幽门螺杆菌感染动物模型述评

幽门螺杆菌感染动物模型述评 张永斌 邹移海 作者:郭学军 【关键词】 螺杆菌感染;,,疾病模型,动物;,,综述,指导性 摘要:综述了幽门螺杆菌(H.pylori)感染动物模型的建立，并对几种重要的Hp感染动物模型作了述评。认为目前常规用于研究Hp感染的实验动物有小鼠、大鼠、雪貂、蒙古沙鼠、豚鼠、转基因小鼠及小型猪等，而小鼠由于遗传背景明确，个体差异小，有很多品种品系，容易饲养繁殖且费用低廉，并且与小鼠相关的鼠免疫球蛋白、细胞类型、细胞因子等试剂较容易购买，可以更好地进行Hp感染疫苗的研究，所以目前小鼠在Hp感染的研究中是应用较多的动物。但小鼠不适合Hp感染的并发症(如溃疡、肿瘤等)的研究。Hp感染的动物模型在中医药研究中主要用于脾虚证Hp感染的研究、中药药理及治疗Hp感染中药的筛选。 关键词:螺杆菌感染; 疾病模型，动物; 综述，指导性 1983年，澳大利亚学者Marshall和Warren从慢性胃炎患者的胃窦粘液层及上皮细胞中首次分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，并指出该菌可能是慢性胃炎的病原菌。1990年8月的悉尼国际胃肠会议肯定了Hp与慢性胃炎(CG)和消化性溃疡(PU)的关系,1,。近年来的研究表明，Hp与胃癌的发生也有密切的关系。因此，复制幽门螺杆菌感染的实验动物模型，对于研究预防和治疗Hp感染的方法及检测Hp疫苗有效性和安全性等都有十分重要的意义。 由于单一的动物模型不能复制出所有Hp感染后的表现，所以需要不同 的动物模型来研究疾病的各种特性，并且应该依据所研究疾病的内容来选择动物模型。在选择动物做模型时，应考虑以下几个因素:(1)动物的遗传特性:Hp感染不同的人群后引起的临床表现各不相同，提示宿主基因型 )动物的可用性:有些研究与疾病的表现型之间可能存在一定的联系。(2 需要的动物种类特殊，如近交系动物、遗传突变型动物、免疫缺陷型动物等，这些特殊品系的动物能否获得对实验成功至关重要。(3)动物的饲养:包括饲养费用、饲养的难易程度、动物的麻醉、外科手术、组织样本的处理等。(4)动物的数量:每项研究必须保证有一定的动物数才具有统计学意义，否则结论是不可靠的。(5)动物的Hp接种量:每种动物对Hp的敏感性不同，所需的Hp接种量也不同。 常规用于研究Hp感染的实验动物包括小鼠、大鼠、雪貂、蒙古沙鼠、豚鼠、悉生猪等，最近，也有使用转基因小鼠和基因敲除小鼠的报道。以下对Hp感染动物模型的建立方法、几种重要的Hp感染动物模型及Hp感染动物模型在中医药研究中的应用作一综述。 1 建立Hp感染动物模型的方法 11 Hp菌株及培养用于建立Hp感染动物模型的菌株为Hp国际菌株Sydney Strain 1(SS1)。SS1含有细胞毒素相关基因(CagA)和空泡形成毒基因(vacA),2,，可采用固体或液体培养基，添加50?mg/L脱纤维冻融羊血及万古霉素10?mg/L，多粘菌素B?2?500?U/L，抗菌增效剂5?mg/L，微需氧条件(体积分数为5%?O2、8%?CO2、80%?N2)37?下孵育72?h,3,。 12 动物接种的方法小动物如大、小鼠一般采用灌胃法。将培养后的 菌体调整到适宜的浓度，禁食禁水12?h后，先灌胃05?mL NaHCO3或02?mL消炎痛(均有益于Hp的定植)，再灌胃菌液，灌胃后继续禁食禁水4?h，2, ,。大动物如感染Hp的3?d灌胃1次，连续5次，对照组灌胃生理盐水,4 恒河猴可出现持续的感染、胃炎及特异性抗体水平的升高，并能对适当的治疗作出反应，因此自然感染Hp的恒河猴亦可作为人类Hp感染的动物模型。 13 感染动物的鉴定末次灌胃后，可分别于第2、4、6、8周处死动物(大、小鼠)，处死前断食断水，取胃粘膜组织，做病理切片、粘膜涂片并分离培养。分离的Hp经三酶(尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶)实验和革兰氏染色镜检确定是否为SS1,4,。 