半定量RT-PCR法检测SPRN基因在小鼠各组织中的mRNA表达

半定量RT-PCR法检测SPRN基因在小鼠各组织中的mRNA表达 半定量RT-PCR法检测SPRN基因在小鼠各 组织中的mRNA表达 安徽农业科学.JournalofAnhuiAgri.Sci.2010,38(11):5558—5559.5579责任编辑王强责任校对 况玲玲 半定量RT-PCR法检测SPRN基因在小鼠各组织中的mRNA表达 王海鹰,王惟,万家余,廖翔宇,徐静,廖鹏一,高宏伟(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 l3o062;2.军事 医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130062;3.吉林大学白求恩医学院免疫学教研室,吉林 长春130021) 摘要[目的]研究sPR?基因在不同组织中的表达水平和机制.[方法]选择3种不同品系的小 鼠为试验,利用半定量RT.PCR方 法,测定不同品系小鼠各组织中SPRN基因的mRNA表达水平,并对其循环次数进行研 究.[结果]SP基因主要在脑组织中表达,在 肺脏和胃中表达量较低,而在淋巴结和脾脏中仅有微量的表达;半定量RT—PCR体系的最 佳扩增循环数为23.[结论]成功地建立了检 测SPRN基因mRNA表达的半定量RT—PCR方法,该方法具有简便,快速,准确和精密度高 等优点. 关键词S艘?基因;半定量RT.PCR;mRNA 中图分类号s865.1文献标识码A文章编号0517—66ll(2010)11—05558—02 l~teetionofmRNAExpressionofsprnGeneinVariousTissuesofMicebySemi.quantitativeRT.PCRMethod WANGHai-yiIlgetal(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin130062) AbstractlObjectiveIT0studytheexpression1evelsandmechanismsofsPgeneindifferenttissues.『Method]Asmanyasthreedifferent mices~ainswereusedasexperimentalmaterials.TheexpressionevelsofmRNAtorsPRNgene1nvarioustissuesofdifferentmicestrainswere examinedbysemi—quantitativereverse—transcriptasepolymerasechainreaction(semi—quantitati veRT—PCR).andtheamplificationcycleswerea1. sostudied.IResultJgenewssexpressedmainlyiubraintissue,lowerinlungsandstomach,andasmallamountofexpressionseemstobe presentinlymphnodesandspleen.Thebestresultswereobtainedwith23cyclesofamplification.IConclusion1Asemi.quantitativer.PCR methodtodetectthemRNAexpressionofsPRNgenehasbeensuccessfullyestablished.tssimple.rapid.accurateandhighprecision. Keywordsgene:Semi.quantitativeRT.PCR:mRNA 传染性海绵状脑病(TSE,TransmissiblespongiformeFl— cephalopathies)是由朊蛋白(prp)引起的人和动物的一组中 枢神经系统变性疾病J.目前,已经报道了许多种TSE,如 羊痒病,牛海绵状脑病(BSE),传染性水貂脑病(TME),鹿慢 性消耗性疾病(CWD),人克一雅氏病(CJD)和库鲁病(kuru) 等.随着生物信息学的发展,通过比较基因组学方法,在基 因数据库中发现1种与朊蛋白结构相似的新蛋白Shadoo蛋 白,其基因sprn(shadowofprionprotein)的序列从鱼到哺乳动 物都很保守].Shadoo是一个有GPI锚定结构的神经元 糖蛋白,出现在早期新生胎儿中,与prpc的N端存在同源的 序列.研究显示,Shadoo蛋白在脑组织中有表达;其表 达与prpc具有重叠部位,但是在有prpc小脑(CGNs)的颗粒 神经元中含量较低,在无prpc小脑的颗粒神经元中含量较 高;在没有prnp的CGNs中,Shadoo具有与prpc同样的作用, 有中和Doppel蛋白或部分PrP多肽神经毒性的作用;在 prion感染的鼠中,内源性的Shadoo有显着的减少.因此, Shadoo可以作为阐述prion生物学f.口]题的工具. 半定量逆转录聚合酶链式反应(semi-quantitativereverse transcriptionandpoly.merasechainreaction,SqRT—PCR)是近 年来常用的一种简捷,快速,特异的RNA定量测定方法, 通过mRNA反转录成eDNA,以适当的管家基因作为内参照 进行PCR扩增,通过测定,计算目的基因,管家基因的电泳 条带光密度及比值,即可间接反映目的基因在不同的物种, 个体,器官,组织或细胞中的转录水平.