前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究

前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究 前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究 【摘要】 目的 测定前列腺组织中DHT结合蛋白的DHT结合容量，研究睾酮、雌二醇、孕酮对DHT结合容量的影响，初步DHT结合蛋白与性激素作用的性 质。 20例正常前列腺组织，制备组织胞浆提取液，乙醚萃取去除提取液中所有的内源性类固醇激素，加入3H-DHT测定结合容量，并以等量和10倍量的T、E 2、Po与3H-DHT竞争DHT结合容量。结果 前列腺组织胞浆单纯DHT结合容量是(0.0143?0.0022)nmol/g湿组织，T、E2与DHT竞争结合蛋白的作用较强，降低DHT结合容量的作用比较明显，Po的结合作用较弱，对结合容量的影响较小。 结论 前列腺组织胞浆中的DHT结合蛋白组成复杂，性质各异，有很强的结 合DHT能力，与T、E 2、Po相互作用，共同影响前列腺组织中DHT的状态。 【关键词】 前列腺 雄激素 雌激素 孕激素 雄激素结合蛋白【Abstract】 Objectives This experiment is to quantify the total DHT (Dihydrotestosterone)-binding ability of DHT-binding proteins in prostate by assaying the DHT-binding capacity, and to study the change of DHT-binding capacity causing by the bination of T (Testosterone), E2(Estrodiol), Po(Progestosterone) and DHT-binding protein, and to analyze preliminarily the effects of sex hormone on DHT-binding protein of prostate.Method To obtain cytosolic fracions from 20 normal tissues taken from accident-death corpses without serious diseases, and then to remove all the endogenous hormone from the cytosolic fracions by ether stripping.To assay the content of the bound 3H –DHT. To add the same dose of T、E 2、Po to pete against 3H –DHT for DHT protein, and then to add 10 times dose of T、E 2、Po to pete with 3H –DHT for DHT protein. Results The alone DHT-binding capacity of the cytosolic fractions in prostate is (0.0143?0.0022)nmol/g wet tissue. T and E2 have more obvious effect on reducing the DHT-binding capacity of the cytosolic fraction while Po has less effect on reducing the DHT-binding capacity. Conclusions There are many kinds of DHT-binding proteins in the cytosolic fraction in prostate tissues and their mechanisms are different. The proteins have strong DHT-binding capacity, and they interact with T、E 2、Po to affect the DHT state in the prostate tissues. 【Key words】 Prostate Androgen Estrogen Progestosterone Androgen-binding protein 前列腺组织中存在多种二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)结合蛋白,,,，这些蛋白的性质和生理作用尚不十分明确。作者自2017年2月至2017年5月实验测定DHT结合容量来描述这些结合蛋白总的DHT结合能力，并以睾酮(CT)、雌二醇(E2)、孕酮(PO)与DHT竞争结合蛋白的作用研究正常前列腺DHT结合容量的变化，并初步分析DHT结合蛋白与性激素作用的性质。 1 材料和方法 1.1 前列腺组织标本 20例正常前列腺组织取自无严重疾患的健康男性尸体，年龄22,44岁，平均35.7岁。组织块获取距临床诊断死亡时间,15min。所有组织均 经病理证实。组织获取后以冰生理盐水洗净血迹，保留腺体实质部分，滤纸吸干，置入液氮中冻结，然后转放-70?冰箱存放待用。 1.2 试剂 3H-DHT购自中国科学院上海核技术开发公司( 1.2.4.5—3H -DHT，放射性比强度: 50ci/mmol，放化纯度: ,95%，放射性浓度: 1mci/mmol)，检测仪器为BECKMAN公司LS-6500型液态闪烁记数仪。E 2、T、PO为SIGMA公司产品。 1.3 实验方法 (1)胞浆提取液准备: 制备胞浆提取液,,,，去除胞浆提取液内源性类固醇激素，将胞浆提取液加入2倍体积的乙醚(萃取类固醇激素)，均匀而柔和震荡2min，静置6h，1000g离心1min，去除上层乙醚，重复1次，去乙醚后，静置过夜，以挥发残余乙醚，吸取所需量的下层样品。 (2)3H -DHT结合和测定: 3H-DHT溶液准备: 0.4ml3H-DHT试剂加入 冲液,1nM 磷酸二氢钾 1.2ml 99%乙醇混匀，取50μl溶于4950μl甘油磷酸盐缓 (KH2PO4)，氢氧化钠(NaOH) 微调至pH 7.4，含10% 甘油(Glycerol) (v/v) ,，3H -DHT终浓度为50nM。T、E 2、Po溶液: 先配置5mm pH激素浓度的异丙醇溶液，用99%乙醇稀释10倍，再以上述甘油磷酸盐缓冲液稀释1000倍，此浓度500nM，为3H -DHT溶液浓度的10倍，留取一部分备用;另一部分继续甘油磷酸盐缓冲液稀释10倍，浓度50nM，等同于3H -DHT溶液浓度，备用。另配不含任何激素的空白对照溶液，过程同。闪烁液: PPO 6g 、POPOP 0.3g 、 萘 50g 溶于甲苯 1000ml。操作步骤: 取已去除内源类固醇激素的样品，每一样品分为4份，每份350μl，分别加入20μl空白对照溶液、50nM的T溶液、50nM的E2溶液、50nM的Po溶液，然后所有样品溶液均加入3H-DHT溶液20μl，混匀，静置孵育18h。加入2倍体积的乙醚，均匀而柔和震荡 2 min(萃取未结合的3H-DHT)，1000g离心1min，去除上层乙醚，吸取200μl下层样品。实验同时以2份350μl PGB缓冲液各加入20μl 3H -DHT溶液分别作为空白对照记数(步骤同前)和总记数(略去乙醚萃取步骤，其余同前)。 以上全部操作在4?进行。 将吸取的200μl样品加入蛋白酶K(终浓度100μg/ml)、SDS(终浓度0.5%)，37?过夜，加入5ml闪烁液，轻微震荡2h做液闪记数。 以上为等量激素的竞争结合实验，再用500nM的T溶液、E2溶液、Po溶液替换相应的激素溶液，其余步骤同，做10倍激素的竞争结合实验。 根据已知3H -DHT含量的计数: (总记数cpm-空白对照cpm)，和待测样品的计数: (样品cpm-空白对照cpm)计算样品结合3H -DHT含量。 实验为同一样品不同处理的自身配对设计，统计分析为t检验。 2 结果 2.1 前列腺组织胞浆单纯DHT结合容量是(0.0143?0.0022)nmol/g湿组织，均数相当于4.2 ng/g湿组织。 2.2 与DHT等量性激素对胞浆DHT结合容量的影响，见1。加入 T或E2的DHT结合容量低于单纯DHT结合容量，有显着性差异(P,0.05)，Po的作用无显着性差异(P,0.05)。等量时T和E2作用的DHT结合容量低于Po，有显着性差异(P0.05)，但T和E2作用无显着性差异(P0.05)。 2.3 10倍于DHT量性激素对胞浆DHT结合容量的影响见表1，不但T或E2作用的DHT结合容量低于单纯DHT结合容量，Po作用下的结合容量也低于单纯DHT结合容量，均有显着性差异(P,0.05)。表1 20例标本性激素对DHT结合容量的影响(nMol/g湿组织)。