【word】 人芽囊原虫生物学特性——形态特征、繁殖方式及与细菌的关系研究
人芽囊原虫生物学特性——形态特征、繁殖
方式及与细菌的关系研究
第35卷第6期
2006年11月
卫生研究
JOURNALOFHYGIENERESEARCH
Vo1.35No.6
Nov.20o6739
文章编号:1000—8020(2006)06—0739—04
人芽囊原虫生物学特性
形态特征,繁殖方式及与细菌的关系研究
乔继英张旭魏志超杨蹭华李亚青张荣
西安交通大学医学院环境与基因相关疾病教育部重点实验室,西安710061
?
论着?
摘要:目的观察人芽囊原虫(Blastocystishominis,B.h)的生殖方式,对B.h与细菌的关系及相互间微
环境的影响进行初步探索.方法分别对新鲜粪便标本和RPMI1640培养基中B,h,经碘液染色和苏木素
染色观察其形态,对B.h阳性的粘液便,粘液血便进行肠道常见致病
茵的培养和鉴定,并通过B.h与大肠
埃希菌共培养实验,观察两者相互作用.结果本研究确证了四种B.h
繁殖方式:二分裂生殖,内二芽生
殖,复分裂增殖及出芽生殖.半数B.h阳性标本未检出已知肠道致病
菌.B.h对大肠埃希茵有一定抑制作
用.结论B.h存在多种繁殖方式;B.h可能单独致病,其致病机制与微
生态改变有关.
关键词:人芽囊原虫形态繁殖方式细菌
中图分类号:R531文献标识码:A
StudyonthebiologicalcharacteristicofBlastocystishominis:
morphology,modeofreproductionandtherelationtobacteria
Qiaoji—ying,ZhangXu,WeiZhi—chao,YangJun—hua,eta1.
KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases,MinisteryofEducation,Xi’anJiaotongUniversity,
Xi’an710061,China
Abstract:ObjectiveToobservethereproductivemodesofBlastocystishominisandstudytherelationbetweenthis
protozoaandbacteria.MethodsUsingtheIodineandHaematoxylinstaining,themorphologyofB.hfrompatientsand
RPMI1640mediumwereobserved.TheB.hpositivemucousdiarrhealspecimenswereculturedandidentifiedany
possibleknownpathogenicintestinalbacteria,B.handcolibacilluswereCO—culturedtoobservetheinteractionbetween
them.ResultsFourmodesofreproductionforB.hwereconfirmed:binaryfission,endodyogeny,multiplefissionand
budding.ThefactthattherewasnootherintestinalpathogensinhalfoftheB.hpositivespecimenssuggestedB.hmay
causediseaseindependently,B.handcolibacilluswererestrainedeachother,ConclusionB.hreproductsinatleast
fourmodes.B.hcouldbeapathogenanditspathogenesismayberelatedtomicro-ecologicalchanges.
Keywords:Blastocystishominis,morphology,reproductivemodes,bacteria
人芽囊原虫(Blastocystishominis,B,h)是人类肠道中一种
常见的寄生原虫.最初被认为是肠道共生酵母菌等.1967年
Zierdt对其进行系统描述后,引起了寄生虫学家和临床医师
的关注.体外培养是研究其生物学特性的基础,国外B.h的
体外培养经历了经典的LES双相培养基培养,单相培养基培
养等,但培养过程多无详细描述.自对80例腹泻病人粪便
标本中发现的B.h形态进行描述后:(1)在对不同类型的
腹泻便进行观察的基础上,通过对比B.h在RPMI1640培养
基,199培养基,DMEM培养基和LES培养基中最适生长条
件.,以期建立其最佳培养体系,从而为该虫的免疫,生物
基金项目:卫生部科学研究基金资助项目(No.98.1.231)
作者简介:乔继英,女,教授
1西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系
2西安交通大学医学院医学检验中心
化学和分子生物学等研究打下基础.(2)在观察体内B.h形
态的同时,观察了体外培养中其形态特征,繁殖方式等,为研
究B.h生活史提供了依据.(3)对B.h与细菌的关系及相
互间微环境的影响进行初步探索.
