Kennedy病和Charcot-Marie-Tooth病大家系的临床和分子遗传学研究（可编辑）

Kennedy病和Charcot-Marie-Tooth病大家系的临床和分子遗传学研究（可编辑） : 病和??病大家系 的临床和分子遗传学研究 ..?. 士 名 张社卿 博 后 姓 生物学 流动站一级学科名称 遗传学 专业二级学科名称 年月日 研究工作起始时间 年月目 研究工作期满时间 复旦大学研究生院上海 年月第一章一个病家系的临床和分子遗传学研究 .摘要 病也称为连锁的隐性遗传性脊髓延髓型肌萎缩,于 年由首先对它进行了系统的临床和病理研究。其临床特征是 男性成年期发病,以进行性四肢近端肌肉无力、萎缩和真性延髓麻痹 为突出现:可伴有男性乳房女性化、睾丸发育不良、甚至不育等。 随着疾病的继续发展可出现四肢远端肌肉的无力和萎缩。在本病能被 ,但很多病 充分认识和诊断的国家和地区,其发病率估计在/ 例并未能正确诊断导致其实际报道数的不足。根据等对意大 省的调查,在年间,其年发病率是. 利 /,男性。自年 等发现雄激素受体 基因第一个外显子重复扩增是本病的致病原因后,近十几 年国外对本病的研究取得了很大进展。然而,迄今国内对本病的报道 仅有例,但没能经基因诊断证实。本文报道我院最近发现的经基因 诊断证实的一个病大家系。 该家系中先证者为一男性,岁,已婚,汉族。因“进行性双下肢 无力年余”入神经内科。自年开始感觉双下肢无力,行走时明 显,自觉不能将双脚后跟垫起,蹲下后站立困难。患者曾被诊断为多 发性肌炎、肌营养不良、遗传性运动感觉神经病 病等多种疾病。 根据患者叙述,其舅父,以及舅父的舅父曾忠有类似疾病。为此对该家系展开 系统调查,共检查代位个体。所有个体均经同一个 神经科医师进行神经系统检查。经家族中全体成员知情同意后,采集 外周血常规提取基因组。 因本家系符合连锁隐性遗传,肌电图检查又符合感觉运动神经 受累,所以首先经扩增连接素基因 ,个外 显子及其内含子序列,结果正常;接着对该基因上游的启动子 序列进行测序, 结果充分排除了基因突变所致的 ?.病。然后,按照 等的引物序列, ,基因第一个外显子的重 扩增了雄激素受体 复片断,结果先证者重复数分别为,其它例患病个体 重复数为,此外,还发现例症状前个体,其重复数也是。 本研究结果说明: 病在国内多被误诊为多发性肌炎、肌 营养不良、遗传性运动感觉神经病等,因此导致该病在国内的报道严 重不足,其原因估计与多数临床医师对本病的认识不足有关;基因诊 断是诊断本病的最准确方法,且能发现症状前个体;本病的进展速 度与重复数的大小呈正相关;本病病程较长,比一般的肌萎缩 侧索硬化或延髓麻痹的病程要长得多。 基因诊断雄激素受体基因 家系 关键词:连锁脊髓延髓型肌萎缩 中图分类号: 摘要英文? ,,,, ,.. , , , . ,.. /, , /, . ,, . .一? 一. . . ,, ,.. , ,. .,‘ , .,. ,. ’ ,. . . . . ? .. , , ,,. . , ,? . .. . :? . , , :.病家系报道 病也称为连锁的隐性遗传性脊髓延髓型肌萎缩,于年 由首先对它进行了系统的临床和病理研究。其临床特征是男性成 年期发病,以进行性四肢近端肌肉无力、萎缩和真性延髓麻痹为突出表现; 可伴有男性乳房女性化、睾丸发育不良、甚至不育等?。随着疾病的继续 发展可出现四肢远端肌肉的无力和萎缩’】。在本病能被充分认识和诊断 ,但很多病例并未能正确诊断导 的国家和地区,其发病率估计在/ 省的 致其实际报道数的不足【’】。根据等对意大利 调查,在.年间,其年发病率是./,男性。自年 ,基因第一个外显子 等发现雄激素受体 重复扩增是本病的致病原因后,近十几年国外对本病的研究取得了很大 进展。然而,迄今国内对本病的报道仅有例?,但没能经基因诊断证实。 本文报道我院最近发现的经基因诊断证实的一个病大家系,并对 其临床和分子遗传学特征进行讨论。 例先证者家系中?.个体,男性,岁。岁时发现用力握紧 双拳后不能立刻放松,如果用力向左转头即不能马上转向右侧,反之亦然, 这种症状在寒冷天气尤为明显。反复多次活动后该症状减轻,轻微活动不 会诱发此类症状。这种症状持续十余年,岁以后发现面部和上肢出现肉 跳,继之遍及全身各处。岁左右发现上楼梯时感觉易疲劳,特别在负重 物时更为明显,无力症状逐渐加重,一年后发现双大腿变细,双脚跟不能 垫起,双脚尖不能钩起图。有时双腿被刺破而未能及时感觉到。年 后双臂逐渐累及,抬肩无力,双手握力下降,双手精细动作笨拙。曾查血 清增高,按多发性肌炎用地塞米松、环磷酰胺等治疗无效后转入神经 内科。患者岁结婚,婚后育一健康男孩,现已岁。体格检查:心肺 肝脾正常,乳房无明显女性化。神经系统检查:精神智能正常,面部和舌 肌无萎缩,吞咽和构音正常。双下肢浅感觉减退,深感觉正常;双上肢深、 浅感觉均矿常。四肢远近端肌力级,肌张力正常,膝反射和跟腱反射减 弱,双侧征均性。实验室检查:糖、血沉『常,.