细胞核的分离

细胞核的分离 实验四 细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压;选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸(一种酸溶性蛋白)被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6,6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。 细胞核纯度的鉴定，可以从两方面进行，用光学显微镜或电子显微镜进行形态观察和生物化学方法进行酶活力的测定，某些细胞质的酶(如过氧化氢酶、碱性磷酸酶、淀粉酶和脂酶等)，在纯细胞核制品中活力应较低或检查不出来。 本实验以动物肝脏为材料用柠檬酸的方法分离细胞核，用光学显微镜观察细胞核的形态。 [实验用品] 一、材料:动物肝脏。 二、试剂: 1. 0.9 %氯化钠。 2. 1.5 %柠檬酸钠。 3. 0.25mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。 4. 0.88mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。 5. 台盼蓝染液:取0.4g台盼蓝，0.81g氯化钠，0.06g磷酸二氢钾和0.05g羟基苯甲酸盐于95ml重蒸水中，加热溶解后用1mol/l氢氧化钠溶液调ph值至7.2,7.3之间，最后定容到100ml。 三、器材: 1. 解剖器一套。 2. 高速组织捣碎机或组织匀浆器。 3. 离心机(能准确调速的)。 4. 台秤。 5. 光学显微镜。 [实验内容及方法] 一、细胞核的分离 1. 实验前24小时内动物须保持空腹，然后将动物断头杀死，取出肝脏，在生理盐水中充分漂洗除去血污，用滤纸吸去表面液体，将肝脏放入-20?低温冰箱过夜待用。 2. 取10g肝脏剪成小块，按1:10(重量:体积)加入1.5%柠檬酸溶液，用组织捣碎机或组织匀浆器破碎细胞(注意不要把细胞核破坏)，如果用高速组织捣碎机，要捣3次，每次5,10秒钟(转速为10 000,20 000r/min)。 3. 把捣碎液用4层纱布过滤，滤液以800,900r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀再用1.5%柠檬酸液洗一次。 4. 将沉淀再悬浮于100 ml 0.25mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液中制成悬液，将离心管内预先加好200 ml 0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液，并将上述悬液置于0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液之上以1 000r/min离心10分钟，即可得到较纯的细胞核沉淀。 二、细胞核纯度的鉴定 用玻璃棒碰一下细胞核的沉淀，放在载玻片上轻磨，然后加一滴台盼蓝(trypan blue)染色液，加上盖玻片，即可在光学显微镜下进行观察，高纯度的细胞核制品必须在计数400个核中不能有一个完整的细胞;在1 000个细胞中不能有一个带有细胞质的核。 [实验及思考题] 1. 绘制细胞核形态图sssss 2. 分析影响细胞核提取的主要因素。