Diff-Quik染色精子形态参数与精子顶体功能和受精能力的关系

Diff-Quik染色精子形态参数与精子顶体功能和受精能力的关系 湖北省自然科学基金计划面上项目 申 请 书 湖北省科学技术厅制 2005年9月 名 称 Diff-Quik染色精子形态参数与精子顶体功能和受精能力的关系 研妇产科学其他学名称 临床医学 名称 妇产科学 名称 涉及学科究科 A B C （专业） 项代码 320 代码 320.31 代码 目 起止年月 2007年1月至2008年12月 申请金额 5万元 承第一承担 郧阳医学院 担单位名称 单通信地址 湖北省十堰市人民南路30号 邮编 442000 位 情单位性质 A.高等院校 ? B.科研单位 ? C.其它 ? 况 硕士总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 生 5 2 1 2 0 0 0 出生专业技术学术带项姓 名 彭海英 1976.9 助教 是?否? 年月 职称 头人 承目电13597905Phying917@yahoo.com.担负学 位 博士?硕士?学士? E-mail 话 917 cn 项责 目人 通信地址 湖北省十堰市朝阳中路23号 邮编 442000 组姓 名 出生年月 专业技术职务 工作单位 项目中的分工 情 张昌军 1960.5 教授、主任医师 郧阳医学院附属人民医院 体外授精 况 王华 1964.6 主任医师 郧阳医学院附属人民医院 超促排卵、取卵 杨敬宁 1972.8 副教授 郧阳医学院 男性学 罗清炳 1975.6 技师 郧阳医学院附属人民医院 半透明带试验 为了研究精子形态与顶体功能和受精能力之间的相关性，本研究建立Diff-Quik染 色和荧光标记的豌豆凝集素试验确定形态学参数体系，采用半透明带试验，获得结合到 研摘透明带上的精子，确定有结合能力的精子畸形程度、精子畸形指数、不同畸形类型比等究 内形态指标。通过半透明带试验研究各形态参数与顶体结合功能的相关性；根据形态参数要 容 设置不同精子密度进行体外受精，研究形态参数与受精能力的关系，选择最精确的受精和 意密度，从而提高受精率和不育症治疗效果。 义 主1．主题词数量不多于三个；2。主题词之间空一格。 题 词 精 子 形 态 顶 体 功 能 体 外 授 精 胚 胎 移 植 全球约10%-15%的育龄夫妇有生育障碍，常规的手术、药物或激素治疗对相当一部分不 育患者的治疗效果不明显。目前世界上人类生殖临床多趋向于借助辅助生育技术治疗不育 症，其中以体外受精(in vitro ferti1ization，IVF)和卵胞浆精子注射(intracytoplasmic Sperm injection，ICSI)的治愈效率高。ICSI是人工显微注射精子到卵胞浆内，精子只要 具有正常遗传物质可以受精。ICSI可能将一些外来基因物质(如细菌、病毒等)带入受精卵，男性的某些遗传病也可能通过ICSI传给后代，故目前绝大多数人认为只有IVF不能治疗的病人才做ICSI。与ICSI不同，IVF的受精过程，精子须经历一系列的受精事件，如获能、项体 反应、与卵透明带识别结合、穿透卵透明带与卵黄膜融合等，才能完成受精。 精子功能包括精子存活能力、动力学性质、精子与透明带结合及反应等，精子功能低 下而导致的男性不育，大多都是精子与卵子透明带结合能力低下或完全障碍。精子要具备 完整的生理功能与透明带结合、顶体反应，穿过透明带与卵黄膜融合方能受精。 有受精潜力的精子，与卵胞浆融合前，必须能够识别卵透明带上的精子受体，与之结 [4-5]合和穿透卵透明带。人的精子只能与人卵的透明带结合，不与任何动物卵的透明带结合。因此，精子与透明带结合试验必须用人卵进行。一直有研究试图解决人卵来源的困难，例 如用基因重组分子生物学技术合成人透明带糖蛋白，但合成的糖蛋白没有生物活性，既不 [6-10]与精子结合又不能诱发顶体反应，，迄今仍只能用人卵来做试验。 [1-3,14]Liu DY 等1988年利用体外受精项目中未受精卵的透明带来评价精子结合上透明 带的能力。另外，在IVF和ICSI治疗时，有些未成熟卵子不用于治疗，也可用来做精子与卵 [11-13]透明带结合试验。Yanagimaehi等发现可以把这些受精失败的卵子存放于硫酸胺盐溶液 中，使用前再用培养液洗掉盐份，这种可保存卵子6个月至1年。由于卵子的质量不能 [12-14]保证和测定，研究者还建立了精子与透明带结合试验的内质控。