清 卫常参考值.,脑脊液常规、生化、细胞学、免疫球蛋白等均『常。神经科首 先考虑为肌营养不良肢带型。随后神经电生理检查提示感觉、 运动神经轴索受损,神经传导速度『常图,因此,又诊断为遗传性运 动感觉神经病型。 根据患者叙述,其舅父,以及舅父的舅父曾患有类似疾病。为此,对 该家系展开系统调查,发现例临床确诊病人和例早期病人: 例男性,岁家系中一个体,首发症状同例。岁左右发 现劳动后易疲劳,逐渐上楼梯困难,症状逐年加重。岁以后逐渐出现阳 萎和乳房女性化图。岁结婚,婚后育有健康男孩。神经检查:精 神和智能正常,面部无萎缩,吞咽、构音正常,但舌肌有轻度萎缩图, 双下肢浅感觉减退,深感觉正常;双上肢深、浅感觉均正常。双肩夹带和 骨盆带肌肉明显萎缩图:四肢远近端肌力级,蹲下后难以自行站起。 四肢肌肉张力偏低,膝反射和跟腱反射消失,双侧征阴性。 例男性,岁,家系中?.个体,岁后逐渐出现如同例的 肌强直症状,继之有全身肌肉跳动感。临床神经系统检查无明显异常发现。 例男性,岁,家系中.个体,岁左右发现乳房女性化, 岁以后发现轻微肌肉强直和肉跳,岁结婚后经睾丸活检被诊断为不育 症。岁以后逐渐发现阳萎。岁以后发现易疲劳,但无明显的肌肉萎缩 和无力。临床神经系统检查:无明显异常所见。 以上例病人经常规检查心电图、肝肾功能正常。肌电图和血清 如后。脚家系幽:其中.为症状前个体 图先证者右双下肢轻度萎缩 . 先证者肌『幽显百螟型的神经帛悱:员害:单纯相取人位 图家系中.个体的乳房女性化 斟家系中一个体的舌肌萎缩 幽家系中. 个体的肩胛带肌萎缩 .实验材料和方法 .主要试剂和试剂盒 酶申能博彩生物科技有限公司 溶液,申能博彩生物 科技有限公司、 去离子水 天为时代公司:, 溶液,溶液 .溶液 %的琼脂糖胶:琼脂糖,的缓冲液,的 上海华禹生物工程有限公司的 ,的 .主要的仪器设备 孔板 扩增仪公司 一台式离心机上海医用仪器厂 型高速冷冻离心机德国公司 型台式高速离心机宁波新芝科技股份有限公司 .高速离心机上海安亭科学仪器厂 型全自动测序仪公司 凝胶成像系统上海复日公司 ?型台式恒温振荡器江苏太仓科教器材厂 紫外检测仪上海复生公司 微量加样器,,各一支法国公司 ?恒压恒流电泳仪北京东方仪器厂 板式水平电泳槽?型北京六一仪器厂 电热恒温水浴槽上海精宏实验设备有限公司 一 .基因组提取 ,按下列方法抽提 经家族【全体成员知情同意后,采集外周【 利用公司提供的试剂盒进行的抽提,具体步骤如下: 从一度的冰箱里拿出血样解冻,打开度水浴锅进行准备 编个管.,并每个管里加的 混 每个管星加的血样,然后加入的 匀 将加好样的管置于度水浴锅中放置,然后拿出进行离心 ,. 每个管中加的无水乙醇混匀,然后进行离心, . 每个管取样液上柱,进行离心离心, 向每个柱子中加 】,离心,倒掉收 集管中的样液 再向每个柱子中加 ,离心,倒掉 收集管中的液体,再离心 编个新的管.,将离心柱放置于新编好的管中, 每个管中加去离子水,室温下放置,离心 ,将溶液收集到管 再取个新管对应编号,将离一心柱防进编好号的新管中, 每个管中加去离子水,室温放置,离心, 将溶液收集到管 将次收集到的溶液收集到个管中,然后通过 琼脂糖凝胶电泳检测抽提的情况 用紫外分光光度计进步精确/下的浓度 .基因组的质量检测 取溶解好的人基因组 进行.%琼脂糖凝胶电泳分析, 结果检测出均大于,无降解,无蛋白质等杂质,符合直接 用作扩增的要求,部分样%泳结果见下图: 图 在嘲中数字为剑的条带分州表吓个样本龋凼组均约为.则代表.条带从最 上一条下分别是 , / . ,., ,.,, . .排除基因为致病基因 因本家系中先证者被诊断为..病型,且其遗传方 式符合连锁隐性遗传,所以首先经扩增连接素基因 , 个外显子及其内含子序列,结果正常;接着对该基因上游 的启动子序列进行测序,结果充分排除了连锁的?.病 附测序图。 所用引物序列为: ..:’..’ ?:’一 ..:’一’ ..:’一一’ ..:’..’ ..:’.一’ ’ ...:’. ...:’. ’ . :’一一’ . :’?’ ?. :’’ . :’一’ ?.~:’一?’ ?. :’.一’.排除基因为致病基因 因患者家系中各患病个体均有不同程度的增高,临床上个别医师认 为本家系属于肌营养不良症,且一床方式符合连锁,所以有必要排出该 家系为.肌营养不良的可能。 ?肌营养不良基因基因共有个外显 子,扩增所用引物为 ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ ’’ . 连锁的致病基因定位 / ; 瞧瞧瞧滕瞧瞧;;吣瞧滕黑瞧徽; 勰龆船辫溜瓣勰勰勰褫嚣黜嬲 圈 染也体致璃基因与微:星标记的连锁定位示意 一,, .,, ,, ,, 一,, 一,, 一.,一,, 一..