灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作用

灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作用 灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作 用 免疫学杂志第22卷第3期2OO6年 571IMMUNOLOGICALJOURNALVo1.22No.3May2OO6'283' [文章编号]1000-8861(2OO6)O3-0283-03 灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作用 王斌h,萱垣舁,李杰芬(1.广州中医药大学基础医学院a.中医诊断教研室.b.中医基 础公共实验 室,广州510405;2.El本第一药产株式会社,El本高山8177324008) 【摘要】目的观察灵芝多糖(GP)对小鼠脾脏树突状细II~(dendrirticeeUs,OCs)的增 殖作用.方法采用Ivl'rr法,以细 胞因子(GM.CSF+IL4)作比较,观察不同质量浓度GP以及细胞因子+不同浓度的 GP对小鼠脾脏DCs的增殖作用.结果GP (580IIlL)可明显刺激小鼠脾脏Dcs增殖,与细胞因子组相比,其较高质量浓度组 (20,40,80t,e,/mL)作用明显;GP+细胞因 子,与对照组相比均有显着的增殖作用,且明显高于细胞因子组.结论GP不仅能促 进小鼠脾脏DCs的增殖,而且与细胞因 子有显着的协同作用.具有类生长因子和协同生长因子的作用. [关键词]灵芝多糖;树突状细胞;增殖;脾;小鼠 【中图分类号】R285.5【文献标识码】A EtTeetsofGsn(1~empolysaccharidesonproliferationofdendriticcellsinnlIlsespleen WANGBin,KAYAGAKINoboru,LIJie— fen(DepartmentofDiagnosticsofTraditionalChineseMedicine,C,uangzhou UniversityofTraditionalChineseMedicine,,?,幻u510405,China) [Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofGanodermapolysaccharides(GP)onprolif erationofdendriticcells(DCs)from mousespleen.Metho~Bysettingthecytokines(GM-CSF+ ?,4)illscontrol,theeffectsofGPandcytokine+GPonDCproliferationin mousespleenwereinvestigatedbyMTr.ResultsComparedwiththecytokine,GP(5— 80t,e,/mL)couldstimulatetheproliferationofDCs significantly,especiallythehighconcentrationsofGP(2o,40,and80tlg/mL).TheeffectofG P+cytokineonprollfemtionofI)CWIllShigher thanthatofGPOrcytokine.C饵 KIIGPmayp1.ytheregulatoryrolebyitsgrowthfactor-likefunclJonandbycooperatingwith thecyto- kineinthel~lttionofI)Cs. [KeyWOldS]GanodermaPolysaccharides;Dendriticcells;Proliferation;Spleen;Mouse DCs是已知机体内功能最强的抗原提呈细 胞(antigenpl~sentingcell,APC),能在体内外直接激 活初始(naive)T细胞,是自体,异体混合淋巴细胞反 应中重要的刺激细胞,其作用比其它APC强l0 100倍….随着近年来人们对于抗原呈递分子机制, T细胞激活分子机制等方面的突破性认识,DCs的研 究El益受到人们重视,尤其是近几年来,DCs在肿瘤 免疫治疗中作用倍受瞩目,体外经肿瘤抗原冲击致 敏的DCs,回输体内可以有效激活并扩增肿瘤特异 性CTL,增强机体特异抗肿瘤免疫力].但DCs数 量极微,仅占单核细胞的1%左右,占小鼠脾脏的 0.2%一0.5%.这给DCs的研究和应用带来极大困 难.