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人巨细胞病毒对红系祖细胞的影响

2017-11-14 11页 doc 40KB 75阅读

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人巨细胞病毒对红系祖细胞的影响人巨细胞病毒对红系祖细胞的影响 陈健良 , 何政贤 , 李建英 , 李 琨 , 王清文 , 邹小兵 , 黄略峰 ()中山医科大学附属第三医院儿科 , 广东 广州 510630 ( ) ( ) 摘 要 :【目的】探讨人巨细胞病毒 HCMV对红系祖细胞 CFU2E的分化和增殖的影响 ,并初步探讨其作用机制 。【方 法】取 15 例脐血标本 ,用红系祖细胞单向半固体培养技术 ,观察 3 种不同浓度的 HCMV AD169 株对 CFU2E 集落形成的影 响 ,用 PCR 和 R T2PCR 检测集落中的 HCMV DNA 与 ...
人巨细胞病毒对红系祖细胞的影响
人巨细胞病毒对红系祖细胞的影响 陈健良 , 何政贤 , 李建英 , 李 琨 , 王清文 , 邹小兵 , 黄略峰 ()中山医科大学附属第三医院儿科 , 广东 广州 510630 ( ) ( ) 摘 要 :【目的】探讨人巨细胞病毒 HCMV对红系祖细胞 CFU2E的分化和增殖的影响 ,并初步探讨其作用机制 。【方 法】取 15 例脐血标本 ,用红系祖细胞单向半固体培养技术 ,观察 3 种不同浓度的 HCMV AD169 株对 CFU2E 集落形成的影 响 ,用 PCR 和 R T2PCR 检测集落中的 HCMV DNA 与 late mRNA 。【结果】3 个感染组的 CFU2E 均减少 ,与正常对照组比较 , ( ) 分别为 11146 % 、21188 % 、34145 % P < 0105,显示 CFU2E 集落数与 HCMV 感染浓度有关 ,病毒感染浓度越高 ,抑制程度越 大 。CFU2E 集落细胞中的 HCMV DNA 均为阳性 ,而 late mRNA 为阴性 。【结论】HCMV AD169 株可直接感染红系祖细胞 ,并抑制其分化与增殖 ,该抑制作用可出现于仅有病毒潜伏的细胞 。 关键词 : 巨细胞病毒 ; 红系祖细胞 ; 聚合酶链反应 () 文章编号 : 1000 - 257 X200005 - 0372 - 04 中图分类号 : R373 . 9 ; R551 . 3 文献标识码 : A The Eff ect of Human Cytomegal ovirus on Erythroid Progen itor CH EN J ian2liang , H E Zheng2xian , L I J ian2ying , L I Kun , WAN G Qing2wen , ZOU Xiao2bing , HUAN G L ue2feng ()Depart ment of Pediat rics , Third Affiliated Hospital , Sun Yat2sen U niversity of Medical Sciences , Guangzhou , 510630 , China Abstract :【Objective】To investigate t he effect of HCMV o n t he differentiatio n and p roliferatio n of eryt hri2 o d p ro genito r , and it s mechanism tentatively. 【Met ho ds】15 samples of co rd bloo d , wit h semi2solid CFU2E hemotopoietic p ro genito r cult ure system ,3 co ncent ratio ns of HCMV AD169 were surveyed to deter mine t he im2 pact o n t he CFU2E colo ny fo r matio n DNA and late mRNA wit h PCR and R T2PCR separetely in t he colo ny cells. 【Result s】Co mpared wit h no r mal gro up ,t he decrease of t he CFU2E colo nies in HCMV infectio n gro up s ( ) was 11146 % 、21188 % 、34145 % P < 0105 ; show n t hat CFU2E is associated wit h co ncent ratio n , t he higher t he HCMV co ncent ratio n ,t he mo re t he CFU2E colo ny decrease . HCMV DNA detect d in colo ny cells f ro m t hree viral infectio n gro up s was po sitive ,but t he test s of HCMV late mRNA were negative .