一 .,, .... ?,,一,, ,,.. ?,, 一., 一., .,, .,, .., 一,, 一,, 一., .,,一.,, .,, 一., .,, .,, 一,, .,, .,,? .., .,,一 .., 一,, 一., .,,一 ..,,?,, 一., , .,,一., ,一,, .. ,一,, 一,, ,一,, .. ,,, 一.. , ?,, ?.. ,,, 一,, ,一,, ,, ,一,, ,, , ,, ,, ,一,, 一,, ,,, ,, , .,, 一,, ,.,, 一,,, .,, ,.,, ,.,, ,,, , .,, .., ,.,, .., , .,, ... ,.,,一 .,, . 一.,.... ,.,, .., ,.,, .., ,.,, .., ,.,, .., ,.,, 一., ,.., .,,. 基因重复片断的检测 根据以上个的连锁分析,将致病基因定位于.。 基因在此区域内,因此,按照 等设计的引物序列,扩增 基因第一个外显子的重复片断,引物序列为: ’一一’ ’.’. 反应体系总体积为/,包括 基因组,每条引物各 .,/ ,./ .,/ , %二甲亚砜, , 聚合酶。反应条件为变性 随后轮为持续, , ,最后扩延时间为持续 。反应产物由 ,,直接 测序。.结果 该家系中基因的个外显子序列、’和’、内含子 序列以及启动子序列与序列对比不存在任何形式的突变测序图附后。 外显子编码序无任何形式突变测序图附后。 经用个微卫星位标进行连锁分析后将致病基因定位于 .,基因在此区域内,经基因检测,在本家系中发现位个 体的基因异常。其中先证者家系中?.个体基因号外显子 重复数为,另外例患者重复数均为,此外,还发现例症状 前个体.,其重复数为测序图附后。.讨论 经文献检索,本研究为中国大陆首次报道的经基因诊断证实的 病大家系。刘秀丽等报道个散发病例,临床表现相似,但未经基因检测 证实】。病的实际发病率很可能被过低估计】。迄今中国大陆有关 本病的报道甚少,其主要原因可能是:本疾病起病在中年期, 在早期阶段构音障碍、吞咽困难、舌肌萎缩等延髓麻痹的表现不明显:男 子乳房女性化、睾丸发育不良、不育、性功能障碍等虽可 在青年期出现,但很少为神经科医生所重视。因为本病为连锁遗传, 不存在父子之间的垂直遗传,患者母亲一般为携带者,若不经仔细追问, 往往遗漏遗传信息。一些散发的病例的确存在。由于临床表现的异 质性,本病常被误诊为遗传性运动感觉神经病型、肌萎缩侧索硬化等【 ,或者由于近端肌肉萎缩、无力,以及血清的升高等特征而被误诊 为肢带型肌营养不良。等报道例亚急性发病的进行性近端肌肉萎 缩、无力,血清显著升高,曾被首诊为多发性肌炎,后经基因检测为 基因的重复扩延“】;而等报道病可有重症肌无 力样表现。另一方面,由于表型模拟现象,一些临床表现类似 病的患者,其基因检测正常【”。本家系中的先证者就诊初期曾先后被 诊断为多发性肌炎、肢带型肌营养不良、遗传性运动感觉神经病型等。 我们曾认为该家系可能为一个特殊的连锁隐性遗传性运动感觉神经病, 并作过报道此前曾查基因正常?。后经连锁分析将致病基因定位 于.区域,再检测了基因才得以最终确立诊断。这说明临床诊 断具有很大的局限性。 自最初报道以来即被认为是运动神经元病的一种类型,这就意味着 感觉神经不受累及,至少在临床上不应有叫显的感觉障碍。而本家系中的 先:者早期即有明显的感觉受累,这也是未能及早做出正确诊断的原因之 一。事实上,等很早就注意到本病的感觉神经电生理检测的异常【“。 我们认为,不应归为运动神经元病,因为组织病理学研究发现除了脊髓 前角运动神经元丢失以外,后根的感觉神经元同样受累;此外,基因不 仅在生雅系统表达,在脊髓、脑和前列腺内都有广泛的表达【”“】。本病的 病程也不同于经典的运动神经元病:肌萎缩侧索硬化的平均病程 为.?.月,延髓型为.?.月,而为.?.年。从发病年龄 。 来看,的平均发病年龄为..岁,而则为.?.岁【 以上临床特征使得本病更符合遗传性运动感觉神经元病的表现。 在本家系中我们发现诸个体的首发症状均为无痛性肌肉强直 ,肌电图检查也证实了这一特征,这与最初报道的首发 症状为痛性肌肉痉挛 不同。这个症状可在肌无力 症状出现前十几年即发生,甚至一些携带者也可发生。这表明肌肉的离子 通道系统可能受累及。除了肌肉强直以外,临床或亚临床的感觉障碍以及 血清的增高可在无力症状发生之前年内出现。随着无力症状的恶 化,肌肉强直和肌肉跳动逐渐缓解。乳房女性化和舌肌萎缩随后发生,随 着女性化乳房逐渐明显,患者的性功能开始下降。所以临床表现有下述规 律:肌强直/肌肉跳动,随后肢体无力、乳房女性化,最后为舌肌萎缩和吞 咽、构音障碍。我们认为 等所报道的舌肌无萎缩的 病例并不确实,首先照片所示确有右半舌肌轻度萎缩,其次,该病例很可 能在疾病的早期阶段【”。等测定了同一家系中不同年龄的个体的 雄激素受体的亲和力发现随年龄的增长雄激素受体的亲和力逐步下降,这 种差异与的重复数无关【 。我们的家系中的患病个体在年轻时具有生 殖力,而在以后逐步丧失该功能,这个表现可能与上述的随年龄增加雄激 素的抵抗有关。 对本家系中四代个体基因的重复数的检测表明,重 复在该家系中并不绝对稳定。一位女性携带者.