柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建 柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的 构建 134 柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建 高久春黄红兰李凡?(吉林大学基础医学院,长春130021) 中国图分类号R392.2文献标识码A文章编号1000-.484X{2005)08-0583-03 【摘要】目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒.方法:用RT-PCR技 术,从柯萨奇B4病毒中钓取非结构 蛋白P2CeDNA片段,克隆入PUCm-T载体,转化大肠杆菌DHSa,构建重组质粒.结 果:以柯萨奇B4病毒的总RNA为,扩 增出987bp大小的片段,克隆入PUCm-T载体,用BamHI,Hind?双酶切鉴定,与非 结构蛋白C的PCR扩增产物片段大小 一 致.结论:成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒. [关键词】柯萨奇B4病毒(CVtM);1型糖尿病;非结构蛋白P2C;重组质粒 ConstructionofrecombinantnonstructuralP2CplasmidincoxsackieB4virus GAOJiu-Chun,HUANGHong-Lan,LIFan.SchoolofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China [Ab;hd]Objective-Toconst~zcttherecombinantnonstructuralCplasmidincoxsaekie134virus.Methods:UsingtheRT-PCR,we fishingthenonstructuralproteinP2CeDNAfractionfromCoxsaekie134virus(cvB4)andcloningintothePUCm-Tvector,thentr'~eritinto E.co//tOconstructtherecombinantplasmid.Results:UsingthetotalRNAofCoxsaclde134virusasmodel,wean1ed987bpfractionand clonedintoPUCm—TvectoridentifyingwithBamHIandHind? doubleenzyn~.ItsproductswereconsistentwithnonstructuralproteinP2C PCRproductions.Conclusion:Therecombinantnonstructural1'2Cplasmidwasconstructe dsuccesfullyineoxsaekleB4virus. [Keywords]Coxsackle134virus(CVB4);Type1diabetesmellitus;NonstmcturalproteinP2 C;Recombinantplasmid 1型糖尿病病因及发病机制尚未明确,病毒感 染做为最重要的环境因素与1型糖尿病之间的关系 成为人们研究的热点,柯萨奇病毒尤其是柯萨奇B4 病毒(CVB4)感染在1型糖尿病中起重要作用…. 最近研究发现,CVB4的非结构蛋白P2C与人胰岛素 面的谷氨酸脱羧酶(GAD)具有同源序列L2】.为 此,非结构蛋白C可能做为胰岛细胞表达的GAD 分子模拟物,诱发机体产生抗体,而这种针对非结构 蛋白P2C的抗体可与胰岛J3细胞表达的GAD发生 交叉反应,从而使胰岛J3细胞受到免疫损伤.为进 一 步探讨CVtM感染在1型糖尿病中的作用,本研 此研究 究构建了CVtM非结构蛋白P2C重组质粒.国内外未见报道. 1材料与方法 1.1病毒,细胞及菌株CVtMMKSP8株,HeLa细 胞,E.coliDH5a均为本室保存.PUCm—T载体由东 北师范大学曾宪录教授惠赠. 1.2试剂IMDM,胎牛血清购自Sigma公司; T4DNA连接酶为上海生物公司产品;各种限制 性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司. ?通讯作者 作者简介:高久春(1958年一),男,副教授.主要从事生物学研究. 1.3引物设计根据CVB4非结构蛋白C基因序 列设计上下游引物,上游引物5端引入BamHI酶 切位点,下游引物5端引入HindIll酶切位点,再在 两条引物的5端加两个保护碱基CG,GC,由上海生 物工程公司合成.5一CGGGATCC从ACAACTGGC TC一3;5一GCAAGC唧ACTGGAAGAGCGCCTC一3. 1.4病毒培养10%FCSIMDM调整人宫颈癌(He一 【a)细胞数为1×106ml,,接种100TCIDmCVB4液 200I,吸附1小时后加适量的细胞培养液,37?, 5%CO培养.3—5天后细胞病变达80%左右时收 获病毒. 1.5病毒总RNA提取实验所用塑料制品均用 0.1%DEPC浸泡过夜,玻璃器皿常规洗净烘干后 l8O?烤箱干烤,取l0Inl病毒悬液,用异硫氰酸胍一 步法提取CVB4总RNA-3J. 1.6逆转录PCR提取的总RNA在Oligo(dT)引 导下,经AMV逆转录酶合成其第一条链cDNA,再用 P2C特异性引物进行PCR反应,扩增目的片断为987 bp,扩增条件:94?