【Co nclutio n】HCMV AD 169 can directly infect eryt hroid p rogenito r and supp ress it s differentiatio n and p roliferatio n . This supp ressio n may occur in t he cells o nly wit h HCMV latency. Key words : cyto megalovirus ; eryt hroid p ro genito r cells ; polymerase chain reactio n 12 ( ) HCMV 感染的主 血液系统是人巨细胞病毒 确。熊伟 、何政贤 , 等 : HCMV AD169 株 ( - 巨噬系造血祖细胞 CFU2 能直接感染人骨髓粒 要受累部位之一 。健康 HCMV 携带者骨髓造血祖 ) 细胞中可检出内源性 HCMV DNA ; 它可在敏感细 GM,并 抑 制 其 集 落 形 成 , 经 原 位 聚 合 酶 链 反 应 ( ) ISPCR方法证实 HCMV 对造血祖细胞的直接感 胞中重新激活和复制 。近年应用细胞集落形成分 染 。我们则继续进行 HCMV 对红系祖细胞影响的 析法 ,发现 HCMV 不但可直接感染造血祖细胞 ,而 探讨 。应用红系祖细胞单向半固体培养体系 ,对脐 且对其分化与增殖产生抑制作用 ,但其机制尚未明 收稿日期 :1999 - 08 - 20 ( ) ( ) 基金项目 :广东省科委 重点科技项目 96 - 25资助课 ( ) 作者简介 :陈健良 1964 - ,男 ,广州人 ,医学硕士 ,主治医生. 血单个核细胞进行培养 ,并设多个实验分组分别加 RNA 。然 后 加 入 AMV 逆 转 录 酶 、 淀 回 收 总 dN TP、逆转录酶缓冲液 、反义引物 、RNasin , 42 ? 入不同浓度的 HCMV AD169 实验株 ,观察红系祖 反应 60 min ,95 ? 5 min 灭活逆转录酶 ,完成逆转 ( ) 细胞 CFU2E集落形成和数量变化 ,拟阐明病毒对 录反应 ,合成 cDNA 第一条链 。再进行 PCR 扩增 , 红系祖细胞分化与增殖的影响 。并用 PCR 方法检 () 步骤与反应产物观察同上 方法 1 . 2 . 1。测集落细胞中的 HCMV DNA ,试图证实病毒对红 1 . 2 . 3 实验过程与结果观察 常规密度梯度法分 系祖 细 胞 的 直 接 作 用 ; 用 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 离脐血单个核细胞 。加入 EPO 、小牛血清 、巯基乙 ( () ) R T2PCR检测集落细胞中 HCMV 晚期 latemR26 醇 、甲基纤维素 ,建立红系祖细胞培养体系。以NA ,以窥视 HCMV 在红系祖细胞内的转录 、复制 - 3 - 4 - 5 10 、10 、10 3 种不同浓度的 HCMV 感染体系 活动 ,初步探讨病毒对红系祖 细 胞 影 响 的 作 用 机 ( )中的造血祖细胞 , 并设置空白和灭活病毒 mock 理 。 对照 ,共分 5 组 。37 ?,体积分数为 5 % CO,全湿 2 培养 5,7 d ,用倒置显微镜直接观察培养皿中红系 1 材料与方法 集落 ,集落细胞数达 8 个以上为 CFU2E 集落 ; 以低 倍镜对各培养皿 CFU2E 集落进行计数 ,对各组数1 . 1 材 料 据间差异进行统计学分析 。集落细胞经用 40 g/ L 1 . 1 . 1 脐血标本 15 份脐血标本由本院产房提 多聚甲醛固定后吸取到玻片上 ,常规 Wright2Giem2 供 ,取自正常足月顺产新生儿 断 脐 后 的 胎 盘 段 脐 sa 染色 , 高倍油镜 下 确 认 为 各 期 红 系 细 胞 。收 集 带 。其母亲健康 , HBsAg 阴性 。每份标本均经本实 CFU2E 集 落 细 胞 , 清 洗 2 次 后 进 行 PCR 和 R T2 验室常规 PCR 方法检测 HCMV DNA 阴性 , EL ISA PCR 检测 。 法 HCMV IgM 阴性 。 1 . 1 . 2 病 毒 HCMV AD169 株原液由中国预 2 结 果 防医学科学 院 病 毒 研 究 所 病 种 室 提 供 。