的重复数为, 而其儿子先证者,.的重复数为,其他患病个体的重复数 均为,包括一位症状前个体一。这个结果与等所报道 的代问稳定的重复数有所不同”。在该家系中重复数的差异在发病机 理中的确切意义则难以说明。因为尽管重复数不同,但发病年龄几乎 相同;先证者的重复数较高可能是其疾病进展速度较快和清 较高的原因。文献中所报道的基因型和表型的关系也没有一致的结果: 等报道重复数越大,肢体无力的发病年龄越早:而等发现重复数的大小与上 楼梯困难的年龄显著相关,而与依赖轮椅的 年龄无关 ’”。这说明重复数的大小与疾病发展之间的关系相当复 杂。 总之,我们在国内首次报道了经基因检测证实的病家系,详 细描述了其临床特征,以期提高临床医师对本病的认识水平。只要对本病 有足够的了解,临床诊断一般并不困难,但确诊则有赖于基因检测。参考文 献, 【, .. . ;:?., , 【】 . .?. ;: . , , 【】 , , :,, ,. /. ;: .:? 【】 , , , 【】 . ’: : .., , . ?, , ,. ;;, :. 【】 , , , . ;:, . 【】刘秀丽,袁栋才,相毅.病例报道,中华神经科杂志, : ; 【】张社卿,乔德丽,蒋德科等,遗传性运动感觉神经病家系报道,罕少 疾病杂志,::【】 , , . : . ::~【 , , , 】 . ?’;:. .? , , 【】 ;:. . , , , 【】 : , ;:? .【】 , , ,: , , , . ;:? ., , , 【】.;: 【】 , , , . : ,,: . ; 【】 ; . . ; ;,:? ..; .; ., 【】 .?. ;,:? . .., ., , .【】 . : ,, ’, , , 【】 . ;: . . 【 , 】 , , ? ;:? .第二章..病家系临床和分子遗传学研究 .摘要 ??病,也称之为遗传性运动感觉神经病,其 临床特征是四肢远端的肌肉萎缩、无力,伴有不同程度的感觉障碍。包括 周围神 一组临床和遗传异质性的 经疾病。本文报道一个大家系,其先证者,男性,岁时发现行走无力, 用手开锁或提水壶等费力,症状逐渐加重,年后发现小腿和双臂轻度萎缩, 四肢经常有麻木、抽筋感。神经检查:精神、智能正常,颅神经正常;双下 肢浅感觉轻度减退:双下肢明显萎缩,但鹤腿样表现不明显。神经传导检 测显示周围神经传导速度显著减慢,肌电图呈单纯相,并有巨大电位,肌 酸磷酸激酶接近正常。其父岁左右开始患类似疾病。对该家系 调查后发现例临床确诊病人。家系中遗传方式呈现以下特点:家系中第 一代病人的发病年龄在岁以后,第二代发病年龄在岁左右。进展较快, 较早累及上肢一般情况发病后年不会残废。家系中多数成员发生膀 胱功能障碍,表现为排尿无力甚至尿潴留。经全体家庭成员知情同意后, 采集静脉血,常规提取基因组,扩增基因个外显子 的编码序列,经测序仪直接测序后,与标准序列对比,无突变。 然后选择该基因附近的的,扩增产物由测序仪分析,结果表 明家系中患病个体的有个峰,而正常个体均为个峰,这说明浚家 系中的基因突变是属于染色体内的重复。这种重复突变用扩 增基因编码序列常显示为正常,而用微卫星扩增,则可显示其多态性,这 种多态性结果间接说明基因内部有重复突变。我们所选择的在亚洲人 群的杂合率很高,可作为该亚型基因诊断的首选标记。 关谜司, 胁?一协.‰埘庙,锵,肘,謇圆. ,... ., . , . . , ... ., . . . , , . . . ., . 幽幽疯; ‘。’,甜’一屯一一 缸;“一概述 ? ?病,也称之为遗传性运动感觉神经病,其临床 特征是四肢远端的肌肉萎缩、无力,伴有不同程度的感觉障碍。遗传性运动 感觉神经病 , 包括一组临床和遗传异质性的 周围神经疾病。年英国的以及法国的 和 几乎同时报道了这类疾病, 所以也习惯地称之为 ..病。据估计,发病率在/,是最为常见的 遗传性周围神经疾病。本类疾病的遗传方式多数为常染色体显性遗传,但 常染色体隐性和连锁的遗传方式也时有所见。等根据正中神经和尺 神经的传导速度的不同,将本类疾病区别为大类:脱髓鞘型 ,其神经传导速度在 /以下;轴突型 , , ,神经传导速度正常或者接近正常。两型均有感觉电位和肌肉复合动作 电位幅度的下降; 还可见到失神经; 可见严重的神经传导减 慢。 近年来,随着分子遗传学研究的不断深入,以上分类愈来愈显示出其 , 自相矛盾之处,比如周围神经髓鞘蛋白 ,也可以引起 和。 基因的不同类型的异常,既可以发生, 而位于.上的早期生长反应基因 则可由于突变方式的不同分别出现 或者先天性髓鞘形成不 ,的一个亚型。此外,仅靠神经传导 /.足 速度测定不能区别和,所以还有赖于遗传方式的确定。 迄今定位克隆的与有关的基因如下表 椒 峭曲 ’? 四甜 倒?四甘坤岫.哪“ 蚺?肇 ?抽?州岫 . 垒苎丝: 塑竺璧竺 蔓 塑兰一 塑竺塑型竺生 些竺苎兰 墨兰型兰坐 癣啪 “ 黼”。”。:君:藩:;‖’气 。;。,。。, 。。。” “: ?? 凡甜?