灵芝是我国传统的补益中药,具有滋补壮身,扶 正固本,延年益寿之功效,现代研究表明灵芝多 糖(ganodermapolysaccharides,GP)是灵芝的主要活性 [收稿日期】2oo4—11—15I[修回日期】2oo5—03—31 [作者简介】王斌(197o一),男,安徽阜阳市人,讲师,硕士.主要从 事分子生物学技术在中医药中的应用研究.(Te1)020- 39358016;(F_,-mail)wb5257@163.tom 成分之一,具有抗肿瘤及免疫调节作用.本实验应 用GP观察其对小鼠脾脏DCs增殖的影响,以期为体 外大量扩增DCs提供新的方法.同时,也为进一步 深化对某些中药免疫效应作用机理的研究建立初步 基础. 1材料与方法 1.1实验动物NIH小鼠,体质量l8—22g,雌雄不 限.由广州中医药大学实验动物中心提供. 1.2主要试剂RPMI1640为美国GIBCO产品,新 生小牛血清为杭州四季青公司产品,NTr为美国 Sigma公司产品.小鼠GM.CSF,购自PEPRO. TECH公司.灵芝多糖由El本第一药产株式会社提 供.兔抗鼠Ig(亲和层析纯化,1me,/mL)购自广州威 佳科技有限公司. 1.3树突状细胞的分离与纯化按照文献[5]的方 法进行. 1.4GP对增殖影响的测定实验分对照组.加入 完全培养基;细胞因子组,即小鼠GM.CSF-4-I,终 质量浓度分别为5和lll#mL;中药组,加入不同质 ? 284?免疫学杂志第22卷 量浓度的GP,终质量浓度分别为5,l0,20,40,80 mL;协同组,加入GM.CSF+IL广4+不同质量浓度的 GP.每组设3个复孔,置37?,50mL/LC02培养箱 中培养72h,每孔加入MTI"20,继续培养4h,2 000r/rain,10min,弃去上清液,加入200s/LSDS一500 mL/LDMF溶解液100ttL,37oC放置过夜,在550型 自动酶标仪(美国Biorad公司)上波长570nln处测 OD值. 2结果 2.1GP对D增殖的影响在实验用GP浓度范 围内(5,80vcCmL)均可显着增强小鼠脾脏DCs增 殖.说明GP单独使用即可明显刺激小鼠脾脏DCs增 殖.与细胞因子组相比,其中较高质量浓度组(20,40, 80vcCmL)刺激强度明显高于细胞因子组(表1). 表1GP对小鼠脾脏DCs增殖的影响 Tab1EffectsofGPonproliferation0fDCsfrommousespleen n=3;a)P<0.01,c0mwithcontrol;b)P<0.01, c)P<O.05,c0nwithcytokine 2.2GP协同细胞因子对小鼠脾脏D增殖的影 响不同浓度的GP加细胞因子组对刺激小鼠脾脏 DCs增殖有明显的协同作用,且与单独使用细胞因 子组相比,均有显着的协同作用(表2). 表2GP协同细胞因子对小鼠脾脏DCs增殖的影响 Tab2EffectsofGP+cytokineonproliferationofDEsfrom mol1.s~spleen _了 0.0830.433'0.993幽0. 897幽0. 903幽0. 727幽0. 697幽 sO.02lO.0320.0320.0500.02l0.0250-ml n=3;a)P<O.01,c0删)arwithcontrol;b)P<O.01,coin— paredwithcytokine 3讨论 DCs在体内分布广泛,但数量少而分散,其分离 及纯化的困难给在体或体外研究其生物特性及功能 造成很大困难.体外培养,GM.CSF是必不可少的细 胞因子,它具有促进DCs增殖分化,并能增强其表面 多种免疫分子表达功能.但GM.CSF同时对巨噬细 胞增殖亦有促进作用.与IL4联用时能协同诱导分 化成DCs并扩增,同时抑制巨噬细胞增殖及分化 作用,. 现代药理研究表明,灵芝具有多方面的生物活 性和药理作用.GP是灵芝的主要有效成分,具有免 疫增强和抗肿瘤作用.GP能增强小鼠巨噬细胞的 吞噬功能,引起小鼠巨噬细胞[ca2]i和[pH]i升 高,增加巨噬细胞内三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘 油(DAG)以及cAMP和cGMP的生成,在转录水平促 进小鼠巨噬细胞分泌细胞因子并影响其蛋白激酶活 性...并可通过诱导小鼠脾细胞中DNA多聚酶 活性和使细胞核DNA,RNA含量显着增加,从而促 进免疫细胞增殖L1.亦可显着促进刀豆素A(ConA) 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应【1.此外,GP还可增 加混合淋巴细胞培养液上清中IL-2和IL-3活性,体 外能促进小鼠脾细胞IL-2和IL-3mRNA的 表达]. 