最成功的就是半透明带试验，原理与上面的方法类似，只是这种方法把一个卵平分切割成两半，一半透明带与 正常人精子培养，而另一半与病人精子培养，以两种精子结合率为指标评价精子结合到透 明带的能力。 综上所述，通过精子功能检测试验来评估精子的受精能力，不仅存在试验材料来源与 数量有限的问题，而且具有很高的显微操作技术难度，耗费高，耗时长，必须另辟蹊径。 精子顶体(acrosome)是精予细胞特有膜相帽状结构。在自然受精和体外受精过程，精一卵 融合前精子必须发生顶体反应，顶体完整性则是正常顶体反应的基础，其正常功能是受精 的前提。 精子顶体可以通过染色识别，精子染色的方法很多，WHO精液分析手册推荐有改良巴氏 染色和Shorr染色，这两种方法的主要染料是苏木精，Kruge因此建立了简便的苏木精和伊 红染色的Diff-Quik法。进行精子形态分析需对精液涂片染色。在涂片制备上，近年有人主 [15]。WHO推荐仔细检查每条精子张把精液标本用生理盐水洗涤，去除精浆后用精子悬液制片 的头部、颈及中部、尾部和胞浆小滴，如全部正常，为正常精子。异常精子有以下5种：(1)头部畸形：精子头部过大、过小、呈圆形，顶体异常，尖头、梨形头，空泡>20％或为双头。(2)颈及中部畸形：头颈部连接异常，中部肿大、弯曲、变粗或变细。(3)尾部畸形：尾部过短、 、发针般、断裂或卷曲及多尾。(4)胞浆小滴：呈绿色常出现于颈部，也可在 其它部位出现。(5)复杂畸形：有2个以上部位畸形。五种畸形精子的比率总和为畸形精子 率，正常精子率=1—畸形精子率，WHO认为正常精子率>30%，精子正常。但是对正常人精液形态分析发现精子畸形率高达80%，所以精子形态与功能的关系的复杂远超出这种比率 关系。 已经有学者在进一步研究精子形态与功能的关系。研究不育病人精子与透明带结合反应 发现，与透明带结合异常的分别为：精液分析正常患者有1 3％，中等精子畸形患者(正常精子形态6％～10％)有21％，严重精子畸形患者(正常形态?5％)有31％，而少精症患者(精 6子计数<20×10／mL)则有28％。进一步对精子与透明带结合正常的病人再作顶体反应测 定，即把结合在透明带上的精子吹打下来，测定透明带诱发顶体反应，很惊奇地发现，透 明带诱发顶体反应低下(接近DZPIAR的水平)分别为：精液分析正常病人有28％，中等精子 [16]畸形病人有38％，严重精子畸形病人有48％，少精症病人则高达69％。 用形态学方法检测顶体时，不能确定顶体是完整还是反应过的，顶体反应过的精子不 能与透明带结合的。测定顶体多采用特异性荧光染色法，其中最简便实用的是荧光标记的 [17]豌豆凝集素(Pisum sativnm aggluti n．PSA)法。PSA与顶体物结合，在荧光显微镜 下，正常完整的顶体占精子头前部1／2～3／4，染后呈很强的荧光。而顶体反应过的精子 只有在头的中间部位有一条细小的荧光带， 该方法稳定，结果较准确。 综上所述，建立精子形态分析体系评价精子功能是完全可行的，而且具有很大的临床 意义。但是还存在以下方面的问题。首先是形态评定标准，Kruger标准与WHO的精子形态标准都有研究已经证实其预测的准确性较高；其次，精子畸形比率和畸形复杂程度，哪个更 能预测精子功能；第三，精子形态结果能否用于改善体外受精操作，并提高受精率，与胚 胎的质量的关系。 本项目基于此，着力于建立稳定可靠的精子形态染色方法和PSA法，确定形态学参数体 系。采用半透明带试验，获得结合到透明带上的精子，确定有结合能力的精子畸形程度、 精子畸形指数、不同畸形类型比等形态指标，研究精子形态学指标与功能的相关性，指导 临床，从而达到正确选择受精方式和受精精子浓度，提高IVF妊娠率的目的。 1. ESHRE Andrology Special Interest Group．Consensus workshop on advanced diagnostic andrology techniques．Hum Reprod,1996,1l(7)：l463-79． ＆Baker HWG．Use of oocytes that failed To be fertilized in vitro 2. Liu D LopataA to study sperm—oocyte interaction：comparison of sperm-oolemma and sperm-zona pellucida binding，and relationship with results of lVF．