州 《?““ “姗矧?口 州帕 ‘。 幽伽?% “”’ ?蜘时扪忙%?矗 一’盏”盹 譬窑曼”“ ? 搭晒 铀?口 九 ?” “岱妇?? ?‘??‘ ‘“‘ ~ 。口 到 鲫目 日??删矾? 四? “?一?‘ 嘶工~酊./ ?, .位 / 。甲们口‘噜。疵 。””? ?????? 帕?‘ &四 卅 ? 曲爿 ‘??“ ‰?, 端凳。’ 槲枷.’ / 叫‘ 学羽由。 剃: ?? ?‘州 ?? 配:,难 ?”隆 ”’/ ‘?“ “ ? .:“ ??。 ‘? ? ~? 四“ ?蚴硼侣‘ ?酆:” ?? ‰“?‰? 女: 一: , 日 ,? 口:,鄯 山“’ ?“~.。把 脚?“? :? ? “正?芦 矗““ 嘣?删倍 、? 诸钢铆 、 : ,可 州 氇删 ? ::九吨删一: ::一口玎 一?’ .’ “.‘. ?“ 二 蛐?:“” 》九,? 轨?’ 吨?“ ? ::,?: ?? 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然后取出迅速放入。冰水下? 最后在离心机中离心一,完毕后放入 自动测序仪. .用高度多态性的短串联重复序列检测重复突变 .引物 ,合成下列 对引物,并在每一对引物的正义 选择 个 链’端标记上相应的荧光标记‘~一’‘~一’‘~一’‘一’‘~一’ ‘~一’ ‘~一’‘~一’ ‘~一’ ‘~一’ ‘~一’‘~一’ ‘~一’ ‘~ 一’ ’一’ ‘~ ‘~’’,、一’ ‘~’’一’ ’ ‘’”’: ‘~:一’ ‘:、 、、一:’ 叭 ‘~’ ”一’ 。、;一‖、 一’‘;.’;‘一一’ ‘一一’ ‘一一’一’ ‘一一’ 根据扩增片断长度编为个,混合引物为每每引物各. 进行多重; .主要试剂及设备 溶液 型全自动测序仪公司 其余同上 . 扩增反应体系, 基因组. . . . . 混合 .. . 去离子水基因组. . . . . 混合 . .. 去离子水 . 扩增反应条件 一。/ 一。/ 。/一。/一。/ ?????????????????????????????????????? . 产物稀释与变性 孔板中每孔加入去离子水 振荡混匀,离心 中加入 在 振荡混匀,离心 取新孔板,每孔加入混合溶液 每孔加入稀释的产物 振荡混匀,离心 置于。下变性 然后取出迅速放入。冰水下 振荡混匀,离心 放入自动测序仪. 结果 . 测序法检测点突变 的个外显子编码区标准序列均来自的基因库,测序结 果来自通过测序仪分析得到的测序图。经序列比对,未发现点突 变。编码区标准序列 测序结果图编码区标准序列 测序结果图 编码区标准序列 测序结果图 ” % 。? 。 。 。一舭九删 .。 川?~ ?轴 燃 ?仆: ???心 一搬盟 一撩 。~一慨 ‘ 。一越 ?‘盟 。一. 嫩 ?? ??刖三二 二一 ?一 ????『。一 ???儿一 。??八一 :??差茔一 。~.挑一编码区 标准序列 测序结果图 .用高度多态性的短串联重复序列检测重复突变 当重复时,由于的高度多态性和可变性,通过测 序仪分析,患者的该等位基因数目为个图。在位患者均在不 同的处检出重复突变,检出率为%。证实了该家系致病因 素为重复突变。 画蛋圃 ~? 一卜八 幽正聃个体上患棚个体下的等位璀矧数讨论遗传性运动感觉神经病 , 包括一组临床和遗传异质性的 周围神经疾病。年英国的以及法国的 和 几乎同时报道了这类疾病, 所以也习惯地称之为 ..病。本类疾病的遗传方式多数为常染色体显性 遗传,但常染色体隐性和连锁的遗传方式也时有所见。据估计,发病率 在/,是最为常见的遗传性周围神经疾病。患者完全丧失行走能 力者不常见。迄今,没有任何疗法能阻止疾病的发生或者延缓疾病的进展。 本病既累及运动神经也累及感觉神经。典型的临床表现是肢体远端的 肌肉无力、萎缩,肢体感觉受损,腱反射消失或者减退:常见的体征常与 肌肉的萎缩、无力有关。起初影响双脚和双下肢,随后双手和前臂也逐渐 受累。病程中常可感受到联甲步态,绊脚和跌跤时常发生。脚部畸形弓 形足等则与脚的固有肌萎缩有关。本病临床表现的差异很大,可以仅表 现为弓形足、轻微的远端肌肉萎缩,也可以表现为严重的远端肌肉萎缩、 无力,以及手和脚的畸形。一般无植物神经系统的异常,但是,该家系中 的先证者发病年后即出现小便潴留的症状,该症状不是由于前列腺增生 或泌尿系感染等局部原因所致。此外也有文献报道患者出现夜间呼吸 困难的情况。虽然感觉神经也可受累,但临床上较少见到肢体疼痛和感觉 缺失;多数为亚临床神经电生理方面的异常。本家系中先证者肌电图 显示典型的运动神经和感觉神经受累,呈典型的神经原性损害。与远 端型脊肌萎缩症的鉴别要点在于前者的感觉神经诱发电位消失或者明显减 弱。 本病常在岁前后发病,但是中年期发病的患者也并非少见。本家系 中先诅者发病年龄在岁左右,进展速度相对较快。而其父代发病年龄在 岁以上,在往上溯其祖父辈的情况可知:先证者祖母在做家系调查的当 年已岁,身体健壮,无任何神经系统异常,其基因检测正常;先 证者祖父岁时病故于其他疾病,当时也无神经系统的异常,推测其辛:父 足家系中的建立者。