超声波对生物大分子盐析的作用研究

超声波对生物大分子盐析的作用研究 第25卷第4期 2005年l1月 山西化工 SHANXICHEMICALINDUSTRY Vl01.25No.4 Nov.2005 囊::::置;::磅 j蔓:辩砩与歼蓑寮:0r=:..::=====.-::0一::x:::.::.. 超声波对生物大分子盐析的作用研究 陈腊梅 (南京化工职业技术学院,江苏南京210048) 摘要:在蛋白质一水胶体溶液中加入无机盐,利用蛋白质盐析的原理分离蛋白质. 研究了不同频率 超声波对蛋白质盐析的影响,证明超声技术可加速盐析速度. 关键词:蛋白质;盐析;超声;频率 中图分类号:05.3文献标识码:A文章编号:1004—7050(2005)04—0013—02 引言 超声波应用于生物技术是一个比较新的研究领 域[.2].在生化制备中,许多物质都可以用盐析法 进行沉淀分离,如蛋白质,多肽,多糖,核酸等,但盐 析法应用最广的还是在蛋白质领域.对水溶性的蛋 白质来说,它的水溶液是亲水性胶体.蛋白质之所 以能悬溶于水中,形成稳定的胶体溶液,与其分子状 态有关.蛋白质分子面带有亲水性基团,它们很 容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,从而 使它们能顺利地进入水溶液中.另外,如果溶液的 pH值偏离于等电点,所有分子都带有相同的电荷, 又会进一步增进它们的分散能力.因此,凡是能破 坏蛋白质分子水化作用或者减弱分子间同性相斥作 用的因子,都有可能降低蛋白质在水中的溶解度,而 使它沉淀下来.超声波的机械传质作用[3]是超声 波在介质中传播时,可使介质质点进入振动状态.加 速介质中各组分的质量传递. 本文介绍了超声波的机械作用可促进盐析剂夺 取蛋白质水化层上的水分子,从而使蛋白质失去水 化层裸露出来,蛋白质容易凝聚析出. 1实验部分 1.1原材料及仪器 收稿日期:2005—07—26 作者简介:陈腊梅,女,1974年出生,2004年毕业于南京工业大学, 硕士研究生,讲师,现主要从事超声波作用的研究工作. 化学试剂:牛血清白蛋白(BSA),氯化钠和硫酸 铵均为纯. 试验仪器:压电陶瓷超声处理器(20kHz, 40kHz,500kHz);752型紫外分光光度计. 1.2常规试验与分析 1.2.1牛血清白蛋白浓度标准曲线的配制 表1不同牛血清白蛋白浓度下的光密度值 管号12345678 标准蛋白质/Il髫 蒸馏水/1L 蛋白质浓度/rag?mL一 吸光度(一280) 1.252.53.755.06.257.510.0 10101010101010 0.1250.250.3750.500.6250.751.0 0.0720.1530.2420.3160.3930.4760.627 按表1分别向每支试管内加入各种试剂,混匀. 选用光程为1cm的石英比色杯,用紫外分光光度 计,以第1管调零点,在280nm波长处分别测定各 管溶液的吸光度(Am).以吸光度为横坐标,蛋白 质浓度为纵坐标,得到标准曲线,其方程为Y: 1.5803x-I-0.0029. 1.2.2牛血清白蛋白溶液的盐析【 不同硫酸铵体积饱和度(溶液浓度随室温的变 化有轻微变化)对试验影响很小.蛋白质浓度均为 0.3mg/mL左右,溶液放置10h,第2天离心1h. 转速3000r/min.硫酸铵溶液的饱和度分别为 10%,30%,50%,70%,90%. 1)硫酸铵饱和度10%. 称取15.1mgBSA,溶于45mL生理盐水中,缓 ? 14?山西化工2o05年11月 慢加入5mL硫酸铵饱和溶液,边加饱和溶液边搅 拌,最后滴加.取配好的溶液5mL于离心管中,放 置过夜.第2天离心,测上清液在280nnl处的吸光 度. 2)硫酸铵饱和度30%,14.9mgBSA. 3)硫酸铵饱和度50%,15mgBSA. 4)硫酸铵饱和度70%,15rngBSA. 5)硫酸铵饱和度90%,14.7mgBSA. 以硫酸铵饱和度为横坐标,BSA收率为纵坐标 作图(见图1). 鞠00 蓍0占50l0o 硫酸铵溶液的饱和度,% 图1不同硫酸铵饱和度下的BSA收率 从图1可以看出:当硫酸铵溶液的体积饱和度 增大为70%时,牛血清白蛋白的收率明显增大.硫 酸铵溶液的体积饱和度继续增大,牛血清白蛋白的 收率增加平缓.而且当硫酸铵溶液的饱和度超过 70%以上时,由于溶液密度较大,所出现的蛋白质 沉淀都悬浮在上清液的表面,这样给沉淀分离造成 困难,且分离出的沉淀会出现凝聚成块,不易溶解的 现象,使后处理难度增加【5].综合以上的考虑,虽 然当硫酸铵饱和度为70%时,得率不是最高(收率 为90.5%),但是也比较高,与硫酸铵体积饱和度为 90%时牛血清白蛋白的收率(90.8%)相差不大, 且蛋白质沉淀不会悬浮在上清液的表面,从而有利 于蛋白质的分离,所以提取过程中我们采用饱和度 为70%的硫酸铵盐析. 1.2.3不同放置时间下牛血清白蛋白的盐析 蛋白质浓度均为0.3mg/mL,硫酸铵饱和度为 70%,溶液放置不同时间后,再离心40min,离心转 速为3000r/min. 堡120厂———————————————] 墼嚣———一l 蚕1『_育 静置时问/h 图2不同静置时间下牛血清白蛋白收率 从图2可以看到:静置5h后,牛血清白蛋白的 收率基本不再变化了.因此,当无超声波作用时,牛 血清白蛋白溶液加入硫酸铵溶液后,要放置5h才 能得到一个好的蛋白质收率. 1.3超声频率对牛血清白蛋白收率的影响 1.3.1为考察不同超声频率的影响,进行了试验内 容相同但超声波发生器频率分别为20,40,500kHz 的试验. 进行超声辐照后,无静置,立即进行离心实验. 超声波发生器频率分别为20,40,500kHz,功率分 别为0w,200w,0w,200w,0w,140w (即不同声压可调).