【doc】氯胺酮对大鼠蓝斑核和内侧前额叶皮质c-Fos蛋白表达的影响

【doc】氯胺酮对大鼠蓝斑核和内侧前额叶皮质c-Fos蛋白表达的影响 氯胺酮对大鼠蓝斑核和内侧前额叶皮质 c-Fos蛋白表达的影响 中国疼痛医学杂志ChineseJoumalofPainMedicine201218,f2 doi:10.3969/j.issn.1006—9852.2012.02.011 氯胺酮对大鼠蓝斑核和内侧前额叶 皮质c—Fos蛋白表达的影响术 李刚纪蒙蒙刘慧高磊磊崔东红于剑锋'' (潍坊医学院麻醉学系,潍坊261053;上海市精神卫生中心,上海200030) ?99? 摘要目的:检测氯胺酮对大鼠蓝斑核(1ocuscoeruleus,LC)和内侧前额叶皮质(medialprefrontal cortex,mPFC)c.Fos蛋白表达的影响.方法:24只Wistar大鼠随机分为4组(n=6):对照1组,2组 (c1组,c2组),氯胺酮1组,2组(Kl组,K2组),分别腹腔注射生理盐水,氯胺酮100mg/kg.C1 组和K1组用于检测大鼠用药120min内的行为学变化和第120min时的热痛闻值;C2组和K2组 用于通过Westernblotting方法检测用药第120min时,LC和mPFC脑区Fos蛋白的表达水平.结 果:K1组较cl组热痛阈值明显升高(尸<0.05),运动亢进,刻板行为也有显着差异(P<0.O1).K2 组较C2组LC和mPFC处Fos蛋白表达均明显增多(P<0.05和P<0.o1).结论:氯胺酮可引起热 痛镇痛效应和行为异常,伴有LC和mPFC的Fos蛋白表达增加. 关键词氯胺酮;蓝斑核;内侧前额叶皮质;Fos蛋白;大鼠 E''ECI'SU量I'KEIAMlE0C一'USPRU'l'ElEXPRESSIONlL【JCUSC0ERULEUSAD MEDIALPREFRoNTALCoRTEXINRATS LIGang,儿Meng—Meng,LIUHui,GAOLei—Lei,CUIDong—Hong,YUJian—Feng" 1DepartmentofAnesthesiology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053;ShanghaiMentalHealth Centre,Shanghai200030) Abstract0bjective:Todetecttheeffectsofketamineonc-Fosproteinexpressioninlocuscoeruleus (LC)andmedialprefrontalcortex(mPFC)intherats.Methods:24Wistarratswererandomlydivided into4groups(n=6):control1,2group(C1,C2group)withintraperitonealinjectionofnormalsaline; ketamine— treated1,2group(K1,K2group)withintraperitonealinjectionofketamine100mg/kg.C1and K1groupswereusedtodetectthebehaviorchangeswithin120minandthermalpainthresholdsat120 min;C2andK2groupswereusedtodetectC— Fosproteinexpression1evelinLCandmPFCtissuesat120 minbyWesternblotting.Results:ThermalpainthresholdsinK1groupwassignificantlyhigher(P<0.05) thaninC1groupaccompanyingwithhyperactivityandstereotypedbehaviorr尸 <0.01).Thec-Fosprotein expressioninLCandmPFCofratsincreasedsignificantlyinK2groupcomparedwiththatinC2group <0.05.P<0.01.respectively).Conclusion:Ketaminemayinduceanalgesiceffectsonthermalpainand behaviordisorderaccompaniedwithincreasedc-FosproteinexpressioninLCandmPFC. KeywordsKetamine;Locuscoeruleus;Medialprefrontalcortex;Fosprotein;Rat 氯胺酮是一种临床常用的静脉麻醉药,具有镇 痛效果好,对呼吸和循环功能抑制轻,亚麻醉量有强 效镇痛效应等优点,但是它产生的精神副作用限制 了其临床应用.研究表明,大剂量氯胺酮可以使啮 齿类动物出现运动亢进,刻板行为等特殊的行为学 潍坊医学院大学生科技创新基金(KX2009012)资助课题 通讯作者 表现『2l.Lehner同研究发现,c—Fos基因的表达可以 作为神经元激活的标志.近年来,这一发现常被用 于神经系统的定位研究,也给氯胺酮的中枢作用部 位的研究带来新的方法.既往关于氯胺酮中枢作用 部位的研究多集中在丘脑,大脑皮层和边缘系统等 部位J.而蓝斑核(1ocuseoeruleus,LC)和中枢其它 与痛觉整合有关的核团在形态和功能上有着广泛的 联系,在痛觉传递,调控.