2 几种重要的Hp感染的动物模型 21 Hp小鼠模型1997年，Lee等,2,鉴定的Hp悉尼株(SS1)被认为是小鼠接种的首选菌株，接种C57BL/6小鼠后，胃粘膜定植时间可达8个月以上，定植后缓慢出现慢性活动性胃炎、严重胃粘膜萎缩等病理变化，而5,6日龄的CD1小乳鼠接种SS1菌株后，仅获得24?h以上无差别定植。秦敏,4,的实验证明，SS1在SPF级的KM鼠上定植时间可达26周，并确定12周龄小鼠感染的较适菌量为5×108，与人类的HP感染病变具有相似性。小鼠的遗传背景明确，个体差异小，有很多品种品系，容易饲养繁殖，费用低廉，与小鼠相关的鼠免疫球蛋白、细胞类型、细胞因子等试剂较容易购买，可以更好地进行Hp感染疫苗的研究，所以目前小鼠在Hp感染的研究中是应用较多的动物。但小鼠不适合Hp感染的并发症(如溃疡、肿瘤等)的研究。 22 Hp大鼠模型常用品系为Wistar、SD大鼠。Hp在大鼠胃粘膜中群集繁殖力差，只有在大鼠胃粘膜预先存在损伤时，Hp才能感染并引起炎症反应,5,，因此，找到适合的感染菌株并增加模型的病理变化程度才是解决大鼠感染模型的关键。且长期灌胃Hp可诱导出高比例的腺胃癌，影响了乙酸性胃溃疡大鼠的溃疡自然愈合过程,6,。Hp大鼠模型对于研究Hp与胃癌的关系，筛选抗菌药物，研究Hp的致病机理及溃疡的防治等具有重要的辅助作用。 23 Hp雪貂模型雪貂胃的解剖和生理特点与人相似。雪貂螺杆菌(HM)引起雪貂胃炎与Hp感染引起人的胃炎都属于浸润性胃窦胃炎、胃体多灶性萎缩性胃炎和浅表性胃炎，而多灶性萎缩性胃炎属于癌前病变。采用Hp尿素酶和霍乱毒素(CT)佐剂制成口服疫苗，对感染HM的雪貂进行长期免疫治疗后，有一定的治疗效果。雪貂对癌诱导剂敏感，可口服给药，是研究Hp致癌机制、药物治疗与筛选、疗效评价和免疫治疗效果的有价值的模型,7,。 24 Hp蒙古沙鼠模型1981年日本学者Yokota等首先用CagA阳性Hp菌株人工感染杂交蒙古沙鼠品系，可使沙鼠出现胃炎症状，症状比C57BL/6、BALB/C等品系的小鼠要明显得多,8,。Sawada等,9,证明，用Hp人工感染沙鼠后所观察到的抗体应答变化与人Hp感染后的抗体应答变化相同，CagA阳性菌对动物的感染率远远高于CagA阴性菌。Hp感染沙鼠后，依次出现急性胃炎、慢性胃炎、十二指肠溃疡，类似人感染Hp后组织的病理演变过程。而且沙鼠的胃容量比小鼠大，适宜直接进行组织学检查，因此虽然沙鼠存在好斗、繁殖困难、数量少等缺点，但仍不失为Hp 研究中具有较好发展前景的动物模型。 25 Hp豚鼠模型豚鼠体内不能合成维生素C。而维生素C的重要成分抗坏血酸可抑制具有强烈致癌作用的亚硝胺的形成。另外，从免疫学角度讲，豚鼠的胃能分泌IL8同源物，而Hp重要的致病作用特性之一就是诱导胃组织分泌IL8，诱发以嗜中性白细胞为主的细胞浸润性胃炎病变,10,。因此，Hp人工感染豚鼠模型在模拟人Hp感染时更接近人的自然感染状态，对于研究人感染Hp后相关疾病的发生、发展以及研究维生素C在其中的作用是一种理想的动物模型。缺点是豚鼠对饲养环境要求很高，不易饲养和繁殖，死亡率较高。 26 转基因动物模型1995年Falk等用FVB/N转基因小鼠从分子水平探讨Hp的致病机制,11,。Syder用缺乏壁细胞的转基因小鼠研究Hp感染与壁细胞泌酸作用的关系,12,。Lewis抗原是Hp的主要致病原因之一，Hp一旦穿过粘液层，其表达的粘附蛋白BabA就会与胃上皮表达的Lewis血型抗原结合，使Hp紧紧地粘附在上皮细胞上而致病。表达人类Lewis抗原的转基因小鼠与野生型小鼠比较，Hp都能定植，但转基因小鼠能产生抗壁细胞的自身抗体，破坏壁细胞，使胃粘膜萎缩而发生萎缩性胃炎，能用来证明粘附蛋白的致病性,13,。 27 小型猪动物模型Eaton,14,在1989年首次建立了悉生猪(无菌猪)Hp模型，但技术复杂，价格昂贵，推广困难。