滴 度 为 : - 7 ( ) 10 ml 50 %感染单位 TC ID/ mL 。50 2 . 1 各实验分组 CFU2E 集落计数 3 1 . 1 . 3 引 物 参考 Chee M 等, 针对病 15 份脐血标本进行实验 , 各实验分组 CFU2E( ) 毒复制晚期出现的主要衣壳蛋白 MCP编码基因 ( ) 集落计数表示为 : 均数 ?差 表 1。与空白对 设计的一对引物序列 :5′GT G A TC C GA C T G GGC 照组比较 ,灭活病毒组 CFU2E 集落数轻微减少 , 3 ( ) GAA AA 3′正 义, 5′GA G C GC GTC CAC AAA ( ) 个病毒感染组 CFU2E 集落数均出现不同程度的减GTC TA 3′反义。该编码基因在多个实验株和 野株 HCMV 都具有高度保守 。由中山医科大学达 少 。方差分析和各实验分组间两两比较结果显示 :安基因诊断中心合成 ,并作 PA GE 纯化 。 灭活病毒组 CFU2E 集落数与空白对照组差别无统 1 . 2 方 法计学意义 ,各病毒感染组间及其与空白对照组 、灭 活病毒组间的差别均有统计学意义 。与灭活病毒4 1 . 2 . 1 PCR 检测细胞经裂解液处理后 ,按苯 组作比较 , 3 个病毒感染组的 CFU2E 集落减少程 度依次为 11146 % 、21188 % 、34145 % ,其中病毒感 酚 - 氯仿 - 异戊醇提取方法进行两次 DNA 提取 。 染浓度较高组 ,减少程度较大 。 加入 T aq DNA 聚合酶 、PCR 缓冲液 、正义引物 、反 义引物 。变性 94 ? 1 min ,退火 60 ? 1 min ,引物 延伸 72 ? 1 min 。共 40 个循环 ,末次循环引物延表 1 HCMV 对 CFU2E 集落形成的影响 ()Table 1 Effect of HCMV on CFU2E colony formation CFU 伸延长至 10 min 。反应产物在含溴化乙锭的 30 g/ L 琼脂糖凝胶中电泳 ,紫外灯下观察 , 产物长度为 Group s Range ?x ?s 263 bp 。Co nt rol ,2 538 ?466 . 7 9301 582 . 7 4 ,51 002,2 385 1 535 . 5 ?410 . 3 1 . 2 . 2 R T2PCR 检测 首先用异硫氰酸/ 酸酚 Mock 896,2 103 1 359 . 5 ?369 . 8 - 5 一步法取细胞总 RNA : 有核细胞在匀浆过程中被 10 HCMV 886,1 930 1 199 . 5 ?329 . 0 - 4 变性液破膜 、溶解 ,变性液中有抑制 RNase 活性的 10 HCMV 740,1 614 1 006 . 5 ?297 . 1 - 3 10 HCMV 作用 ,并溶解蛋白质和核酸 ; 经酸酚 - 氯仿将 RNA 抽提至水相 ,与 DNA 和蛋白质分离后 ,经异丙醇沉 2 . 2 CFU2E 集落细胞 PCR 检测 病毒感染组显示一条特定分子量 DNA 片段的 3 讨 论 条带 ,长度为 263 bp ,与所设计引物应扩增的 DNA 片段的长度一致 , 表明集落细胞中存在着 HCMV 3 . 1 HCM V 对红系祖细胞分化 、增殖的影响 DNA ;而空 白 对 照 组 、灭 活 病 毒 组 未 出 现 HCMV 根据细胞集落分析法原理 ,每个细胞集落均由 () DNA 的特异扩增条带 图 1。一个祖细胞分化增殖而成 。实验结果显示 :病毒感 染组 CFU2E 的集落形成均出现不同程度的减少 , 表明 : HCMV AD169 实验株对脐血红系祖细胞分 化增殖具有抑制作用 。 多个研究小组曾观察到 HCMV 对早期红系祖 () 细胞 Brust Fo r ming U nit2Eryt hroid ,B FU2E有 抑 制作用 , 仅 有 个 别 报 告 对 CFU2E 亦 有 抑 制 作 用 。 7 Mac Kinto sh FR , 等报 告 HCMV AD169 株 和 临 床分离株对人 B FU2E 明显抑制 ,而 CFU2E 未受影 响 。本实验结果表明 : HCMV AD169 实验株对脐 血 CFU2E 具有抑制作用 。可能是造血祖细胞来源 不同 。有研究报告认为脐血造血祖细胞较骨髓造 8 图 1 CFU2E 集落细胞中 HCM V D NA PCR 检测结果 血祖细胞更原始 ,具有更强的扩增潜能,对促红 9 Fig. 1 Detection by PCR of HCM V D NA in 细胞生成素更敏感; 因此 ,体系中对促红细胞生 CFU2E colony cells ( ) 成素 EPO敏感的红系祖细胞分化和增殖相对活 - 5 (L ane 1 DNA ladder ; lane 2 10 HCMV ; lane 3 mock ; lane 4 跃 ,使 HCMV 对其抑制的效应较显著 。 )co nt rol ; lane 5 HCMV co nt rol 体系 中 CFU2E 集 落 形 成 的 受 抑 制 程 度 为 11146 %, 34145 % , 抑 制 程 度 与 病 毒 感 染 浓 度 有 2 . 3 CFU2E 集落细胞 RT2PCR 检测 关 ,病毒感染浓度越高 ,抑制程度越大 。其他研究 各病毒感染组均未出现 HCMV cDNA 的扩增 5 ,7 中也有类似结果,但其相关关系的研究需要更条带 ,表明集落细胞中无 HCMV 晚期转录 。作为 详细的感染浓度分组和数据 分 析 , 目 前 尚 未 见 报 阳性对 照 , 受 HCMV 感 染 人 胚 肺 成 纤 维 细 胞 的 道 。 RNA 提取物可扩增出长度为 263 bp 的 HCMV 特 HCMV 症状性感染常有贫血 。本研究和其他 ( 异性 cDNA 片段 ,该细胞中存在病毒转录 图 体外研究结果提示 : 除溶血性因素外 ,红系祖细胞 ) 2。 分化 、增殖受到抑制而导致的 成 熟 红 细 胞 生 成 减 少 ,可能是贫血的另一重要因素 。 3 . 2 HCM V 对红系祖细胞的直接感染 应用 PCR 方法检测病毒感染组红系集落细胞 HCMV DNA 均为阳性 , 表明 HCMV 可直 接 感 染 红系祖细胞 ,而且经历分化增殖后的子代细胞中仍 存在着该病毒 DNA 。 图 2 CFU2E 集落细胞中的 HCM V late m RNA 本实验中对红系集落细胞的 R T2PCR 检测结 RT2PCR 检测结果果均为阴性 ,表明红系集落细胞中没有 HCMV 的 晚期转录和复制 ,病毒处于潜伏状态 。其原因可能 Fig. 2 Detection by RT2PCR of HCM V late m RNA 是 : ?受检测的红系集落细胞已充分分化 、增殖 ,接 in CFU2E colony cells - 3 近成熟 ,包括病毒在内的 DNA 转录活动已基本停 (L ane l DNA ladder ; lane 2 PCR o n RNA f ro m 10 HCMV ; - 3 lane 3 R T2PCR o n RNA f ro m 10 HCMV ; lane 4 PCR o n RNA f ro m - 3 - 3( ) 10 HCMV liquid cult ure ; lane 5 R T2PCR o n RNA f ro m 10 () HCMV liquid cult ure; lane 6 R T2PCR o n RNA f ro m HCMV2infected () HEF fibro blast po sitive co nt rol; lane 7 PCR o n RNA f ro m HCMV2 5 止 。Movassagh M , 等 研究发现 : HCMV 在造血 infected HEF fibro blast ; lane 8 PCR o n DNA f ro m HCMV2infected 34 + )祖细胞中的晚期转录仅限于带有抗原 CD的较HEF fibro blast 4526 . 原始造血祖细胞 。有研究认为 HCMV 只在造血祖 熊 伟 ,何政贤 ,王清文 ,等 . 巨细胞病毒对人骨髓粒2 2 细胞分化时才出现病毒转录和复制 。 ?HCMV 直 巨噬 系 组 细 胞 生 长 的 影 响 J . 中 华 血 液 学 杂 志 , 接感染红系祖细胞后 ,仅在其中潜伏 ,或成为顿挫 () 1999 ,20 3:143 . 1 性感染 ,不出现产毒性复制。 3 Chess M , Rudol p h S2A , Plachter B , et al . Identificatio n 3 . 3 HCM V 抑制红系祖细胞分化增殖作用机制of t he major cap sid p rotein gene of human cy2 以上已阐明 HCMV 对红系祖细胞的直接感染 () to megalovirusJ . J Virol ,1989 ,63 3:1345 . . 和抑制 ,但未发现转录 、复制活动 ,说明该抑制作用 4 王申五主编 . 基因诊断技术 - 非放射性操作手册 M . 北京 :北京医科大学中国协和医科大学联合出版 社 . 可出现于仅有病毒潜伏的细胞 。因此推测 : HCMV 1993 . 166,174 . 