山此可见早发现象 在该家系中十分明显。但从目前基 因检测的结果来看还难以明确其突变情 况与早发现象之间的关系。 在全部病人中%左右的患者由位于号染色体的周围神经髓 鞘蛋白 ,基因突变所致,该基因的突变类 型绝大多数为染色体内重复 ,此种突变用 扩增基因编码序列的方法难以识别。在本家系中用常规的检测 基因无突变的结果符合以上情况。近年来国外研究者先后应用位于重 复区不同部位的短串联重复序列检测本病的基因重复,使得临床上 基因重复的检测率不断提高。短串联重复序列,约占人整个基因组 的%,由长的基本构成单位串联重复排列而成,常见的形式有 、、、、、等。当?时,就 在人群中呈高度多态性。的长度多态性来源于串联重复的数目不同,长 度差别遵循孟德尔共显性遗传规律,因而可以作为理想的遗传标志。 本实验结果说明该家系中基因测序虽然无突变,但用荧光标记的 检测位于该基因内的短串联重复序列微卫星,结果发现其多 态性与基因内重复显著相关。在该家系中所有患病个体的等位基因 有个,而正常个体只有个。可见该家系中基因突变的方式也是 染色体内的重复。 本实验采用的的在亚洲人群中的杂合率都是目前报道较高的,个 对家族位患者的检出率达%。因此可以作为基因重复检 测的理想标记物。 其他类型的简介 . 绝大多数常染色体显性遗传的家系连锁分析定位于 ..,并且通常与该染色体区域的大约.的重复有关。该 部位的重复以稳定的孟德尔方式遗传;但也可表现为该部位从头重 复,后者是多数散发病例的致病原因,也是某些以前认为是常染 色体隐性遗传忠者的原因。当錾因型为从头重复时,多数【于精子形成过程 中的紊乱,也有%的从头重复是由于卵子形成过程中的紊乱。 ,基因, 的致病基因是周围髓鞘蛋白后者在细胞内表达。该基因编码一个个氨基酸的 蛋白质;该 蛋白质位于周围神经髓鞘的致密部,一般认为包含个跨膜域,在 进化上高度保守。的表达水平对周围神经髓鞘的合理形成极为关键。 ..部位重复的神经病患者是由于该部位出现拷贝的 基因,导致该基因位点的过量表达。在个别罕见的患者中,还确认了该部 位的纯合子重复,其临床表现比相应的杂合子的同胞或其父母的症状要严 重得多。单倍体的表达不足则引起“伴有受压麻痹倾向的遗传性神经病 ,”。 极个别 的家系,虽然也连锁定位于.?,但不具有该部位的重 复,而是基因内携带的错义突变。临床诊断的患者中有/ 携带.?位点的重复;目前已能对患者进行基因检测,包 括.位点的重复和点突变,以便对一些可疑的遗传性神经病进行 评价。 . 型远比少见,是由人类髓鞘蛋白 ; 或者基因的突变所致,该基因定位于.。是周围神经 系统髓鞘的主要结构蛋白的组分,按质量计算约占%,其表达量占 总的的%。是细胞粘附分子免疫球蛋白基因超家族 的成员,也位于周围神经髓鞘的致密部。它由个氨基酸组成,包含 个细胞内域和个位于细胞外的具有单一跨膜节段的糖基化域。在患者中 已经发现了很多不同的点突变,这些突变大多位于基因产物的细胞外域。 临床上不能区分和,但可进行分子遗传学检测。 . 也称为.病,是婴幼儿期间发病的肥大性脱 髓鞘性多发性神经病。神经传导速度显著下降/,脑脊液蛋白量 升高。其临床表现与型的严重病例有交叉重叠,继续对二者进行临 床区分也许是没有根据的。很多患者为散发病例,没有肯定的家族神经病史。 分子遗传学研究表明,发病与或者基因的点突 变有关,但有些家系不存在这两个基因以及基因的突变。迄今鉴定的 突变均为显性遗传特征。最近,有人提出基因的点突变是先天性 髓鞘形成不足 ,的一种发病机制,看来 很可能是的一种更为严重的类型。 . ,即“伴有受压麻痹倾向的遗传性神经病,”,是一种常染色体显性遗传的疾 病, 一般在青春期发病,由于周围神经反复发作性的脱髓鞘,造成肢体麻木、 肌肉无力、萎缩的反复发作。腓骨肌萎缩、腕管综合症和其他嵌顿性神经 病是常见的临床表现。病人和无症状携带者均有神经传导速度轻度 减慢,病理变化包括周围神经节段性脱髓鞘和香肠样结构形成。由于与 的表现有交叉重叠,有时会被误诊为。 位点在..,与该区域.长度的缺失有关。染 色体复制的型和染色体缺失的型是在减数分裂过程中不平 衡交叉而芟互发垒‘的产物。在患者,个拷贝的基因的缺失 和这个关键基因的表达不足导致了脱髓鞘的发生。多数患者存在相 关的号染色体的缺失;然而,极少数患者存在基因的点突变。 该基因的临床检测目前已能进行。本病的治疗主要是支持性的,有人提出 了神经减压术,但其疗效却有争议。有些证据表明外科手术修复对 患者的腕管综合症疗效甚微;肘部尺神经的易位可造成不良后果,因为该 神经对操作和轻微外伤特别敏感。 . 比型少见,目前对其分子机制的了解仍进展不多。一般 晚来,发病年龄较晚,对双手固有肌的累及较少,无神经粗大,伴 洋葱球样结构的广泛的脱髓鞘改变不明显。患者神经传导速度正 常或者轻度下降。根据对相关家系的连锁分析,目前已经定位的基因或者 基因位点有:.的基因、.、、 、的基因、。