[doc] 重庆地区淋球菌青霉素耐药持粒图谱分析

[doc] 重庆地区淋球菌青霉素耐药持粒图谱分析 重庆地区淋球菌青霉素耐药持粒图谱分析 . , 7.R|l. 《中国抗生素杂志1992~17(1):68,7O 重庆地区淋球菌青霉素 耐药质粒图谱分析 俞晓峰冷泰俊周富道李兴隆刘本银 -. ,?—l———?—一 宦秉瑜?周玲?代祥安? (第三军医大学流行病学教研室,重庆630038) 摘墼对28株淋球菌进行抗生素敏感试验及其质粒图谱分析,结果发现:在7株青霉素耐 药淋球菌中,有4株淋球菌带有4.5-Md青霉素耐药质粒(R质粒)和2.6-Md的隐蔽质粒,其中有 3株菌同时还带有24.5-Md的接合质粒,从而首先在重庆分离蓟淋球菌青霉素R质粒. 斑词’’匙着雾参V,,翰 自1976年英国首次报道产青霉素酶淋球 菌(PPNG)以来,世界各地相继出现淋球 菌青霉素耐药株,且呈越来越严重的趋势. 淋球菌对青霉素耐药性的产生是由其所带青 霉素耐药质粒(R质粒)介导的u.李德如 等2曾报道重庆地区有33%的淋球菌分离株 对青霉素有耐药性.为了解重庆地区淋球菌 青霉素R质粒及其特征,我们对由重庆医科 大学附二院,重庆市性病监测中心及第三军 医大学西南医院性病门诊收集的淋球菌进行 了抗生素敏感试验及质粒图谱分析,并首先 在重庆分离到淋球菌青霉素R质粒. 材料与方法 一 ,菌种来源 取各医院性病门诊男性患者尿道分泌物 直接涂片,作革兰氏染色,显微镜下见多核 细胞内有肾形革兰氏阴性双球菌存在,初步 定为淋球菌. 二,培养及扳主素敏感试验 将初步鉴定的淋球菌接种于血琼脂培养 基,置培养皿于烛缸内,在36?下培养约36 小时后,观察其菌落形态及特征.氧化酶试 验呈阳性反应?进一步鉴定为淋球菌;筛选 符合的淋球菌单个菌落转种;选择5种 ‘G8. 抗生索药敏纸片(上海生化试剂所)对已分 离培养的28株淋球菌作抗生素敏感试验,观 察药敏纸片抑菌圈直径大小(包括纸片直 径),判定标准见表一. Tab1.Performancestandards forantimicrobialdisk susceptibilitytest IInhibitorydiskdiameter(ram)A ntibiotiel, lResist-IMildSUSce-fSuscept.I antelptibilityfibility PCG TC. KM CLDM EM ll l3 l4 l3 l6 22 18 19 l8 2l PCG,青霉素GITC四环素?KM.卡那霉素I EM.红霉索 三,质粒DNA提取及电泳鉴定 用无菌生理盐水洗下经血琼脂培养基培 养36小时的淋球菌菌落,收集于Eppendorf 管内,离心收集菌体;加溶菌酶液(5mg/mI) -重庆医科大学附二院临床微生物室. *?置庆性病监测中心. ?鸲” ,,,,, 24547 lil 10Ol,冰浴I5分钵,再]111o.2moI/LauI{ 一 1%SDS(十二烷基磺酸钠)200~I使淋球菌 . 完全裂解后,立即加入3mol/LNaAel50mI, 冰浴6O分钟,离心收集上清液400ul,用2倍 . 体积的酚一氯仿一异戊醇抽提;离心收集上 ‘清液350~1.再分别加入3mol/LNaAc351zl 和冰乙醇700,’l1.一2O?下过夜沉淀后,离 心收集质粒DNA.用TE缓冲液2O1溶解 DNA,并加入溴酚蓝5/~1;在0.8%琼脂糖凝 腚平板上电泳,电压65V,电泳2.5小时后, 用EB染色.在紫外线灯下观察结果并拍照, 按Meyerts~的方法测定质粒DNA的分子量. 结果 根据Tabl的判定标准,在对分离到的28 株淋球菌进行的抗生素药敏试验中,发现分 离株对青霉素具有耐药性的有7株,对四环 素有耐药性的有3株,对卡那霉素有耐药性 的有5株,对氯林霉素有耐药性的有1株; 其中菌株NG9021,NG9o26和NG9o27同时 具有对青霉素和四环素的耐药性(见Tab2). 对此28株淋球菌质粒图谱分析的结果表 明,在7株青霉素耐药淋球菌中,有4抹淋 球菌带有分子量为4.5-Md的青霉素R质粒. 其中菌株NG896,NG9026和NG9027同时 还带有分子量分别为24.5--Md的接合质粒和 2.6一Md的隐蔽质粒(见Fig1),且发现在 28株淋球菌中有25株分离株带有分子量为 Tab2.Penicilfin—resistance N.~jonorrhoeae strainsandtheirplasmlds ResistanceIAntibiotcIPlasmid strainsiresistanceJcoatent NG896PG.KN2.6.4..24.5 NG8910PG2.6 NG90l4PG,KAN.CLI2.6.4.5 NG902lPG.TET2.6 NG9024PG2.6 NG9026PG,TET,KAN2.6,4.5.24.5 NG9027PG.TET2.6,4.5,24.5 2.6-Md的隐蔽质粒. Fig1.AEarose(0.8%)gelelectroohor- es{SofplasmldDNAextractedfromN.gO- norrhoeae(8tof)andE.colf(g)strains. a,NG8910Ib,NG9021Ic,NG9014jd, NG896Ie.NG9026,f,NG9027Ig,E.coli V517Ichr.chromosomalDNA. 