牛血清白蛋白溶液的浓度C= 0.3mg/mL,超声辐照2rrfia,离IL,"转速3000r/min,离 心时间为40min,硫酸铵的体积饱和度70%,离心 后弃上清液,加入等量生理盐水,使沉淀的BSA再 溶解,测此溶液在280nm处的吸光度.所得结果 如图3所示: , ? ? 超声辐照声压/Pa +20kHz;—?一4OkHz;+5ookHz 图3不同声压对蛋白质收率的影响 由实验可见:对超声处理牛血清白蛋白时,不同 频率下有不同的最佳声压值. 1.3.2超声辐照后,静置不同时间. 作超声辐照2min情况下的不同静置时间的考 察,实验结果如表2所示.实验条件为超声辐照时 间为2min,超声辐照声压为50mV,频率20kHz, 蛋白质浓度为0.3mg/mL. 表2不同静置时间牛血清白蛋白的收率 频率?(声压)静置时间在280nln处的BSA的收率 /kHz?(mV)一/min吸光度A/% (下转第36页) 山西化工2oo5年l1月 [3] [4] ChenQH,HeGQ,MokhtarAMA1i.Optimizationof mediumccxntx~itionfortheproductionofdastaseby BacillusSp.EL31410withresponsesurfacemethodology [J].EnzymeandMicrobialTechnology,2002,30: 667—672. DeborahJClark,StevenJHawrylik,EdwardKavanagh, eta1.PurificationandcharaterizationofflUniqueA1ka? lineEhstasefrommicrococe~luteus[J].ProteinExpres. sionandPurification,2000,18i46--55. [5]SacharLA.Photometricmetlx~forestimationofelas- taseactivity[J].ProcSocExpetiBidMed,1955,90: 323. PresentSituationofMicrobiologyProducingElastase WANGJuan-li,WANGYi-qiaIlgl,LIDian.chu',CHENGJun-li (1.ShanxiLightlindustryCollege,TaiymmShanxi030013,China; 2.TheCentrolofControlingandPreventingDiseasesinShanxiProvince,XinzhouShanxi03 4000,China) Abstract:Elastaseisextensivelyusedinmedication,fo0d,dailychemistryandSoOil.Butthis kindofenzymeisproducedbypailcreas fromsol'ne~.imals,whichisshortagenow,microorganismcanproducethiskindofeI1zyme, andtheproductionCostislow.Atpre. sent,thestudyingisjuststayinginlabstate.Sotheresearchisimportant. Keywords:dastase;microorganism;filtrate (上接第14页) 2结论 实验结果与不同静置时间时蛋白质收率的实验 结果进行对比,20kHz对蛋白质盐析体系的作用效 果最好,使盐析时间缩短了大约4.5h;40kHz对蛋 白质盐析体系的作用效果次之,使盐析时间最多缩 短了约3.5h;在0w,140W的功率,500kHz盐析 对蛋白质盐析体系的作用较小,最好效果是使盐析 时间缩短了2.5h.从上面的分析可知:在仪器允许 的范围内,20kHz的超声波对盐析的促进作用最 大,使盐析时间缩短了4.5h,提高了生产效率,有很 好的经济前景. 参考文献: [1]郭孝武,林书玉,王蕊娥.不同频率超声对提取芸香甙 成分的影响[J].陕西师范大学(自然科学版), 1996,24(1):5O一52. 吕霞付,等.超声波在生物发酵工程中 [2]王武,杨海麟, 的应用[J].生物技术通讯,2001,12(4):310--313. [3]冯若.超声手册[M].南京:南京大学出版社,1999. 89—94,23—24. [4]高娃.硫酸铵的盐析作用[J].内蒙古教育学院 (自然科学版),2000,13(3):45--46. [5]郑江,王文星,黄水英.红毛藻中天然蛋白质色素的 提取研究[J].食品科技,2002(12):49—51. StudyontheUltrasonicEffectonProteinSaltingout CHENLa.mei (NanjingCollegeofChemicalTechnology,NanjingJiangsu210048,China) Abstract:AccordingtotheprincipleofsaltingoutofproteinSOlution,inorganicsalinewasad dedtocolloidSOlutionandtheprotein precipitatevcasobtained.Theeffectofdifferentfrequencyonproteinsaltoutvcasstudiedinth ispaperanditvcasshownthatultma~.. ictechnologycouldimprovesaltingoutrate. Keywords:protein;saltingOut;ultmsound;frequency