然而,有些 家系最初根据神经传导速度轻度下降而诊断为型的,后来经过基因 检测证实或者基因突变为其原发的分子缺陷。 . 连锁的遗传性运动感觉神经病临床特征为:脱髓鞘性表现、不出现父 子传递、发病年龄较早、男性患者进展较快等特点。神经传导速度差异很 大,可自正常到中度下降。发生比率占的%左右。如果家系中不 存在父子传递,且常见的基因又正常时,要考虑到。最初发 现的位点在?,由于连接素基因 ,的点突 变所致。 编码缝隙连接的一个主要组分,在周围神经中表达。 在结构上与相似,因为两者都含有类似方位的个跨膜 域。目前已发现该基因不同突变已超过个;根据其分布形式来看,该 蛋白的所有部位在功能上都很重要。目前临床已能对该基因进行检测。与 其他髓鞘蛋白基因类似,也在周围神经中表达;然而,免疫组化研究 提示表达位置不同。和在髓鞘的致密部表达,而位于 细胞胞浆的非致密的折叠区, 在结附近的 .切迹处。这个位置表明,由为组分的缝隙连接在 髓鞘周围并透过髓鞘提供养分和离子转移通道中的作用。据认为蛋白 的突变可改变细胞局部结构及其物质交换,并干预细胞问的信息交流。 . 变异型 一些型的家系,其、、基因无突变,而与早期 ,的锌指域 生长反应基因的突变有关。研究表明,在分化的髓鞘细胞中是髓鞘化基因 的直接的跨膜激活物。在一个先天性髓鞘化不足的家系中也发现基 因的突变。一些常染色体隐性遗传的家系也有报道,特别在突尼斯近 亲结婚的家族中。脱髓鞘和轴突型并存的家系也有文献述及,并被定为 . 型。一种常染色体隐性遗传的脱髓鞘型的神经病被定位于 。另一种类型的以局灶性髓鞘折叠为特征,并被定位于 ,最近发现与基因的突变有关,该基因编码肌管相关蛋白 一,据认为该蛋白是转录调节物。另一家系 ? 的表型符合的特征,但是不与号染色体连锁,也不与已知的其他 任何位点相连锁,说明本病具有更复杂的遗传异质性。目前,临床上尚不 能对的各种亚型或者进行检测。 .参考文献 .. 】 , ; . , 【】 .. ;: , . 】 , .::?.., , 【. ;:??. ? 【 ,.? ;:?. . , .【】 , ,?? . ;:? . , , , 【】 ? . ::?. , , , 【】 .. ;:?. . 【 , , , ????;:? . 第三章 病的分子生物学机制研究进展 病的临床特征 病又称为连锁隐性遗传性脊髓延髓肌萎缩. ,,于年由首先系统描述 了它的临床和遗传学特征,所以后来的文献中就习惯地称之为病 ?。据估计在本病能被充分认识的国家和地区,其发病率是/ ,但相 当一部分病人很可能未被正确、及时诊断【?。 该病的临床特征是男性成年期发病,以进行性四肢近端无力和肌肉萎 缩为主要表现,逐渐累及延髓肌肉,出现舌肌萎缩、构音障碍、吞咽障碍 等球麻痹表现。其首发症状一般出现在青春期,由于雄性激素不敏感,造 成突变基因携带者个体的乳房女性化,某些患者出现睾丸发育不良,后者 是造成患者成年期不育或者阳痿等的直接原因。随后全身肌肉出现痛性痉 挛或者肌强直。比如,若患者用力握紧双拳,即难以马上放松:若用力向 左转头.即不能立刻转向右侧:若用力以脚掌向下踩刹车后,踝关节不能 马上背屈,必须屈曲膝关节才能放开刹车。这些表现在寒冷天气尤易发生。 同时患者还会感觉到肌肉跳动,在背部、四肢、颈部和面部均会出现,精 神紧张时更为明显。这些症状可在肌肉无力出现前持续十多年,甚至发生 在一些女性携带者而终生存在。成年期后患者逐渐感觉肢体无力和萎缩, 一般从下肢近端开始,逐渐加重,但进展速度较慢,以后上肢逐步受累, 出现举臂无力或者双手握力差、精细动作困难等。数年甚至数十年后无力 症状恶化,以致蹲下后不能站立甚至不能上楼梯。除肌肉无力和萎缩外, 多数患者有不同程度的感觉减退,但一般为亚临床表现,比如感觉神经动 作电位减弱或者消失,也有些患者有深感觉障碍【”。这是本病不同于一般 运动神经元病的特征,也是易被诊断为遗传性运动感觉神经病的主要原因。 延髓肌萎缩,如舌肌萎缩、构音和吞咽障碍一般出现较晚。除此之外,部 分患者可有糖尿病、糖耐量异常,雄激素水平偏低而雌激素水平相对增高。 肌咆圈检查可见典型的下运动神经元受损的表现,可见柬颤电位、巨 大咆位、失神经表现、感觉神经动作乜位下降或者阙如,但神经传导速度一 般正常。血清肌酸磷酸激酶常增高,有些患者达正常者的 倍,与疾病的进展速度有关,而与病程无明显关系。这也是本病早期易被 误诊的原因之一。 其致病原因是位于染色体长臂上的雄激素受体 基因的异常【。在正常个体雄性激素受体基因第一个外显子中的多态 性重复一般在.次,而在患者和女性携带者中该等位基因的重复 数一般在.次,造成雄激素蛋白氨基端的多谷氨酰胺链 延长,这种突变的雄激素受体与配体本身结合后即由胞浆转入细胞 核内,出现神经元核内的包涵体 ,,后 。 者是导致神经元变性、坏死的可能原因【 病的分子机制 . 三核苷酸重复扩延与神经系统疾病 基因编码序列中编码谷氨酰胺,,重复扩延造成蛋 ,的延长,这种异常的 白质中的多谷氨酰胺链 蛋白质结构足以引起一系列神经系统疾病,比如脊髓小脑性共济失调、 病、齿状核红核苍白球萎缩以及迟发性的脊髓延髓型肌肉萎缩 ,。