1材料和方法
1.1粪便标本选择及虫株来源
59份新鲜B.h阳性粪便标本均采自西安交通大学第一
医院检验科体液标本室.选择粪便性状为粘液便或血粘液
便,淡黄色或红色,透明胶冻状,可见血丝或明显血液,粪渣少
或无.显微镜检查可见大量脓球,白细胞和红细胞.细菌少
见,可伴有霉菌.人芽囊原虫每高倍视野为2—3个,将阳性
新鲜粘液便或血粘液便,用无菌棉签蘸取少许置无菌试管中
密封,即送细菌室进行常规细菌培养.剩余粪便倒人塑料离
心管中密封后带回实验室.标本运送过程中注意保温.在载
740卫生研究第35卷
玻片上滴打口1滴粪便和I旖卢戈氏碘漓.恃染色后于血细胞
计数扳E时B.h进行计数根据实验要求汁算粪便标本用
量进行接种同时涂片固定以备其它染色
大肠埃希菌由西安交通太学医学院触生物学教研室提
供
1.2所用试剂厦药品
青霉素钠(往射用粉针剂8c)万单位批号:@203I521,哈
药集团制药总厂):碗酸链霉豢(注射俐粉针剂lO0万单位批
号:021205华北制药股份有限公司j;灭活小牛血清(200m1.批
号:030620杭州四季青生物1程材料有限公司);RPMIl640
medium(10.4g.618483,GIBCOBRI公日】){MaconkeyAgar(CM908
批号:020427中国进出口商品硷验技术研究所北京罗桥技术
有限责任公司)
1.3人芽囊原虫的体外培养
1.3.1培养摹的制备RPMIl640培养基的制备:将l袋
EPM[]640(10.4g)倒人洁净烧杯巾.用量畸鞋取100Oral双蒸
水,冲洗包装袋内面3次.于磁力搅拌器上溶解均匀.用盐酸
和氢氧化钠调整酸碱宦,经啪滤菌器除菌后于超挣工作台
内分装至具硅胶塞的容量为l6ramx100ram经高压灭菌的玻
璃试管中.每管5m1.于4?保存备用
1.3.2血清的准备及抗生素的使用将小牛清置于55,
56水浴中加热30分钟灭活后丹装为每管It3m1.冷冻备
用.青霉索钠:浓度为600mg/-的青霉素钠100IrJ即100万
IU]ml用0Im1..硫酸链霉索:浓睦为2COmg/m[的硫酸链霉素
]00/tl即】o0万IU/6.3ml用0Im【.丹装小瓶一加?保存:
L_3.3接种B.h期睦粪便标|奉嗣匀计数后.将占氧的培养
基,血清占乏抗生素等用品均置于越带1怍台中觜外线照射30
分钟后进行接种
I.4人芽囊原虫繁殖方式的观察
.
h阳性粪使标奉和培养物琦可直搂经啦液染色或燎
片固定后嗣铁苏术索染色法进行染色比较B的形态结
构.观察其繁殖方式井进行数码显微摄片
I.5人芽囊原虫与细菌的关系
1.5.1人芽囊碌虫阳性粪便标奉的细蔺培荐和鉴定性
新鲜牯祧慢或血粘液便送细菌室进托常规细菌培养忭作菌种
鉴定谯经紫外线梢毒30分钟的趟净作台中,用接种爿:取
少量柯;本分刺接种于5s培养基和Mac川kev培养基中,于
37:在CO恒温培养箱中培非24小时,取{lj察看习ll蔺生K情
况.挑取光滑nJ疑菌落涂片后进衍革兰染色光镜下观察.并
根据革兰染色情况进行生化试验以鉴定
碘赣荣色H)x)
1.5.2MankcAE日培养基的制备称取55g溶于100Oral燕
慵水中.加热煮沸溶解.115qL~20分钟高压菌备用
1.5.3接种
1.5.3.1人芽囊原虫接种于RPM1I640培养基人芽囊原虫
阳性粪便标本调匀计数后.将去氧的培养摹m清及抗生索等
用品均置于越挣J:作台中紫补线照射30丹钟后进行接种.加
人抗生索和血清.每24小时去睬缸内氧后置37%温箱培养
1.5.3.2大肠埃希菌接种于RPMI1640培养基将大脑埃希
菌菌种传代至肉瀚培养基中.10倍稀释看按照I:【D比例接种
至M…arkra培养基平板中.24小时汁数平板上菌落数,
“确定大肠埃希菌浓度将太肠埃希菌丹别接种于B,C两
瞥RPMI1640培荐基中
丹别于第36,9天用血细胞计数板i十数人芽囊原虫虫体
密度,同时10情稀释后用平扳活菌计数法数太厮埃希菌,
每管接种至3十平扳.取其平均值观察凡芽囊原虫的形态
和太晒埃希菌生长状况
2结果
2.1粪便标本的选择对培养的影响
在2003年7月一2004年7月问所收集柏59份帖液厦牯
液血便标丰巾.发现5—9H为高峰期.分别为10,8,】1,7和8
例.其余月册I一3例.但不同季节所取的标本培养投果无明
显差肄标水性质多淡黄色运明腔诛妆,叮见JI】L壁或明显
血液且粪渣少.镜榆”脓球,自细胞手?虹细胞为主.蜘苗少或 t捌2A)颗粒型虫体较空泡型
少见其与空泡型不同之处为染色鞍深常单独存在而不成
串聚集中央充满细颗粒样物质其问散在分布着较大的深