讨论 淋球菌质粒按其分子量大小一般可分为 3种:(1)24.5一Md(39kb)的接合质粒或 传递质粒,参与淋球菌R质粒的接合传递过 程;(2)4.5N4.7-Md(7.1,7.5kb)和3.2 , 3.4-Md(5.1,5.4kb)的R质粒,具有 编码TEM一一内酰胺酶基因相关的R因子, 形成对青霉素的耐药性;(3)2.6-Md(4.2kb) 的隐蔽质粒,约有9O%的淋球菌临床分离株 含有此种质粒.一般认为,4.5-Md的青 霉素R质粒因最初是由菲律宾菌株中分离到 的,故又称其为”亚溯型”R质粒,约占R质 粒的87%,而3.2-Md的青霉素R质粒首先来 源于西非,’.故又称其为”非iffI型”R质粒,只 占R质粒的13%c5.然而,这两种R质粒在分 子特征上却有许多相似之处,如它们均带有 4O的转座氨苄青霉素耐药性序列Tn2,此 转座子带有编码TEM一一内酰胺酶的结构基 因;两种R质粒之问DNA序列的同源性为 7O%,并且两种R质粒与产一内酰胺酶的流 感,副流感和杜氏嗜血杆菌R质粒密切相关. Dickgiesser等用限划性内切酶分析和异 双显性组合研究表明,两种R质粒的不同表 现在7.4-kb(4.6一Md)R质粒为5.3一kb(3.3 一 Md)R质粒含有一个2.1-kb的插入序列, 且由转变而得的5.3-kbR质粒稳定性明显 ?69?’ 如7.4-kb的R质粒.另外,Dillon等订发现有 65.2%的淋球菌分离株既带有4.5-Md的R 质粒,又带有R质粒转移过程所必需的24.5一 Md接合质粒l而在带有3.2-Md的R质粒淋 球菌分离株中却未见有24.5一Md的接合质粒 存在,提示带有4.5一MdR质粒的淋球菌在 其青霉素耐药性的传递方面更具有流行病学 意义(8.本文应用质粒图谱分析法并结合 抗生素敏感试验在重庆地区首先分离到淋球 菌的青霉素R质粒,并经电泳鉴定证明其乃 分子量为4.5一Md的”亚洲型”R质粒,且可带 有24.5一Md的接合质粒.由于”型洲型”R质 粒在24.5一Md接合质粒的介导下.可在淋球 菌之间,以及其它菌属问发生R质粒的接合 转移.由此推测,4.5一Md的R质粒可能是重 庆地区淋球菌青霉素耐药株的主要流行质 粒.同时,本文结果也表明,在淋球菌青霉 素耐药性的研究过程中,质粒图潜分析法是 一 种更为可靠,简便且快速的方法.因此应 用该方法进一步开展淋球菌青霉素耐药株的 分子流行病学研究,无疑将有助于追踪传染 源及接触者,了解耐药株的流行特征,为指 导临床治疗,淋病的监测提供线索和依据. ? 参考文献 [1]RobertsM,etal:JBaoterioll977;l31: 557,563 [2]李德如等:重庆医药1988;6:44~46 (3]MeyerjA,eta1;jBacteriol1976:127{ 1529,1537 [4]RoyR.etat:Plasmid1988}19:39,4l [5]BruntonJ.etal;RevInfectDi>l986. 8:7l3—7l6 [6]DickgiesserN,eta1:JBacteriol1982) l5l:l17l,1l75 [7]DillonJR,etaL:AntimicrobAgentsCh? emother1981t19;925,927 [8]BruntonJ,ota1:JBacterio1198l}148: 788,795 【9]blcNicolPJ,etal-JBacteriol1983~150, 437,440 l991年5月24日收稿) PLAS’VI},)P)_;】L1三S,):PENICILLIN—RESlSTANCE八,厂S.SE, GoNoRRHoEAE,SOLATED,NCHONGQINS.CHINA (Depart.ofEpidemiology,ThirdMilitaryMedicalCollege, ‘Chongqing,630038) YuXiao—feng,LengTai-jun,ZhouFu-dao,LiXing-Long LiuBen—yin,HuanBing-yu,ZhouLingandDaiXiang-an ABSTRACT28isolatesofpenicillin—resistanceNeisseriagonorrhoeaefromChon- gqingcitywereinvestigatedbymethodofplasmidprofileanalysis?Resultsof our datashowedthatfourofsevenpenicillin—resistanceisolatesharboreda4.5m e~adal- tons(Md’penicillin—resistanceplasmid.andthreeofthesefourisolatescontaining penicillin—resistanceplasmidalsoharboreda24.5-MdconjugativeplasmidPnda2.6- Mdcrypticplasmid.Therefore.wfirstlyisolatedthe4.5-Mdpenieillln—resis tance plasmidinChongqing.Wesuggestthatthistypeoepenicillin—resistancepta smid mostprobablyallepidemicRplasmidofN.gonorrhoeaeinChongqingcity? KEYWORD$?Piaaeriagonorrhoeae,Antibio’ticresistance)Flasinid ?70?