Reprod Fertil Dev， I990，2(6)：64I-50． 3. Liu DY＆ Baker HWG．Tests of human sperm-zona pellucida binding and penetration．In Male Factor in Human lnfertility．Tesarik J．Ares-Serono Symposia Publications．Frontiers in Endocrinology．Volume 8.Rome.Italy. 1994．Pl69～ 85． 4. Bedford JM．Sperm-egg interaction：the specificity of human spermatoz- oa．Anat Rec，1977，188(4)：477-83． 5. Liu DY Lopata A，Pantke P et a1．Horse and marmoset sperm bind to the zona pellucida of salt stored human oocytes．Fertil Steril．199l，56(4)：764-7． 6. van Duin M，Polman JEM，de Breet lTM，et a1．Recombinant human ZP protein ZP3 produced in Chinese ham sterovary cell induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm-egg fusion．Biol Reprod，l994，50(4)：607-l7． 7. Brewis IA，Clayton R，Barratt CLR,et a1．Recombinant human zona pellucida glycoprotein 3 induces calcium influx and acrosome reaction in human sperm atozoa．Mol Hum Reprod,1996,2(8)：583-9 8. Whitmarsh AJ，Woolnough MIL,Moore HDM,et a1．Biological activity of recombinant human ZP3 produced in vitro：potential for a sperm function test．Mol Hum Reprod,1996，2(12)：911～9． 9. Dong KW，Chi TF，Juan YW,et al. Characterization of the biologic activities of a recombinant human zona pellucida protein 3 expressed in human ovarian teratocarcinoma (PA-1)cells．Am J Obstet Gynecol，200l，184(5)：835-43． 10. Martic M，Moses E，Adams,el al Recombinant human zona pellucida proteins ZP1,ZP2 and ZP3 co-expressed in a human celIline．Asian J Andro1, 2004．6(1)：3-l3 11. Yanagimachi R，Lopata A,Odom CB，et a1．Retention of biological charac- tristics ofzona pellucida in highly concentrated salt solution：the use of salt-stored eggs for assessing the fertilizing capacity of spermatozo- a．Fertil Steril， l979．31(5)：562-74． 12. Liu DY,Lopata A，Johnston WIH, et a1．