染颗粒(圈2B)
2.4人芽囊原虫的繁殖方式
目前为止,在腹筒病人及培养基中发现的Bh繁殖仃式
有:二分裂生殖可见哑铃形正在分裂的虫体.在母细胞中闹出
现凹蹈.细胞两端嘭出,两于细胞已具雏形,由细胞质相连.已
完成或正在完成梭物质的重新分配=内二芽生魑(隔膜生
殖)可见一个大的中央空泡.其内先分裂为2个(两空地间可
见一层膜),横跨两空泡的幢质区尚未丹开在这2个李泡旁
还有2个很小的空泡出芽生殖可见母细胞
面长出一个
指状(枝权杖)芽体,细胞膜连续完整,细咆质相连.母细胞与
芽体大小差异显着.其内均见拔物质:.新鲜粪便标本中观
察发现其中存在大量出芽生殖现象.可见在太的颗粒型虫体
一
侧轻微凸起,HT同时有2—3十凸起.凸起部分透亮,无内
容凸起运渐明显.直至形成一个李泡连在颗粒型虫体上最
后空泡从颗粒型虫率上脱离.形成单独存在的空泡【图3A
c)复分裂繁殖在RPMI1640培养基中.发现r太脑耶尔森菌各】份
2.5.2几芽囊原虫与太呖埃希菌芪培养的生长情况B.h
和大脑埃希菌在生妊过程中均比对照组减少Bh和大肠
埃希菌共培养时虫体数量比单独培养时减少而大呖埃希菌
在共培养中的计散电鞍单拙培养?减少
3讨论
3.1人芽羹原虫标本来源的选择
在我们K期计/3.h培养过程中发现./3h培养效果取决
于粪便性状,具以下特点:?标车多为粘液便或血牯液便.通
常为淡黄色或红色.透明胶冻状,隐mL阳性或有血丝甚至可见
【『『L渣而以谈黄色粘液中走杂有血塑者培养效时无明显变化
3.2人芽囊原虫在RPMI1640中培养
窗=I性标本在接种初期呈疏辁网状或大的凝块状卿粒.为
红乜或黄色,可悬浮于培养基表面或沉于管底培养过程中
则逐渐变化.通常培养72小时靖,培养物全部沉于管底,且呈
淡黄色或灰白色致密细颗粒状.取管底培养橱与上清丹别计
数/3.h.发现培葬物中与上清中矧比具有融着优势本实验
.接种量2×105细胞,管,pH75,温度37%,20%小牛血
清和青霉素(10万IU),链霉素(I.6万)为h在RPMII640
培养基生长的最适条件
通过本实验证明,RPM1t640培养基制备方便,而且8
h在其内生长稳定,繁殖率高等.是Bh悻外培养长期保种
柏首选培养基;在奉次实验中采用ItPM[1640培养基在上述
实验条件下,保种可逃336天.为进一步研究冻存和复苏提
供r基础
3.3新鲜粪便殛培养基中人芽囊原虫形态比较
关于B.h的形态研究.我们曾舟{;『I报道过肠道原虫合并
感染的铁苏水寨染色下的形志站掏;Bh疆泻株经
LES培养基培养后的形志现察本扶研究观察到的新鲜粪
便标本噜巾大小范围魁2,m.1l瞻培养中为620.cII
3.4人芽囊原虫的繁殖方式
在我们对人体肠煎厦培养基}JBh的彤志研究巾发现.
{}l殖方式内生}?外生性的,矬繁殖为特点.内生挫包括
二丹裂,内_二芽生殖受复分裂增殖:外削生为出芽生埴有关
禁疃方式Zien[I曾于1973在人类肠道l垃培养基巾观察到的二
分裂;1974年的无菌培养中见到的裂体增殖;此外.1988年叉
报道内芽生殖.怛强调无出芽生殖…’.我f『J在研究中发现未
曾报道过的急性枯液血便中的出芽生殖瑶象,夸虑系Bh在
』,体山寄生时的繁殖方式;出芽生殖在培养巾朱发现.可能是
凼为培养过程中由于外界因素的变化而转变了繁殖方式
当接种标本巾颗粒型为主时c>50%】,培养效果最好,这
提示颗粒型细胞可能处于繁殖阶段,在培养垃程中颗粒型滴
化为空泡型(图4)在培养中发现了太量葡萄串样大小一致
742卫生研究第35卷
的j控堆聚集宅泡型,这说明颗粒型转变为空泡型后.空泡型叉可大量繁殖为子代空泡型
A出芽生殖
碘{燕染也.6?x)
B出芽生殖
磷液染色6呻x)charm~teristics0fBrf
m.
JClinlLh?.1967.48:495-5t】l
c出芽生殖
碘灌染色600x
围4曩粒型转变为空泡型
【碘液染色600×)
Fi.4Grln~m”form
transformtnginto
Imlarr0l1II
2菲继英.薛弘燮.吐尔进_笠凡芽囊琢虫形态学的观察中国寄生
虫学与寄生虫痫杂志,1998,16(2):l’4一l?
3菩嶙,乔继英.王伟,等凡芽囊原虫在RPMiI640培养基中培养
条件的优化rdlcHm?tshomanZ~&hmg-misundemt,mdint~tihalpartite
IITody,I988,4{“:I5一I7
(2805.I2-30收稿)
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