘤患者CD4/CD8比值降低常常主要因CD4明显减少所致，表明患者免疫系统的严重损害。因此，测定肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群，可以了解机体免疫状态，更有助于理解免疫反应和肿瘤进展、临床期别、预后估计及疗效评价的关系，并进一步理解肿瘤的发生机制。 2、协助诊断: 外周血淋巴细胞亚群的检测虽无组织学和解剖学部位的特异性，但由于恶性肿瘤与良性肿瘤病变之间的明显差异，以及在肿瘤早期甚至在癌前病变时即可有明显改变，如CIN和宫颈微小浸润癌。因此测定患者外周血淋巴细胞亚群，尤其是CD4/CD8比值可协助临床对恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断。 、病程进展观察: 3 患者肿瘤负荷的变化常引起外周血淋巴细胞亚群的相应改变。晚期恶性肿瘤患者CD4和CD4/CD8较早期明显减低，而CD8又明显增高。日本人在80年代对两组宫颈癌患者进行研究，复发组宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群随着临床分期越晚其恢复亦越延缓。比较宫颈癌放疗后复发和未复发患者可以看出CD4+/CD8+比值有重要价值，因为在复发患者CD4+和CD4+/CD8+常比未复发者明显减低且维持在较低水平，甚至在治疗前复发组患者即显示低值。监测CD4+变化在宫颈癌患者中有前瞻性意义，而CD4/CD8比值的特征性改变可作为一个判断病情的指标，在复发患者必然为低CD4/CD8比值，故CD4/CD8比值又与预后不良相关。利用流式细胞仪对淋巴亚群综合分析有助于鉴定高危复发患者。在一些实性肿瘤(如乳腺癌)患者中CD4/CD8的降低，早期多由CD8增加所致，而晚期多因CD4减少有关。 4、评价疗效: 肿瘤患者的治疗效果明显影响外周血淋巴细胞亚群，肿瘤的复发与否外周血淋巴细胞亚群可表现不同，更与肿瘤患者手术后残留灶大小和有否残留，或是否加用免疫调节剂等外周血淋巴细胞亚群均反应出来。在判断疗效时也要考虑肿瘤期别和治疗手段、疗程、机体的耐受等的影响。 5、淋巴细胞亚群监测的影响因素: A、肿瘤患者PBL亚群测定虽然可反应宿主免疫状况，但同时确受很多外界因素的影响，如:衰老、妊娠、麻醉、手术和使用糖皮质激素等均可使CD4减少;吸烟和使用甲氰咪呱可使CD4增加;运动、急性应激、输血、性活动及肾上腺素等可使CD8增加;慢性应激也可使CD8减少。 B、PBL亚群测定和其他临床测定一样同样受操作技术，取样时间以及伴发的其他疾病的影响。 C、PBL亚群测定并不能完全反映整个淋巴系统的内部情况。如CD4包括TH和Ti(T诱导)细胞。CD8可分为TC和TS细胞各个亚群的作用是不同的。因此，PBL亚群检测除尽量减少外界因素干扰外，更应进一步分析CD4和CD8的亚型变化并激活肿瘤组织浸润性淋巴细胞亚群的改变，综合分析判断以期得出患者免疫情况的正确结论。