妇科止血消痛颗粒对产后子宫复旧不全大鼠模型子宫MMP.doc

妇科止血消痛颗粒对产后子宫复旧不全大鼠模型子宫MMP.doc 妇科止血消痛颗粒对产后子宫复旧不全大 鼠模型子宫MMP 作者:曾晶,尤昭玲,查亚萍,邓海燕,李丹【摘要】 目的 观察妇科止 血消痛颗粒对产后子宫复旧不全大鼠子宫组织基质金属蛋白- 9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制物-1 (TIMP-1)达的影响,探讨妇科 止血消痛颗粒治疗产后子宫复旧不全的机制。方法 建立大鼠产后子 宫复旧不全病理模型,随机分为模型组、产妇康组及妇科止血消痛颗 粒高、中、低剂量组。造模第1日开始各给药组分别灌胃相应药物, 空白组、模型组予蒸馏水灌胃。均每日1次,连续7 d。采用原位杂 交法检测各组大鼠子宫组织中MMP-9、TIMP-1基因的表达水平。 结果 各组大鼠子宫内膜中均可检测到MMP-9和TIMP-1的杂交信 号。模型组MMP-9表达强度明显超过空白组,TIMP-1表达弱于空白 组。妇科止血消痛颗粒高、中、低剂量组及产妇康组,MMP-9 mRNA 的表达明显降低(P0.05,P0.01);妇科止血消痛颗粒中、低剂量组与产 妇康组MMP-9 mRNA的表达强度相似,但均低于妇科止血消痛颗粒 高剂量组的表达强度(P 【关键词】 产后子宫复旧不全;妇科止血消 痛颗粒;大鼠;基质金属蛋白酶-9;组织金属蛋白酶抑制物-1 Abstract:Objective To explore the mechanism of Fuke Zhixuexiaotong Keli in rats model of inplete puerperal involution of uterus by detecting the expression of metalloproteinases-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in the uterine redintegration inplete model. Methods Seventy– tale rats ly divided into 6 groups:blank group, model group, Chanfukang group, and high-, middle-, loodel of inplete puerperal involution of uterus odel group RNA of MMP-9 gene iddle- and loilar in loRNA ilar (P0.05). Conclusion Fuke Zhixuexiaotong Keli can play a role in the treatment of postpartum uterine redintegration inplete by inhibiting MMP-9 in high expression, promoting TIMP-1 in loatrix metalloproteinase-9;tissue inhibitor of metalloproteinase-1 产 后子宫复旧不全是诱发产后各种疾病的重要原因,临床主要表现为血 性恶露持续淋漓不尽或反复间歇性血性恶露和产后腹痛,均严重影响 妇女的身心健康。子宫体及子宫内膜在分娩前后所经历的巨大变化 与胶原降解(尤其是?型胶原降解),以及产后子宫内膜修复机制的启 动等关系密切,基质金属蛋白酶(MMPs)在胶原降解过程中扮演重要角 色[1]。MMPs及其组织抑制物(TIMPs)参与月经发生、内膜重塑、内 膜血管修复,其表达受雌、孕激素及局部细胞因子的影响[2]。研究发 现, MMP-9/TIMP-1比值接近1时,能维持正常细胞外基质(ECM)降解 和重建过程[3]。本实验采用产后子宫内膜炎导致子宫复旧不全大鼠 模型,观察MMP-9、TIMP-1mRNA在产后子宫内膜中的表达,并探讨 妇科止血消痛颗粒在产后子宫复旧中可能的作用机制,现将结果报道如下。 1 实验材料 1.1 动物 选取清洁级大白鼠60只,雌雄兼备,鼠龄3个月以内,体重180,220 g左右,雌、雄比例为2?1,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2009-0004。由专人清洁级饲养,喂以大鼠颗粒饲料,饲料由湖南中医药大学实验动物中心提供。 1.2 药物 妇科止血消痛颗粒(党参、黄芪、蒲黄、鹿衔草等),湖南中医药研究院提供,批号20090328,浸膏浓度为4.43 g原药材/g,临床用量为52 g/d。实验用药高、中、低剂量组含原药材量分别为4.68、9.36、18.72 g/kg,实验当日用白开水配制。产妇康颗粒,深圳三顺制药有限公司生产,批号080802。 1.3 细菌菌种 致病性大肠杆菌,为临床分离菌,菌号X25922,湖南中医药大学微生物研究室提供。 1.4 试剂 MMP-9原位杂交检测试剂盒,武汉博士德生物技术有限公司提供,批号MK1540;TIMP-1原位杂交检测试剂盒,武汉博士德生物技术有限公司提供,批号MK1548。 1.5 仪器 Shandon325型石蜡切片机,英国Shandon公司;MIAS医学图像系统,北航公司。 2 实验方法 2.1 造模 参照文献[4]方法,将大鼠按雌、雄2?1的比例合笼,次晨观察阴栓,并进行阴道涂片检查,以明确查见阴道栓者或发现精子的当日为妊娠第1日。