在大多数试验中,分 析RNA时,定性的研究不足以提供满意的结果.笔者采用 小鼠为供试材料,一actin基因为内参基因,sprn基因为检测 目的基因,应用RT-PCR技术,对小鼠不同组织sprn基因的 表达进行半定量分析,以期建立1个特异,稳定的RT-PCR 作者简介王海鹰(1982一),女,内蒙古牙克石人,博士研究生,研究方 向:生物化学与分子生物学.通讯作者. 收稿日期2010-01-08 半定量检测体系,从而进一步确定其表达调节机制]. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试验动物.试验所用小鼠为野生型的Bablc,C57b16 和1293种品系,每种品系雌雄各l0只 1.1.2试剂和仪器.试剂:Trizol溶液(Invitrogen公司), TaqHotStart聚合酶(大连宝生物工程公司);DDNA- Maker(大连宝生物工程公司),反转录试剂盒(大连宝生物 工程公司);DEPC等.仪器:离心机;超净工作台;核酸分析 仪;PCR仪;凝胶成像仪;电泳仪. 1.2方法 1.2.1RNA的提取及反转录.?取0.1g小鼠的大脑,小 脑,中脑,延髓,胃,肺脏,脾脏和淋巴结组织放入研钵内,在 液氮中将其充分研磨成粉状,倒入1.5mlEP管中,再加人 1mlTrizol溶液,充分振荡混匀.室温孵育10min后,4?条 件下,12000r/min离心10min,弃去沉淀.?按1mlTrizol 加入200l氯仿的比例,加入RNA专用氯仿,剧烈振荡15 s,冰浴静置20min,然后4?条件下12000r/min离心2O min.?取上清层到1个新EP管中,加入450RNA专用 异丙醇,颠倒混匀,一20?孵育40min,4?条件下12000 r/min离心20min.?弃去上清,向管中加入lrnl冰浴的 75%乙醇洗涤沉淀,尽可能使沉淀悬浮,4?条件下7500 r/rain离心10min,弃去上清.?RNA适度干燥后,用20 无RNA酶水溶解.?用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量, 核酸分析仪测量其浓度,以便在反转录的过程中进行定量, 提取的RNA保存在一80?冰箱中.?用反转录试剂盒将总 RNA反转录为eDNA,cDNA可直接用于PCR扩增. 1.2.2RT—PCR扩增反应 1.2.2.1引物序列.应用PrimerPremier5.0软件,设计的引 物要跨越1个内含子,以防基因组的污染而产生假阳性设计 B.actin和sprn基因扩增引物.所有引物均由上海生工生物 38卷11期王海鹰等半定量RT.PCR法检测SPRN基因在小鼠各组织中的mRNA表达5559 工程技术服务有限公司合成,使用前将引物稀释至1O mmoL/L.引物序列及片段长度如表1所示. 表1引物序列 Table1Primersequences 墓西—亏I物N~tl(5’to3’)片段大dx//bp 1.2.2.2循环数确定.选择适当的循环数,使扩增产物处 在平台期前的线性增长范围内,并在琼脂糖凝胶上清晰可见 和定量,所检测的目的RNA和内标18SrRNA最佳循环次数 须在同一范围.基因一actin和sprn的PCR反应体系为:2l cDNA产物,0.25lTaqHotstart酶,sprn或卢一actin基因上下 游引物各1l,dNTP2.51,2.5Ixl10×buffer,终体积20 .反应程序如下:94?预变性5rain,94?变性30S,退火 30S,72?延伸30s(20,21,22,23,24,25,26,27,28个循环), 72?延伸10min,4oC保存. 1.2.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测分析.取PCR扩增 产物20l,与516XLoadingBuffer混匀,吸取5l于 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测,点上DL2000Marker,以 确定扩增产物片段的大小.100V电压电泳15min,然后用 凝胶成像系统拍照,并用quantity—one软件分析,结果用sprn 和/3-actin基因电泳带IOD的比值表示. 1.2.4数据分析.采用SPSS13.0统计软件的Independent SamplesTest方法进行显着性检验. 2结果与分析 2.1小鼠各组织总RNA的提取经0.8%琼脂糖凝胶电泳 检测各小鼠组织总RNA的28SrRNA和18SrRNA条带清晰 明亮,无拖带现象,且28SrRNA的亮度是18SrRNA的2倍, 表明提取的RNA样品较为完整.用核酸分析仪测定其浓 度.OD260/OD280比值均在1.8,2.0,说明样品的纯度较高 (图1). ..1-一18S ?I-一28S ..I.一5S 图1小鼠各组织总RNA图谱 Fig.1TotalRNAmapofeachorganizationsofmice 2.2PCR循环数的确定分别用对目的基因进行扩增,并 分析其扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果,然后以条带亮 度作为选择循环数的根据.