A human sperm-zona pellucida binding test using oocytes that failed to fertilize in vitro．Fertil Steril, 1988,50(5)： 782-8． 13. Liu DY＆ Baker HWG．Evaluation and assessment of semen for lVF／lCS1．Asia J Androl,2002,4(4)：281-5． 14. Burkman LJ, Coddington CC,Franken DR,et al. The hemizona assay(HZA)： development of a diagnostic test for the bjndjng of human spermatozoa to the human hemizona pellucida to predict fertilization potentia1．Fertil Steril， l988，49(4)：688-97． 15. 方丛，庄广伦，张敏芳，舒益民.精子形态对体外受精的影响作用.中华泌尿外科杂志， 2001，22（6）：367-9 16. 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输卵管因素不育夫妇原因不明不育夫妇 人卵收集、保存 妇 手淫取精 体外授精 卵子显微切割 正常精子形态标准的建 精子组项分析 立与掌握 理化性质和动力按照WHO与Kruger记录结合受精率、胚胎顶体过反学性质的掌握 观察形态参数 的精子数 质量记录 应率 统计分析 二、拟采取的研究方法 1.门诊病人的筛选 到本中心接受辅助生殖技术治疗的门诊病人，详细询问病史，完善精液常规、遗传、生殖 免疫、基础内分泌等检查后，确定不育原因，选择10位单纯输卵管原因不育患者精液作为精子 的正常对照，40位不明原因不育患者的精子为研究对象。女方基础卵泡12个-20个。 2.精液组项分析 2.1常规精液分析 所有筛选病人在门诊精液常规检查时，使用CASA分析，记录精液的理化特性和动力学特征。 2.2形态学分析 精液1000转/分离心10分钟，去掉悬液，加等量37?生理盐水，轻轻吹打将沉淀重悬，再 6次离心后，调整精子密度至40x10/ml，取10ul制备涂片，室温下干燥后，用Diff-Quik试剂 盒，严格按照说明书步骤染色，在x1000倍镜下分析精子，分析200个不重叠、头尾完整的精子的头长、宽，胞浆小滴。异常精子按照WH O（1992）标准以下5种记录：(1)头部畸形：精子头部过大、过小、呈圆形．顶体异常，尖头、梨形头，空泡>20％或为双头。(2)颈及中部畸形：头颈部连接异常，中部肿大、弯曲、变粗或变细。(3) 部畸形：尾部过短、 规则、发针般、断裂或卷曲及多尾。(4)胞浆小滴：呈绿色常出现于颈部，也可在其它部位出现。(5)复杂畸形：有2个以上部位畸形。同时异常精子按照Kruger's 标准（1986）记为：（1）不定形头：头直径 2.0-2.5 um,头部形状轻微不规则，但顶体正常为轻度不定型；完全无顶体，或顶体小于头 的 30% 大于头部70%， 头部形状完全不规则记为严重不定形头。（2）颈部畸形，颈部有碎片或增粗，而头部正常的为轻度不规则，颈部弯曲或中段长于30%为严重不规则。（3）其它畸形如圆头、小头、大头、椎形头、双头、双尾、卷尾、胞浆小滴等按照WHO标准。 精子畸形指数=（头部畸形精子数+颈部畸形精子数+尾部畸形精子数+其它畸形精子数）/畸形精 子数 畸形精子指数=（头部畸形精子数+颈部畸形精子数+尾部畸形精子数+其它畸形精子数）/计数精 子总数 2.3 PSA试验 生理盐水洗涤的精子不经固定，直接与精子活力染料PI和FITC-PNA混匀标记后，荧光显微镜下观察，记录每个精子的PI信号和PNA信号。其结果PI+为死精子；PI－/PNA+为顶体反应精子；PI－/PNA－为顶体完整的活精子。 记录顶体完整的活精子数和顶体过反应精子数，分别计算其顶体完整和过反应的精子的比 率。 3.半透明带试验 受精失败或不成熟的卵子，保存在高浓度的硫酸胺盐溶液：2 M硫酸铵/ 40 mM Hepes + 0.5%右旋糖苷溶液， pH 7.0，使用前用生理盐水洗净表面盐离子，在显微操作仪下将人卵细胞对切 成两 半，以微吸管吸净卵细胞浆，得到2个完全相同的半透明带作配对研究，每份标本作两个半透明带实验。