所有妊娠大鼠均在同样环境下采用同样饲料分笼饲养,直至自然分娩。分娩后第1日,将过夜培养后的致病性大肠杆菌(X25922)用生理盐水稀释成1.0×107个/mL,进行子宫内接种,接种量为0.20 mL。以接种后黏膜下层充血、出血,并有炎性细胞浸润为造模成功。 2.2 分组与给药 造模后大鼠随机分为模型组、产妇康组及妇科止血消痛颗粒低、中、高剂量组,每组10只。妇科止血消痛颗粒低、中、高剂量组分别于造模后第1日开始,每日灌胃相应剂量妇科止血消痛颗粒,相当于成人等效1、2、4倍,灌胃体积为8 mL/(kg?d);产妇康组给予5.4 g/kg产妇康灌胃;模型组和空白组给予8 mL/(kg?d)蒸馏水灌胃。各组均每日灌胃1次,连续7 d。2.3 指标检测 2.3.1 子宫形态学观察 取出子宫,HE染色,光镜下观察子宫形态学变化。 2.3.2 基质金属蛋白酶9、组织金属蛋白酶抑制物的检测 取出子宫,剥离干净后放入4%多聚甲醛中固定,乙醇脱水,石蜡包埋,切片,厚约10,20 ?m,进行MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA原位杂交,显微镜检并电镜摄像,图像分析子宫MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA信号表达强度。 2.3.3 图像分析 杂交信号强弱用平均灰度值表示,灰度值越小,说明其阳性反应的程度越高,表达越强。每个标本连续切片,随机选取4张切片。先在显微镜低倍镜下(10×l0倍)对子宫内膜进行准确定位;再在高倍镜下(10×40倍)观察阳性细胞的形态和分布,然后采用MIAS医学图像分析系统,进行病理图像分析各 区域平均灰度。MMP-9 mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色;TIMP-1mRNA 的细胞胞浆着色呈棕黄色。 3 统计学方法 所有数据均采用SPSS15.0统计软件包进行处理,计量资料均以—(—资)?s表示,符合正态性和方差齐性的数据用单因素方差分析,样本间两两比较用q检验,不符合上述条件用秩和检验。 4 结果 4.1 妇科止血消痛颗粒对大鼠子宫组织基质金属蛋白酶9、组织金属蛋白酶抑制物表达的影响(见表1) 表1 各组大鼠子宫组织MMP-9、TIMP-1表达的阳性细胞率、平均灰度值比较(—(—的)?s)注:与模型组比较,#P0.05,##P0.01;与产妇康组比较,*P0.05,**P0.01 4.2 妇科止血消痛颗粒对大鼠子宫形态学的影响 与空白组对照,250倍视野下观察到大肠杆菌植入大鼠模型组上皮脱落坏死,有大量炎性细胞浸润,宫腔中见大量组织碎片,炎性细胞及渗出液,内膜下小血管部分扩张、充血,间质较疏松水肿,可见较多炎性细胞浸润,表明造模成功。与模型组比较,妇科止血消痛颗粒各剂量组及产妇康组内膜上皮轻度损伤,内膜炎性细胞较少,偶可见小血管扩张、充血;间质较致密,炎性细胞少;内膜上皮损伤轻,上皮下有散在炎性细胞浸润,宫腔中未见明显渗液。 5 讨论 子宫复旧不全是产科领域的常见病症,是诱发各种产后疾病的重要原因,诸如恶露不绝、腹痛、产后出血等,均严重影响妇女身心健康,是近年来国内外研究的热点。胶原降解和子宫内膜修复是子宫复旧的重要步骤。MMPs/TIMPs是一组依赖锌离子的蛋白酶家族,主要调节ECM成分的沉积和降解,广泛分布于子宫内膜,表达具有时间性和空间性,与子宫内膜的周期性增生和剥脱相一致,参与月经发生、内膜重塑、内膜血管修复,其表达受雌、孕激素及局部细胞因子的影响。在产后子宫局部发生炎症时,子宫内聚集了大量的中性粒细胞(Neu)和巨噬细胞(MΦ),Neu通过释放大量的胶原酶、明胶酶、弹力蛋白酶、组织蛋白酶G,参与影响ECM胶原酶的合成与分解的动态平衡[5]。在产后子宫局部发生炎症时,机体的炎性细胞(如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞)受到外界刺激,可通过相应的受体启动细胞内信号转导过程,激活核因子-κB (NF-κB),导致肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、6、8等转录增多,同时这些细胞因子又是NF-κB的激活剂,进一步激活MΦ、Neu,激活胞内NF-κB[6]、一氧化氮合酶(NOS),进一步导致炎症介质基因的复制与转录,一氧化氮(NO)升高、纤溶酶原激活物(PA) 升高、纤溶酶激活物抑制物(PAI)下降、MMPs升高,最终引起多种炎症介质的超量释放,从而形成级联瀑布效应[7],进而加剧 NO 的产生,最终导致恶露淋漓不净,并启动修复机制。 尤昭玲教授认为,产后病机多虚多瘀,产后子宫复旧不全临床表现以虚、血、痛为主。其中虚因产时耗气或胞宫因伤而虚;血系胞宫及其脉络因伤或气虚不固;痛由胞宫及其 脉络因伤或瘀血留滞、脉络不畅。气虚血瘀是产后子宫复旧不全的基本病机,治疗若单纯化瘀,不仅有伤正之忧,而且更有动血之虑;若单纯补益,则有碍邪之弊。故以益气化瘀、扶正祛邪为法。妇科止血消痛颗粒系临床经验方,用于产后或人流、药流、上环等生育手术后气虚血瘀所致的腹痛及阴道不规则流血等。本实验结果提示,产后子宫内膜炎导致产后子宫复旧不全大鼠子宫组织局部MMP-9 mRNA存在异常高表达,TIMP-1mRNA存在异常低表达。妇科止血消痛颗粒能降低MMP-9 mRNA的高表达,升高TIMP-1 mRNA的低表达,使MMP-9/TIMP-1比值接近1。【