由图2可见,sprn基因中9个循 环所得条带亮度已基本一致,表明扩增进入平台期.sprn和 actin基因在23个循环时,已扩增到不同样本的cDNA,可 见此时处于线性增长期.JB—actin在24个循环时进入平台 期.2个扩增循环数需保持一致,因此确定23个循环为扩增 循环数. 2.3PCR产物的灰度值利用quantity_one软件分析,得一 B—act如 图2不同循环数对sprn基因和一act/n基因平台期影响的电泳 分析 Fig.2Electrophoresisresultoftheeffectofdifferentcycleson sprngeneandfl-avtinplatformstage actin和sprn基因PCR产物的灰度值,用sprn的灰237Pu分 别除以3-actin的灰度值,得出相对灰度值(图3).利用 SPSS15.0的SampleTTest分析,差异不显着,表明sprn在不 同品系的相同组织中的表达无差异. 卜Sprn644bp 41---日--actin294bp 图3sp兀l在大脑,小脑,中脑,延髓,肺,胃,脾脏,淋巴结mRNA 表达.从左至右 Fig.3mRNAexpressionofRT—PCRdetectionsprntoeachor? ganizationsofmiceNote:1—8representtheproductsof brain,cerebellum,midbrain,medulla,lung.stomach, spleen.lymphnodes. 表2PCR产物的灰度值 Table2GrayvalueofPCRproducts 3结论与讨论 研究表明,sprn在3个品系各组织中表达,差异不显着. sprn主要在脑组织中表达,在肺脏和胃中也有表达,但表达 量较低.在淋巴结,脾脏有微量的表达.因此研究sprn基因 在各组织的转录,对于研究其基因的转录,修饰,剪切都有重 要意义. 运用半定量RT.PCR方法检测特异基因表达量的差异 时,总RNA的质量是关键.只有总RNA未被降解,才能保 证其中mRNA的完整性和cDNA的质量,从而真实反映起始 中基因表达量的差异.在选择PCR引物时,尽量使上 游和下游引物跨越内含子,这样能把从cDNA得到的扩增 产物和从基因组DNA污染得到的产物区分开.半定量RT— PCR技术是利用产物与模板的线性关系,通过扩增产物来对 比目的基因中mRNA的表达.表达丰度不同的基因,半定量 分析的PCR循环数也不同.选择合适的循环数,能够使扩 (下转第5579页) 38卷11期王建风等不同浓度的吲哚丁酸和萘乙酸对中国沙棘雌株嫩枝扦插的影响5579 和50mg/LIBA处理与对照差异显着(P<0.05),50mg/LNAA处理与其他浓度NAA和对照间均有显着差异(P<0.05). 表1不同浓度IBA对中国沙棘雌株扦插的影响 Table1EffectsofdifferentconcentrationsIBAonfemaleplantcuttingsofChinesesea-buckthorn 注:多重比较采用LSD法.小写字母表示在0.05水平差异显着,大写字母表示在0.O1水平差异显着.下同. Note:ThemultiplecomparisonsusetheLSDlaw,thelowercaselettersrepresentdifferencesignifficanta t0.05level,thecapitallettersrepresentdifference signifficantat0.01leve1.Thesameasfollows. 表2不同浓度NAA对中国沙棘雌株扦插的影响 Table2EffectsofdifferentconcentrationsNAAonfemaleplantcuttingsofCMn~esea—buckthorn 2.4不同浓度IBA和NAA处理对沙棘平均根长的影 响由表1,2可知,50mg/LIBA处理成活枝条的平均根长 达到13.26am,比对照增加183.94%;而不同浓度NAA处理 中,以50mg/LNAA处理成活枝条的平均根长最长,达11.74 cm,比对照增加151.39%.方差分析结果表明,不同浓度 IBA处理间差异显着(P<0.05),25mg/LNAA处理与其他 NAA处理间差异显着(P<0.05). 3结论与讨论 研究表明,适宜浓度的植物生长调节剂处理可大大增加 中国沙棘雌株扦插成活枝条的生根量,提高其成活率,促进 枝条旺盛生长.总体看来,IBA处理效果优于NAA,其中,50 mg/LIBA处理的效果最好. 参考文献 [1]李耀阶.青海木本植物[M].西宁:青海人民出版社,1987:316—345. [2]罗敬东,唐雪辉,刘兴乐,等.吲哚乙酸和萘乙酸对黄花槐嫩枝扦插的 (上接第5559页) 增反应在到达平台期前的线性范围内进行.因此,为避免平 台效应的影响,合适的循环数是PCR半定量方法的关键因 素之一.半定量分析mRNA水平的方法在各个研究领域都 有着非常广泛的应用,随着该技术的日趋成熟和完善,将成 为研究者的强有力的研究手段. 参考文献 [1]WESTAWAY,HOODLE,PRUSINERSB.Doppel,aNewPrP—like MammalianProtein[M].NY:PrionBiologyandDiseasesSecondEdition, ColdSpringHarborLaboratoryPress,2004:283—304. 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