其中,雄激素受体基因第一 个外显子中重复扩延造成是由等于年发现,也是 本类疾病中首先被发现的一个病种【”。由于本类疾病都是由蛋白质的多谷 氨酰胺链的异常扩延引起,所以也称此类疾病为多谷氨酰胺病 。它们共有一些突出的临床特征,如早发现象、体细 胞镶嵌 ;虽然突变基因有广泛的表达,但仅选择性累及 一些神经元或特定的非神经元细胞:大部分多谷氨酰胺病的病理特征是在 细胞核内出现包涵体;多数情况下重复扩延的长短与发病年龄成反相 关。这些情况说明,尽管每个疾病的致病蛋白的本质不同,但可能有共同 的发病机理】。 .配体对小鼠模型的作用 与本类疾病最大的不同之处在于致病的突变蛋白雄激素受体, ,具有特异性 的配体,即睾丸素。正常情况 下以无活性“预受体”复合物形式存在于胞浆内的不同部 位,并以配体依赖的方式易位到细胞核内,因此配体的存在改变了的 亚细胞位置。在细胞内的运输可能在该病的发病机制中有重要作用“。 等在含有或者个重复的转基因小鼠身上制成了 模型。这个模型不仅表现出神经疾病的特征,而且还具有因性别不 同的表型差异。含重复的品系显示出进行性运动功能损害,而含 重复的品系无疾病表型。在雄性小鼠这些运动损害一般出现在 周龄,且症状特别明显,进展特别迅速;而在雌性小鼠一般没有这些表现, 若出现症状者一般在周龄以上,且程度很轻。所有发病小鼠都身体较小、 进行性肌肉萎缩、寿命较短。雄性的半数死亡率在?天之间;而雌性 在天后存活率仍在.%之问。雄性小鼠的神经元核内包涵体比雌性 要明显且弥散得多。尽管突变的雄激素受体蛋白表达具有明显的性别差异, 但在两性之间的的表达却无显著差异。这说明睾丸素水平对控制性 别差异的表型,特别在突变的转录后渊节中具有重要的作用“。 这种性别差异的表型使人们联想到试激素干预动物模型以观察动物 的表型变化。与似手术组对比,阉割的雄性小鼠,其症状?显改善,小鼠体重 增加、运动功能改善、寿命延长。印迹分析和组织病理学 也显示阉割后的雄性小鼠其胞核内突变的的积聚比假手术组明显减少, 所以阉割雄性小鼠阻止突变向胞核内易位是由于睾丸素水平的下降。 反之,若给雌性小鼠使用睾丸素,小鼠的症状明显恶化,胞核内突变的 积聚增加”。 .配体依赖的雄激素受体蛋白修饰 雄激素受体蛋白在合成之后,以非结合状态的“预受体” , 复合物形式存在,这种复合物至少包含热休克蛋白,, 以及蛋白质和。这种预受体复合物代表一种备用的受体构象, 可随时与配体进行结合。雄激素受体的突变体由于缺乏配体结合域,既不 能与配体结合,也不能与热休克蛋白结合,所以在结构上始终处于有活性 状态。这说明,预受体复合物既能维持受体处于能结合配体的形式,又能 维持受体在转录后处于无活性状态。若没有配体的刺激,与上述的热休 克蛋白联结,以无活性形式存在于细胞浆内;一旦配体结合到受体上,雄 激素受体即从这一蛋白复合体中分离出来,易位进入细胞核,通过其自身 的锌指结构域 与序列以二聚体形式相结合。然 后这种受体蛋白即可刺激或者抑制的转录过程。所以配体依赖的 。 与的分离可增加突变体的毒性,形成的发病基础 配体结合后调制雄激素受体的功能可有多种方式。与含多谷氨酰胺链的 包涵体共同存在的还有多种组分,如泛素蛋白酶体和一些陪伴分子。这些 陪伴物和蛋白酶体可易化突变蛋白的再折叠或者降解,对神经元避免扩延 的多谷氨酰胺链的毒性具有重要作用【“,”。在神经元细胞的模型上 观察到热休克蛋白的过度表达可减少突变的积聚,并能明显阻止细胞 死亡”。体外过量表达可增加突变的可溶性,并增加突变 的降解【”】。 转谷氨酰胺酶对增加多谷氨酰胺链的毒性也引起了研究者的注意。转谷 氨酰胺酶催化谷氨酰.赖氨酸的交联.,结果形成可抵抗蛋白 水解的聚集体。具有多谷氨酰胺链扩延的突变蛋白质是转谷氨酰胺酶的 偏向的底物。因此,突变的经转谷氨酰胺酶的作用后形成交联,从而改变了自 身的表位特征。在睾丸素存在的情况下,突变的和转谷氨酰 胺酶两者引起蛋白酶体功能的微扰,导致蛋白的降解明 显延迟。这些现象说明,蛋白酶体的破坏也是依赖于配体的【?。 『如其他多谷氨酰胺链疾病一样,在的发病机制中,功能获得 的毒性突变也存在其中。尽管多谷氨酰胺链的扩延可轻 度抑制的转录活性,但运动损害的症状从来不发生在睾丸严重女性化 的病人。携带个重复的转基因小鼠在人类驱动子的驱动下显 示出运动功能的损害,这说明多谷氨酰胺链的存在足以引起的病理 发生过程】。所以在的神经损害不能归因于功能的丧失,这也 是睾丸素用于治疗无效甚至使疾病恶化的原因。 病治疗的前景展望 阉割疗法治疗含重复的小鼠模型的成功使研究者联想到试用睾 丸素阻滞疗法来治疗病。在前列腺癌的治疗中用到, 一种促黄体生成素的类似物,可减少睾丸素自睾丸的释放。该药物最初由 于上调促黄体生成素受体,可使血清内睾丸素水平短暂升高,但随后即下 降到不能检测到的水平。由于下调垂体内的促黄体生成素受体 而阻止睾丸内睾丸素的产生,从而产生与阉割疗法相