本实验从小鼠脾脏细胞中分离纯化出高纯度的 DCs,加入不同浓度的GP,并配合细胞因子(GM. CSF+IL_4),以观察GP对DCs的促增殖作用.结果 显示单独使用GP,在实验浓度范围内均可显着促进 小鼠脾脏DCs增殖(P<0.01),与细胞因子组相比 较,其中较高质量浓度组(20,40,80veJmL)刺激强度 明显高于细胞因子组(P<0.05),说明GP可能具有 直接刺激DCs增殖的作用,且其促增殖强度与浓度 有关.此外,实验结果亦显示GP配合细胞因子对小 鼠脾脏DCs的增殖具有明显的协同作用,与单纯使 用细胞因子相比,各质量浓度的GP均有显着性 差异. 综上所述,本实验结果显示GP对小鼠脾脏DCs 不仅有直接刺激增殖作用,而且还有与细胞因子起 协同效应的作用,具有类生长因子和协同生长因子 的作用.其确切机理有待进一步研究. [参考文献] I1jMassardG.TomsioMM,WihlmJM,eta/.rIhedendritic celllineage:aubiquitousantigen-presentingoIIIliza tion【JJ.AnnThoracSurg,1996,61(1):252—258, I2JNouriShiraziM,BanchereauJ,BellD.eta/.Derldri6c cellscapturekilledtlllllorcellsandpresenttheirantigensto elicittumor-speeitlcimlnunerespons~[J].JImmunol. 20OO,l65(7):3797—3803. [3JKuglerA,StuhlerG,WaldenP.eta/,Regressionofhuman metastaticrenalcellcarcinomaaftervaccinationwitIltlllnor cell-dendriticcellhybia~[J].NatMed,20OO,6(3):332— 336. [4]GongJ,AviganD,ChenD.eta/.Activationofantitumor cytotoxicTlymphocytesbyfusionsofhumandendriticcells andbre,~tca.1~inoHlacells[J].ProcNailAc耐SciUSA. 20OO,97(6):2715—2718. [5]许化溪,刘恭植.小鼠脾脏树突状细胞的分离与鉴 第3期王斌,等.灵芝多糖对小鼠脾脏树突状细胞的增殖作用.285' (上接第282页) 流感病毒和牛腹泻病毒等传染病的疫苗研制中,其 强效佐剂效应已得到充分的实验证实[5].在本研 究中我们首次将C3d引入肿瘤的抗血管生成疫苗 中,将其与VEGFR.2相连,构建一种靶向表达VEG. FR-2的血管内皮细胞的DNA疫苗,以期获得一种高 效,安全的肿瘤疫苗,为肿瘤治疗提供一种新的思 路.本研究的结果表明:Fu(1.弼与C3d3融合基 因不仅可在真核细胞Hela细胞中表达,且表达的目 的蛋白具有免疫反应性,该DNA疫苗的成功构建为 下一步的动物实验奠定了基础. [1] [2] [3] [4] [参考文献] BikfalviA,BicknellR.Recentadvancesinangiogenesis, anti-angiogenesisandvasculartargeting[J].TrendsPharma— colSei,2O02,23(12):576—582. ShibuyaM.Angiogenesis,anti-angiogenesis,andtunlorsup. pression【J].NipponYal(gal(uZasshi,2O02,120(5): 2:85—294. NiethammerAG,)(iaIlgR,BeckerJC,eta1.ADNAvac. cinear1stVEGFreceptor2preventseffectiveangiogenesis andinhibitstunlorgrowth[J].NatMed,213O2,8(12): 1369—1375. LiuJY,WeiYQ,YangL,eta/.Immunotherapyoftul~Ol'$ withvaccinebasedonquailhomologousvascularendothelial [5] [6] [7] [8] [9] growthfactorreceptor-2[J].Blood,2OO3,102(5):1815— 1823. 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