用多聚赖氨酸包被玻板支持半透明带，分别滴加100 μl活精子，表面覆以矿物油，37?分别共孵育2h、4 h。冲洗半透明，观察结合到透明带上的精子，并计数结合的精子 数。 4.体外授精 女患者进行超促排卵，卵泡达到18mm日肌注HCG10000U，36小时后B超引导下取卵，记录卵子成熟度。取卵日男方手淫取精，精液经Isolate密度梯度离心上游后，取5ul进行PSA试 验，计数顶体完整的精子百分比和精子密度。根据顶体完整精子率、精子畸形率、畸形精子指 数、精子畸形指数设4个受精密度，随机与卵子授精。取卵后第一天观察记录受精卵子数，计 数每个卵子上结合的精子数。至移植当天连续观察胚胎分裂情况和胚胎质量。 5.统计分析 2 检验,分析精子畸形率、精子畸形指数、畸形精子将以上数据整理，绘成表，采用检验及x 指数、顶体过反应率、顶体完整率、受精密度、受精率、卵裂率和胚胎质量间的相关性。 三、技术关键和难点 1.精子形态学指标的准确测量 2.根据精子的形态参数确定准确的精子受精密度 3.卵子的保存和两个完全等同的半透明带的获得 四、项目创新点 1.首次结合了Diff-Quik和PSA两种方法确定精子的形态，避免了苏木精和伊红染色法不能对 精子顶体的完整性进行识别的缺点。 2.首次提出根据精子的形态参数设置不同的授精密度，指导临床，提高受精率。 五、年度计划 2007, 1—2007, 12： 1) 卵子显微切割技术的掌握； 2) 半透明试验体系的建立； 3) 精子正常形态学指标的确立； 4) Diff-Quik染色和PSA试验观察标本的形态学参数 5) 门诊病人的筛选，辅助生殖技术的治疗； 2008, 1—2008, 12： 1) Diff-Quik染色和PSA试验观察标本的形态学参数 2) 门诊病人的筛选，辅助生殖技术的治疗； 3) 进行数据统计分析，撰写总结报告，进行学术交流。 1、申请者和项目组主要成员业务简历 (1)申请者和项目组主要成员业务简历 彭海英，女，助教，硕士，生于1976 年9月。2000年7月毕业于华中农业大学遗传学专业，获学士学位，并继续攻读该专业硕士学位，掌握了细胞生物学、及分子生物学的 常规技术，2003年获得硕士学位。2004年开始从事生殖医学专业，本项目申请者，全面 负责本项目设计及组织实施。 张昌军，男，生于1960年5月，1985年7月加入中国共产党。教授，主任医师，郧阳医学院附属人民医院副院长，武汉大学医学院、华中科技大学医学院硕士研究生导师。1994年世界首创“人精子单倍染色体无酶G显带方法”，1994年完成“超声波对人精子单倍染色体的影响”研究，鉴定达到国内先进水平；1996年完成“吸烟对人精子单倍染色体的影响”研究，鉴定达到国内先进水平，获1996年度湖北省科技进步三等奖。1997年湖北省首例试管婴儿研究主持者，相继主持开展了选择性减胎术、卵浆内单精子注射、 附睾及睾丸取精ICSI、多级梯度离心/上游复合法优选精子、激光辅助孵化、囊胚培养、 序贯培养、B超定位胚胎移植等项工作并获得省、市多次科技奖励，其 1997年完成的“三级梯度离心离心/上游复合法优选精子在体外受精与胚胎移植中的应用”研究，鉴定达国 内先进水平，获98年度湖北省科技进步三等奖。 王华 ，女，1962年9月15日出生，主任医师、副教授。参与建立湖北省首例试管 婴儿研究体系，主持“国产药物降调节促排卵在卵浆内单精子注射中的应用”研究获十堰 市科技进步一等奖，主持“改良绞杀器在多胎妊娠选择性减胎术中的应用”的研究获2001年十堰市科技进步二等奖。2003年“改进体外受精与胚胎移植研究体系的系列研究”获 湖北省科技进步二等奖。 罗清炳，男，生于1975年6月，技师。从事辅助生殖实验室工作9年，显微操作技术娴熟，经验丰富。是“多级梯度离心/上游复合法优选精子”、“激光辅助孵化”、“囊胚 培养”、“序贯培养”等研究的主要参加人。 (2)研究基础 十堰市人民医院生殖医学中心在湖北省率先开展了辅助生殖技术的研究，并诞生了湖 北省首例试管婴儿，是国家卫生部批准运行的辅助生殖机构。在辅助生殖领域获得了丰富 的研究成果: 1993年建立去透明带地鼠卵穿透实验体系，制备出湖北省首例人精子单倍染 色体核型，属全国第六家；1994年世界首创“人精子单倍染色体无酶G显带方法”，经杜传书等著名教授鉴定达到高级同类研究水平；获97湖北省科技进步三等奖。