和针刺镇痛过程1踟中起 着重要作用,同时,内侧前额叶皮质(medialprefrontal rx,mPFC)是内源性痛觉过敏调制系统的重要组 成部分,参与急性痛和神经病理性疼痛…l的调制. 本研究旨在采用蛋白定量技术检测氯胺酮处理大鼠 LC和mPFC处神经元c—Fos蛋白表达的变化. 方法 1.实验动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠24只(195,233g),购 白II1东鲁抗医药股份有限公司.随机分为4组(n= 6):对照l组,2组(c1组,c2组),氯胺酮1组,2组(K1组, K2组1,分别腹腔注射生理盐水,氯胺酮100mg/kg. Cl组和K1组用于检测大鼠用药120min内的行为学 变化和第120rain时的热痛阈值;C2组和K2组用于 通过Westernblotting方法检测用药第120min时Lc 和mPFC脑区c-Fos蛋白的表达水平. 2.试剂及仪器 (1)试剂:氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有 限公),兔抗Fos抗体,辣根酶标记山羊抗兔IgG, 小鼠抗B—actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限 公一J),辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(JL京鼎国昌 盛生物技术有限责任公司1,预染蛋白分子量Marker fSM0441,Fet~nentas),ImmohilonECL发光液fMillipore Corporation).其他试剂至少为分析纯. (2)仪器:DHP一9272型电热恒温培养箱(卜海 一 恒科技有限公司),SW一200光热尾痛测试仪(成都 泰盟科技有限公司),电泳仪JY600C(北京君意东方 电泳设备有限公司),TransferenceDecoloringShaker Ts一8(海门市其林贝尔仪器制造有限公司),x射线摄 影暗匣XJX—lIf上海跃进医用化学仪器厂),Thermo ScientificBiofugeStratos全能台式高速冷冻离心机, 680型全自动酶标仪(美国Bio—Rad公司),PRO200型 精密组织匀浆器f海季诺科贸有限公一J经销). 3.大鼠行为学检测 实验前将Wistar大鼠放置于安静,温暖,湿度适 宜,避强光的环境中,每日光照124,时,自由进食和 饮水,饲养至少48h,使之充分适应环境. 旷场实验fopenfieldtest),又名敞箱实验.敞箱 的制作参照BloklandI】方法.检测时间定于每天上 午10he,12N,~,首次检测之前对大鼠进行环境适应 囝疼痛医学杂志ChineseJouma1ofPainMedicine2012,18,(2 训练,每次半/J,H~,连续7天.测试前先将待测大鼠 放于敞箱中适应10rain,然后腹腔注射生理盐水或氯 胺酮,再将大鼠轻轻放入敞箱的正中格,立即用摄像 系统录制大鼠120rain的行为活动.每次仅测试一 只大鼠,全程共用旷场实验12次.录像结束后统计 出穿越底面的总格子数(四爪均跨过一格即为一格, 代表运动状态),转圈总次数(代表刻板行为)I.每 次实验后将箱中的粪便清除干净. 4.大鼠热痛阈值检测 行为学检测结束后即进行大鼠热痛阈值的检 测.用SW一200光热尾痛测试仪(第100档)测出各组 大鼠第120rain时的热痛阈值.方法如下:光源照射 安静大鼠尾部,当大鼠出现逃避性甩尾时,仪器自动 记录开始照射到出现甩尾逃避反射的时间,即为热 痛阈值(单位:s).为了预防大鼠尾部烧伤,当照射时 间达~1]20S时,终止照射,热痛阈值记为20S. 5.蛋白印迹fWesternblotting)检测 给予氯胺酮或生理盐水后不做行为学和热痛阈 值检测,以免干扰大鼠.等到第120min时腹腔注射 4%戊巴比妥钠f40mg/kg)深度麻醉,立即断头处死, 参照大鼠脑体定位图谱",准确切取Lc和mPFC, 放入加有细胞裂解液的EP管中,匀浆并分离提取总 蛋白溶液,然后转移至一80~C冰箱内保存. Westernblotting步骤如下:测定总蛋白浓度后, 以25g蛋白在10%SDS—PAGE胶上电泳分离之后 转印至PVDF膜上;然后用5%脱脂牛奶封闭4?过 夜,在室温条件下用兔抗c—Fos一抗溶液(1:500)中 孵育2h;经TBST缓冲液充分洗膜后将其置人辣根酶 标记山羊抗兔IgG~.抗溶液f1:2000)中室温孵育2h; 再用TBST缓冲液充分洗膜,最后用ECL试剂盒显像. 内参蛋白抗体选用小鼠抗B—actin一抗(1:1000)和 辣根过氧化物酶Ll_1羊抗小鼠IgG二抗f1:1000).以 c—Fos蛋白和B—actin条带的平均灰度值的比值代表 c—Fos蛋白的相对表达水平. 6.统计学方法 应用SPSS11.5软件包进行统计分析,所得数据 均以均数?差(X?S)表示,组间用f检验进行 分析,P<0.05为差异有统计学意义. 结果 1.大鼠痛阈检测结果 第120min时,K1组大鼠的热痛阈值(12.14-2.7 s)明显高于c1组(6.3?0.9s)(P<0.05,见图1). 中国疼痛医学杂志ChineseJournalofPainMedicine2012.18.f2 16 12 8 4 0 ControlKetamine 3.