1997年孙桂华,15,等用中国1号小型猪剖腹取胎所得到的悉生乳猪成功地建立了Hp感染的动物模型，找到了一种比较理想、经济的对Hp易感的动物。实验证明，小型猪Hp感染诱导的慢性胃炎类似于儿童自然感染Hp后的胃炎，持续时 间可达22个月以上。此外，小型猪对Hp抗生素治疗比人类敏感，因此可用于治疗Hp抗生素的疗效鉴定及药物评价。 3 Hp感染动物模型在中医药研究中的应用 31 用于脾虚证Hp感染的研究中医理论认为:Hp属“邪气”，且具有“毒”的性质，“邪之所凑，其气必虚”，“百病皆由脾胃衰而生也”。在邪气入侵、脾胃虚弱基础上形成的气滞、血瘀、郁热、湿阻等病理变化为Hp附着、繁殖、致病提供了客观条件。因此，复制脾虚证Hp感染的动物模型，从理论上说是可行的。通常的方法是采用寒冷、饥饿或大黄等药物先造成动物脾虚，再灌胃Hp菌液。如厉兰娜,16,的脾虚证大鼠Hp感染模型、杨俊,17,的脾虚蒙古沙土鼠Hp感染模型等。 脾虚证Hp感染动物模型复制成败的关键在于“脾虚”症状的确定。但在中医证候动物模型的研究领域，“脾虚症状”一直没有化的指标,18,，目前只是把动物出现竖毛、拱背、活动减少、便溏等症状认为是“脾虚”，无法知道动物的具体感受(主述)是什么，而其他因素是否也可导致动物出现上述症状，我们无从知道。因此，对脾虚证Hp感染动物模型标准化的研究还需进一步深入。 32 用于中药研究Hp感染的动物模型可用于中药的研究。中药抗Hp感染既可以直接抑菌，还有可能通过整体调节机体免疫力来抗Hp。刘波,19,对5味中药、姜成,20,对13味中药的实验证明，黄连的杀菌效果最强，当药物浓度为50?mg・mL-1时，杀菌率达998%。王印光等,21,发现Hp感染阳性率在脾胃湿热、脾胃不和、脾胃阴虚等证中出现递减的规律。证明在Hp相关性消化性溃疡中湿热证占多数。 中医从整体出发，通过多环节、多途径治疗Hp感染。近年来，Hp相关 性胃病的中医药治疗研究取得很大进展，针对Hp感染的单方及复方进行 了大量的实验及临床研究。但该方面研究多注重于中药对Hp转阴和病理 形态的改善，对Hp感染和胃酸分泌的关系及对Hp感染者的餐后胃泌素显 著增高等方面的研究较少，从细胞分子水平深入研究中医药对Hp毒力及 形态学变异的影响则更少，还需进一步探索。 参考文献: ,1,李健，吴丽莉，冯常炜，等(幽门螺杆菌发现简史,J,(中华医 史杂志，1994，4:203( ,2,Lee A，Rourke J O，Corazon M，et al(A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection introducing the Sydney strain ,J,(Gastroenterology，1997，112:1386( ,3,Jone N L，Shabib，Sherman P M，et al(Capsaicin as an inhibitor of the growth of the grastric pathogen Hp ,J,(FEMS Microbiol Lett， 1997，146:223( ,4,秦敏，杨宗新，涂小平，等(幽门螺杆菌动物感染模型的建立及 较适感染剂量的确定,J,(微生物学免疫学进展，2002，10(1):18( ,5,Ross J S，Bui H X，Del Rosario A，et al(Helicobacter pylori: Its role in the pathogenesis of peptic ulcer disease in a new animal model,J,(Am J Pathol，1992，141(3):721( ,6,李铁，于吉人，冈部进，等(幽门螺杆菌感染对延缓诱导大鼠胃 溃疡愈合的实验研究,J,(中国应用生理学杂志，1998，14(2):180( ,7,Fox J G，Wishnok J S，Murphy J C，et