对造血祖细胞的抑制出现于病毒感染后和病毒蛋 5 Movassa gh M , Gozlan J , Senechal B , et al . Direct infec2 白质合成之前 ,可能与造血祖细胞对病毒被膜蛋白 34 + tion of CDprogenitor cells by human cytomegalovirus :ev2 () 如 pp 65 、pp 71 、pp 150 等的吸收和处理有关 ,并干 idence for inhibitio n of hematopoiesis and virus replicatio n 扰和阻碍造血祖细胞的正常新陈代谢 ,或减低其对 () J . Blood ,1996 ,88 4:1277 . () 细胞因子 如 EPO 等的效应 ,使细胞分化 、增殖活 6 葛忠良 . 造血细胞的培养和测定技术 M . 见 : 杨景山 1 动被抑制。 主编. 医学细胞化学与细胞生物技术 . 北京 :北京医科 间接作用机制可包括 : HCMV 可通过感染和大学中国协和医科大学联合出版社. 1990 . 282,322 . 抑制参与机体造血的骨髓基 质 细 胞 、或 调 节 细 胞 7 Mac Kintosh F R ,Adlish J , Hall S W , et al . Supp ressio n ( ) T 淋巴细胞 、单核细胞,或使机体对受感染细胞 of normal human hematopoiesis by cyto megalovirus in 产生特异性免疫反应 ,导致造血祖细胞及相关细胞 () vit ro J . Ex p Hematol ,1993 ,21 2:243 . 7 ,10 黄绍良 ,李文益 ,侯玲玉 , 等 . 人胎盘粒单系和红系祖 被抑制或破坏。本实验体系中仅加入来自正 8 常新生儿脐血的单个核细胞 ,可包括 T 淋巴细胞 、 细胞体外 培 养 观 察 J . 中 国 实 用 儿 科 杂 志 , 1994 , 9 () 4:225 . 单核细胞和血管内皮细胞 ,但不含骨髓基质细胞和 9 尹振尧 ,王 瑜 ,郭瑞清 . 脐血造血祖细胞培养及细胞 特异性免疫细胞 ,可能存在调节细胞参与对红系祖 () 周期的研究 J . 中华血液学杂志 ,1994 ,15 4:181 . 细胞的抑制 ,但有待进一步证实 。 10 Busch F W ,Mut ter W , Koszinowski U H , et al . Rescue of myeloid lineage2co mmit ted p rep rogenitor cells f ro m cy2 参考文献 : to megalovirus 2infected bo ne marrow st ro ma J . J Virol , () 1991 ,65 2:981 . 1 Sindre H , Tjo nnfjord G E , Rollag H , et al . Human cy2 to megalovirus supp ressio n of and latency in early () 编辑 关淡庄( ) hematopoietic p rogenitor cellsJ . Blood ,1996 ,88 12: ()上接第 359 页 3 Mulder J W R , Kruyt P M , Sewnat h M , et al . Colorec2 associatio n wit h good p rognosis J . J Natl Cancer Inst , tal cancer p rognosis and exp ressio n of exo n2v6 co ntaining () 1991 ,83 4:281 . () CD44 p roteinsJ . L ancet ,1994 ,344 8935:1470 . et al . Exp ressio n of hu2 6 Yama guchi A , U rano T , Goi T , 4 Kainz C H , Ko hlber ger P , Sliutz G , et al . Splice variant s man nm232H1 and nm232H2 p rotein in hepatocellular car2 of CD44 in human cervical cancer stage ?B to ?B J . G y2 () cino ma J . Cancer ,1994 ,73 9:2280 . () necol Oncol ,1995 ,57 3:383 . 5 Henness y C , Henry J A , May F E B , et al . Exp ressio n of () 编辑 黄小延 t he antimetastatic gene nm23 in human breast cancer and
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