1994年完成 “超声波对人精子单倍染色体的影响”研究，鉴定达到国内先进水平；1996年完成“吸烟对人精子单倍染色体的影响”研究，鉴定达到国内先进水平，获99年度湖北省科技进步三等奖；1997年完成“三级梯度离心离心/上游复合法优选精子在体外受精与胚胎移植 中的应用”研究，鉴定达国内先进水平，获98年度湖北省科技进步三等奖；2001年完成“国产降调节促排卵药物在卵浆内单精子注射中的应用”研究，鉴定达国内领先水平，获 2001年度十堰市科技进步一等奖；2001年完成“改良绞杀器在多胎妊娠选择性减胎术中的应用”研究，鉴定达国内领先水平，获2001年度十堰市科技进步二等奖；2002年完成“白细胞介素6与肿瘤坏死因子α体外受精与胚胎移植结局的影响”研究，鉴定达国内领 先水平，获十堰市科技进步二等奖；“改进体外受精与胚胎移植技术体系的系列研究”获 2003年湖北省科技进步二等奖。 1997年诞生湖北省首例试管婴儿后，相继开展了选择性减胎术、卵浆内单精子注射、 附睾及睾丸取精ICSI、多级梯度离心/上游复合法优选精子、激光辅助孵化、囊胚培养、 序贯培养、B超定位胚胎移植等项工作，综合能力与成就据湖北省首位，全国先进行列。 申请者所在实验室在辅助生殖领域具有坚实的理论和实验基础，已建立了多项与本项 目有关的关键技术平台，能保证本项目的顺利实施。 （3）代表性论文 1、，刘浩等.吸烟对人精子单倍染色体的影响.中国优生与遗传杂志，2003， 11（6）：47－48 2、刘海湘，，刘浩，等.十堰地区1907例遗传咨询者细胞遗传学分析.中国优生与 遗传杂志，2004，12（5）：55－56 3、，周艳梅等.白细胞介素6及肿瘤坏死因子－α对体外受精－胚胎移植结 局的影响.郧阳医学院学报，2003，22（5）：257－261 4、，代炳梅，熊静等.经阴道超声引导下输卵管通液术96例临床分析.郧阳医学院学 报，2003，22（3）：172－173 5、刘浩，.激光在生殖医学中的应用进展.中华妇产科杂志，2005，40（1）：61－ 63罗议，陈双郧，张昌军.Survivin、MMP-2、TIMP-2在宫颈癌中的表达及其与侵袭、 转移的关系.西安交通大学学报（医学版），2005，26（2）：176－180 6、刘浩，等.一种快速稳定的人精子核双色荧光原位杂交技术的建立.武汉 大学学报（医学版），2005，26（2）：207－209 7、刘浩，激光在辅助生殖技术中的应用进展，国外医学计划生育分册， 2005，24（1）：7－9 推荐意见（申请者不具备高级专业职务或职称的，须由两名同行高级专业职务或职称的科技 人员推荐。） 该申请者平时注意生殖医学基础理论，积极关注本领域前沿性的研究，有自己的观点与 见解。本项目从建立精子形态学参数体系来评估精子功能与受精能力，立论具有创新性，研 究详实可行，同意推荐！ 推荐人（签章） 王华 职务（或职称）主任医师 专业 妇产科学 单位（盖章） . 精液常规分析应用于不孕症诊断和辅助生殖技术治疗，已不能满足于临床需要。本研究 查阅了大量相关文献，设定参数合理，实验方案可行，丰富了不育症诊断和治疗依据，同意 推荐！ 推荐人（签章） 张昌军 职务（或职称） 主任医师、教授 专业 生殖医学 单位（盖章） . 1.申请者所在单位学术委员会或专家组审查意见 经学术委员会讨论，一致认为：该项目建立意义重大具有创新性。 该项目负责人，不仅具有丰富的遗传学、生殖医学的理论知识和实践经验，而且学风 严谨，一丝不苟。具备完成此课题的多项技术和条件。 同意申报立项。 学术委员会负责人（签章） 2006 年 9 月 5 日 2．申请者所在单位领导审查意见（签署是否同意学术委员会或专家组意见，经费预算是 否合理，有无其他经费来源，能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等 基本条件的具体意见） 已对项目负责人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意校学术委员会审查 意见，并保证在该项目获得资助后，做到以下几点：严格遵守省科技厅科研项目计划管理 的有关规定，并按照1：1给予配套经费，保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作 时间等条件给予支持，保证项目保质保量的按时完成。 单位领导（签章） 单位（盖章） 年 月 日