al(MNNG induced gastric carcinoma in ferrets infected with Helicobacter mustelae ):1957( ,J,(Carcinogenesis，1993，14(9 ,8,Newell D G(Human antibody responses to the surface protein antigens of Campylobacter pyloridis ,J,(Serodiagn Immunother， 1997，1:209( ,9,Sawada Y，Yamamoto N，Sakagami T，et al(Comparison of pathologic changes in Helicobacter pyloriinfected Mongolian gerbils and humans,J,(J Gastroenterol，1999，11:55( ,10,Yoshimura T，Johnson D G(cDNA cloning and expression of guinea pig neutrophil attractant protein1(NAP1)(NAP1 is highly conserved in guinea pig ,J,(Immunology，1993，151:6255( ,11,Novak M J，Smythies L E，MePherson S A，et al(Poliovirus replicons encoding the B subunit of Helicobacter pylori urease elicit a Th1 associated immune response,J,(Vaccine，1999，14， 17(19):2384( ,12,Chen W，Shu D，Chadwick V S( Helicobacter pylori infection in interleukin4deficient and transgenic mice,J,(Scand J Gastroenterol，1999，34(10):987( ,13,Guruge J L，Falk P G，Lorenz R G，et al(Epithelial attachment alters the outcome of HP infection ,J,( Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95:3925( ,14,Eaton K A， Morgan D R， Krakowka S(Campylobacter pylori virulence factors in gnotobiotic piglets,J,(Infect Immun，1989，57:1119( ,15,孙桂华，宋鸿，黄小让，等(中国1号小型猪建立幽门螺杆菌相关性胃炎模型,J,(新消化病学杂志，1997，5:767( ,16,厉兰娜，孔繁智，李端阳，等(脾虚证大鼠幽门螺杆菌感染模型的实验研究,J,(北京实验动物科学与管理，1994，11(3):14( ,17,杨俊，王亚东，何剑平，等(脾虚蒙古沙土鼠感染幽门螺杆菌动物模型的建立,J,(中国中西医结合消化杂志，2003，11(4):218( ,18,陈小野，武晓东，蔡永春，等(脾虚证动物模型规范的初步探讨,J,(中国中医药信息杂志，1998，5(12):7( ,19,刘波，李雪驼，徐和利，等(5种中药制剂杀灭幽门螺杆菌的实 ,(中国新药杂志，2002，11(6):457( 验研究,J ,20,姜成(15味中药抑制幽门螺杆菌的体外实验,J,(福建中医药学报，2003，13(6):30( ,21,王印光，姚德才，王洪京，等(灭幽愈溃合剂治疗幽门螺杆菌相关性溃疡实验研究,J,(山东中医杂志，2001，20(9):545(