变性1分钟,94?30秒,55?1 分钟,72?2分钟,共30个循环,最后72?延伸5分 钟.扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后采用低融 点琼脂糖法回收. 1.7基因重组,转化和鉴定回收的目的片段与 PUCm-T载体在TDNA连接酶的作用下进行重组, l6孵育I6小时,将连接物转化人感受态E.coli DH5d中,将菌液铺于含氨苄青霉素(mnpiciL!in,AP), (异丙基硫代廿D一半乳糖苷)和x一(5.溴一氯一 3一吲哚一半乳牯苷)的LB琼脂平板,37?培养14, l6小时,选白色菌落,接种于含AP的Lf{培养基上. 用碱裂解法小量提取质粒,Ban~{I和Hind?酶}刀 后用琼脂糖凝胶电泳检验酶切效果. 2结果 2.1CVB4总RNA的提取HeLa是CVB4病毒的 易感细胞.接种病毒约3,5天左右,80%的细胞出 现较明显的细胞病变.此时收获病毒,提取总RNA. 经紫外分光光度仪测定其0D=0.34,O‰= O.18,oR,一189,大于1.8,说明提取的RNA纯 度可直接用于eDNA的合成 图1 ng. ?.. 圈2P】C-PUOna-T重组质粒插入片段的酶切鉴定 F.2The,~e,~i'KatinofinsertedCfragrantinrecombinant C-PUCtr~Tplasmidbyristridionenz)vr,e旦igls洳0n N0【…1^|m,一'l~ff141.2Ne~tive吲1mofnCandPUCra-T; 3P】C?PUCk1f】?+B帅仉l(2773b?+987bp);4.Prod. ucIi嘶0fc蚰lLn恤n;5.PL'Cm-T/2773. 2.2非结构蛋白P2CRT—PCR产物的初步鉴定以 病毒的总R'qA为模板,将其逆转录成eDNA,再以此 eDNA为模板,用c特异性引物进行PcR扩增.预 计扩增出片段为987bp.结果显示,RT_PcR产物略 大于DNAmarker中的925bp的条带,从分子体积上 符合连预期的DNA片段(图l】. 2.3重组质粒的酶切鉴定将FCR产物回收纯化 后在LDNA链接酶的作用下与PUCm—T载体按摩尔 比3:1进行连接,转化处于感受状态的大肠杆菌 DH5e,将转化产物接种到台lPrG,x,gal的氨苄抗性 平板上,进行蓝白斑筛选.从平板上挑选单一白色 菌落,提取质粒,用BanffIl,Hind[11双酶切鉴定,经 1%的琉脂糖凝胶电泳证实,此重组质粒共含3760 bp,酶切释放一长度为987bp的片段,与非结构蛋 白c的PCR扩增产物片段大小一致(图2).从而 筛选出阳性克隆,重组质粒命名为C.PUGn.T. 3讨论 近年有报道易感个体对环境因素特别是病毒感 染或化学毒物刺激反应异常,直接或问接影响胰岛 细胞使胰岛素分泌不足而发生I型枯尿病.在 CVB4爆发流行其间,突发l型椭尿病的病人人数增 加,并可在患者体内查出高滴度的抗C'~q34抗 体.本课题组前期工作也表明我国流行的cvB4 亲胰腺株可以感染S~,is小鼠引起类似人类1型糖 尿病的症状.而且CVIB无论在体内还是在体外均 可侵犯人胰岛口细胞,导致其合成胰岛素功能受 损.越来越多的证据表明,肠道病毒特别是 CVB4与1型糖尿病的发生密切相关,但其发病机制 尚不清楚,这也是我们目前研究的内容. 谷氨酸脱投酶(GAD)是人体的正常酶蛋白,主 要存在于人脑及胰岛组织中.GAD与CVB4非结构 蛋白c在某些氨基酸序列上非常相似.目前通过 动物实验发现,大量非结构蛋白c抗性阳性的动 物其GAD抗体也阳性.非结构蛋白c与GAD问 存在强烈交叉反应,如果将被柯萨奇B组病毒感染 的小鼠或人的血清预先吸附被纯化鼠的GAD,则可 抑制这些血清对非结构蛋白c及GAD的免疫反 应?. 迄今为止,国内这方面研究极少,仅见有数篇关 于IDDM患者自身抗体及抗CVB4抗体的检测报告, 主要源于很难获得非结构蛋白c制剂.为此+本 实验在国内外研究的基础上+以我国流行的CVB4 感染HeLa细胞后提取总RNA,构建了CVB4病毒非 誊??篆l9-{{?】:S;;;. 高久春等柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建第8期 结构蛋白I)2C重组质粒,为探讨CVB4感染与I型 糖尿病之间的关系奠定了基础. 我们的下一个目标是将I)2C蛋白进行克隆表 达,并近一步验证生物学功能,揭示其在1型糖尿病 发病中的作用. 4参考文献 1}{y0tyH,HiltunenM,KnipM.Aprospectivestudyoftheroleofcoxsackie BandotherenterovimsinfectionsinthepathogenesisofIDDM[J].Dia— betes,1995;44(6):652-657. 2HeffandRF.Serologicalevidenceoftl1erelationshipbetweenenterovlms一 infectionandtIdiabetes[J].1nfecDis,1995;172(5):1206一 l2l1. 3Man&up—poulsenT.Onthepathogenesisofinsulin—dependentediabetes mellitus【J].D~ishMBull,1988;35(5):438-443. 4S~nbreokJ,h'hschFE,ManiatisT.分子克隆实验指南[M].北 京:科学出版社,1989:343—350. 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