masson染色

masson染色 4.9石蜡切片检查 放入装有10,中性缓冲福尔马林的小瓶，入4?冰箱固定(<24 h)，再经过脱水、浸蜡和包埋等步骤，制成石蜡块，连续4μm切片制成石蜡切片，进行如下检查: 4.9.1 HE染色 4.9.1.1试剂配制 ?10,中性缓冲福尔马林溶液的配制:40,甲醛原液50 mL，加入0.01 mol/LpH 7.4的PBS 450 mL中。0.01 mol/L pH 7.4的PBS配置:NaCI 8.0 g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4?12H2O 2.9g，KCI 0.2 g，加蒸馏水定容至1000 mL，高压消毒灭菌20 min。 ?苏木素液:苏木素2.5 g，纯乙醇25 mL，钾明矾2.5 g，氧化汞1.25 g，冰乙酸20 mL，蒸馏水500 mL。配制方法:先将苏木素溶于乙醇中(稍加热)，将预先已溶有明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，防止溶液溅出，再煮沸2 min。此时将烧瓶立即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。 ?伊红Y染色液:伊红Y 0.5-1.0 g，蒸馏水75 mL，95,乙醇25 mL，冰乙酸1-2滴。配制方法:先取少许蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入乙醇。 ?盐酸乙醇分化液:盐酸0.5 mL，75,乙醇100 mL。 ?其它:二甲苯，梯度浓度乙醇，中性树脂等。 4.9.1.2操作步骤: ?捞片后在58-60?烘烤15 min。 ?切片脱蜡至水:二甲苯?10min、二甲苯?5min、无水乙醇?2min、无水乙醇?2min、95,乙醇1 min、80,乙醇1 min、75,乙醇1 min、蒸馏水洗2 min。 ?苏木素染色5 min，自来水冲洗。 ?盐酸乙醇分化3 s(提插2下)，自来水冲洗，温水(约50?)5 min。 ?置伊红液2 min，切片进入蒸馏水中速洗一下。 ?常规脱水，透明，封片:95,乙醇?1min、95,乙醇?1min、100,乙醇?1min、100,乙醇?1min、二甲苯石炭酸(3:1)1 min、二甲苯?1min、二甲苯?1min、中性树脂封固。 ?镜检: 显微镜下所见由心肌炎症侵润程度面积积分示，0级:没有炎症和纤维化;1级:病灶不超过心脏横面的25%;2级:面积为25%-50%;3级:面积为50%-75%;4级:面积为75%以上。 心肌纤维化程度由面积积分表示，0级:没有炎症和纤维化;1级:病灶不超过心脏横面的25%;2级:面积为25%-50%;3级:面积为50%-75%;4级:面积为75%以上。以上病灶面积测量均使用目镜下的方格比例尺。 4.9.2 Masson染色 4.9.2.1试剂:Masson染色试剂盒，其它试剂配制见HE染色。 4.9.2.2染色步骤:?切片脱蜡至水:二甲苯?10min、二甲苯?5min、无水乙醇?2min、无水乙醇?2min、95,乙醇1 min、80,乙醇1 min、75,乙醇1 min、蒸馏水洗2 min。 ?3,重铬酸钾常温过夜，充分水洗。 ?天青石兰B染色10 min，水洗。 ?苏木精液染色10 min，水洗。 ?0.5,盐酸酒精分化数秒，水洗(细胞核变蓝)。 ?酸性复红、丽春红G和橙黄G混合液用醋酸水稀释10倍，染色10 min滤纸轻吸，不洗。 ?5,磷钨酸分化10-20 min，滤纸轻吸，不洗。 ?亮绿染色15 min，迅速通过95,酒精(如亮绿不够深，可重新回到亮绿液中)。 ?常规脱水，封片。 ?镜检: Masson染色切片，细胞核呈黑色，心肌纤维呈红色，胶原纤维呈亮绿色。在200倍视野下，使用图像系统进行心肌胶原半定量研究，计算心肌胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)、心肌血管周围胶原面积(perivascular collagen area, PVCA)。计算方法:CVF,胶原面积/总面积，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积，随机分析5个视野，计算每个视野中胶原组织所占百分比，取平均值。 PVCF,壁内小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积，每一标本取5个壁内小动脉横切面进行测量，取平均值。