蛋白免疫印迹检测结果 第120min时,K2组大鼠Lc处Fos蛋白含量 (0.26?0.01)明显高于c2组(0.15?0.01)(尸<0.05), mPFC处c—Fos蛋白含量(0.56?0.07)也明显高于c2 组(0.25?0.02)(P<0.01,见图3). A C.Fos 13-actin 图1氯胺酮处理大鼠第120min时热痛阈值的变化.P<0.05, P<0.01,与Control组相比B Fig.1Changesofthethermalpainthresholdsoftheketamine—tre- atedratsatthetimeof120min.P<O.05.P<O.01.compared withcontrolgroup 2.大鼠行为学检测结果 Kl组大鼠跨越格子总数(921.6?485.1)明显高 于c1组(168.8?88.3)<0.01,见图2A),其转圈总数 (166.1?65.2)也明显高于c1组(1.8?1.5)<0.01,见 图2B1. A 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 B250 200 150 100 50 0 ControIKetamine ControIKetamine 图2氯胺酮处理大鼠运动状态(A)和刻板行为(B)的变化.P <0.01,与control组相比 Fig.2Changesoflocomotion(A)andstereotypedbehavior(B)of theketamine—treatedrats.P<0.01.comparedwithcontrolgroup 0.7 0.6 岳0.5 苇0.4 0.3 u_ 00.2 0.1 0 LC ControIKetamine mPFC LC ControIKetamine mPFC 图3氯胺酮处理大鼠第120min时,Lc和mPFC处c—Fos蛋白 表达的变化.Lc和mPFC处Fos蛋白的Westernblotting检测(A) 和统计学结果fB).P<O.05,P<0.01,与control组相比 Fig.3Changesofc—FosproteinexpressioninLCandmPFCofthe ketamine—treatedratsat120min.TheanalysisofWesternblottingof FosproteininLCandmPFC(A)andstatisticresults(B).P<O.05, P<0.01.comparedwithcontrolgroup 讨论 氯胺酮是一种NMDA受体阻断剂,镇痛机制较 为复杂,既有中枢作用机制,又有外周作用机制I15]0 氯胺酮的镇痛效应主要与阻滞痛觉的情绪成分有 关,而对身体感觉成分的影响较小11610近年来研究 发现疼痛的不同成分由不同痛觉系统介导.痛觉系 统分为内侧痛觉系统和外侧痛觉系统,其中内侧痛 觉系统主要由丘脑内侧核群和它所投射的边缘系统 以及前额叶组成,可能传递疼痛的情绪成分J. 这提示内侧痛觉系统中可能存在着氯胺酮作用的相 关脑区. LC位于第四脑室底,脑桥前背部,是脑中合成去 甲.肾上腺素fnoradrenergic,NA)的主要部位[19]0研究 发现Lc可能促进疼痛的双向调节",".LC—NA能 系统与情绪,行为及意识状态有关,能被多种应激 原激活,并对神经病理性疼痛有促成作用[24]0而 mPFC与痛觉调制系统有着广泛的联系口,能传导疼 一?一一oI|?m'J,c一cI一I.IJ.Jol|卜矗c一?o-Io.1o.IooI_c|1c一_o一 一coo.-:lo.IocIE:c一o上 痛中不愉快的情绪成分,同时还发现该部位接受 Lc内NA神经元的投射,这提示mPFC与Lc之间 有着一定功能联系,可能在疼痛的情绪成分调控中 发挥一定的协同作用. c—Fos基因是即早基因的一种,其表达产物为 c—Fos蛋白.正常情况下c—Fos基因在中枢神经系统 的神经细胞中仅呈极低水平的表达,不易检测到. 但当细胞受到外周伤害性刺激时细胞内c—Fos基因 迅速短暂的表达口.也有研究表明,c—Fos基因的表 达可作为神经元激活的一般性标志[31ac—Fos的表达 产物在细胞兴奋后数分钟即可检测到,本实验在腹 腔注射氯胺酮后2h检测c—Fos蛋白有明显表达,与 先前的文献报道l2"相一致. 既往研究发现全身应用氯胺酮可以诱导前额叶 皮质c—Fos基因的表达l],增强mPFC处谷氨酸,多 巴胺和NA及LC处NA的释放.本研究发 现,腹腔注射大剂量氯胺酮(100mg/kg)后第120rain 时大鼠的热痛阈值明显升高,伴有运动亢进,刻板行 为,同时还发现LC和mPFC处c—Fos蛋白的表达明显 增多,这些结果支持另外两个研究】.然而氯胺 酮导致这两个脑区的c—Fos表达增加是不是一种直 接效应,其增加与痛阈改变,刻板行为或者运动增强 效应有无特异性的相关性,仍然有待进一步研究. 综上所述,氯胺酮引起热痛镇痛效应和行为异 常,可以增加LC和mPFC内c—Fos表达.本研究有助 于理解氯胺酮的特殊药理学效应. 2 4 5 参考文献 HirotaK.LambertDG.Ketamine:itsmechanis. m(s,ofactionandunusua1clinica1uses.BrJAnae. sth.1996.77:44l,444. 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