大熊猫犬冠状病毒感染幼犬组织病理学研究

大熊猫犬冠状病毒感染幼犬组织病理学研究 第六次全国会员代表大会暨第,,攻学术研讨会 ,讨论 ,(,上海地区对宠物准养犬使用进口七联苗进行狂犬病的强制免疫，从表,我们可以看到，上海地区 准养犬类强制免疫效果显著。狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎的免疫抗体阳性率均达到较 高水平，对危害犬类健康的主要传染病有较强的抵抗力，从而对防止犬类疫病的传播起到了良好的控制作 用。近几年上海地区亦有狂犬病的病例报道，但发病犬均为无证犬，未进行有效的疫苗免疫。 ,(,目前本市狂犬病免疫采取的是,月龄首免，,月龄二免，每年加强免疫,针的免疫程序【，】。从近 几年的检测结果来看，该免疫程序相对是科学、合理的，疫苗质量、免疫操作过关(免疫效果确实。故希 望广大宠物饲养者能及时为您的爱犬办理准养证，并按时到指定的免疫点进行有效的免疫，以保证其疫苗 来源可靠，免疫程序科学，从而确保犬只的狂犬病抗体维持在较高水平上。在此基础上(我们也针对狂犬 病的免疫程序作进一步研究，将免疫时间细化到犬的日龄，从而排除母源抗体干扰，真正做到免疫程序的:科学、合理。 ( ,(,布氏杆菌病是人畜共患传染病，牛、羊、猪、鹿、犬等多种动物均易感，而且严重威胁人类健康 删。由于上海地区执行严格的奶牛布病、结核病两病检疫(近几年奶牛布病仟,性率始终保持在,,。从,,,, 年始，对准养犬进行布病监测。其感染率也连续,年保持在,,，证明上海地区本病处于稳定控制状态。但 由于上海存在流动人口数量众多、畜禽及畜禽产品大量输入等特点，仍需加强对本病的监控。 ,，, 弓形体病是由刚地弓形体引起的一种人畜共患寄生虫病，流行病学调查结果显示，孕妇弓形体抗 体阳性者与家养宠物有密切关系。,,,,年,月(周红芳等,,对本市卢湾区,所医院调查,,,例孕妇，弓形 体抗体检测阳性率为,(,,,。我们从近两年的监测结果来看，犬类弓形体病的阳性感染率己从,,,,年的 ,,下降到今年的,(,,,。这主要有三方面原因，一是犬类防疫部门定期发放驱除寄生虫的药物，有效控制 了犬弓形体病等内寄生虫病的感染率，同时体外寄生虫的驱除也有效提高了犬类的机体免疫力。二是人们 预防人畜共患病意识逐步提高，宠物饲养的环境有了明显改善。三是对宠物犬主要疫病的监测力度不断加 强(针对感染犬进行了及时的治疗和净化。 参考文献略 大熊猫犬冠状病毒感染幼犬组织病理学研究 胡桂学，逄博，王龙涛 (吉林农业大学动物科学技术学院，长春,,,, ,,) 摘要:将大熊猫犬冠状病毒(,,, ,,,,)和犬冠状病毒,,—,,株人工感染初生幼犬，两组接毒幼犬出 现相同的临床症状，并在,天内陆续全部死亡，呈现出相同的剖检变化和病理组织变化。用大熊猫犬冠状 病毒荧光抗体(,,, ,,,,,,,)染色死亡幼犬小肠、肝脏和脾脏的冰冻切片，结果在以上脏器中均检测 到了含有荧光的细胞。由此说明，,,, ,,,,在幼犬体内定植并复制，侵害机体相应的组织。 关键词:大熊猫;犬冠状病毒;幼犬;病理组织学 大熊猫(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,)是世界的珍稀动物。,,,,年世界野生动物基金会(,,,) 宣布，大熊猫为世界,,种濒危物种之一,(,(，,,。患病死亡是大熊猫数量减少、种群濒危的重要原因之一(其 中病毒性疾病对大熊猫的危害较大。犬冠状病毒(,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)是引起犬急性胃肠炎的重要病 原之一，既可单独致病，又可与多种病原混合感染，呈急性胃肠炎综合征。临床上表现为剧烈的呕吐、腹 泻，是当前危害养犬业较大的疫病之一, ,(,,,,年,月。重庆某动物园,只大熊猫发病，经强心、补液和 抗菌消炎等 治疗措施，收效甚微，于,月,,日两只,,岁的大熊猫相继死亡。胡桂学等人利用犬肾传代细 ,,,, 第六次全国会员代表大会暨第, ,扶学术研讨会胞从送检的死亡大熊猫肝、脾等病料中分离获得了,株病毒。通过普通病毒学和分子生物学的鉴定和分析比较证明，该株病毒为犬冠状病毒(,,,)。命名为,,, ,,,,,,，,，,,。为了阐明,,, ,,,,在大熊猫死亡中所起的作用，进行了如下实验。,材料与方法,(,病毒 大熊猫犬冠状病毒(,,,,,,,)与源自美国的犬冠状病毒,,(,,株(,,,,,,,,,)，均由吉林农业大学预防兽医教研室保存。,(,大熊猫犬冠状病毒荧光抗体(,,, ,,,,,,,) 经鉴定并由吉林农业大学预防兽医教研室保存。,(,实验动物与病毒接种 选取出生后即与母犬隔离，不喂母乳的,日龄幼犬,只，人工饲喂灭菌牛乳。将幼犬随机分成,组，接种,,,,,,,为攻毒组，,只幼犬(分别称为,，、,,和,,:感染,,,,,(,,为阳性组，,只幼犬，称为,,、,,和,,;另设,只接种,,,,细胞冻融液的阴性对照幼犬,只，称为,。接毒后观察记录幼犬的体温变化和临床发病情况。,(,实验动物的剖检及样品的采集 剖杀各组死亡的幼犬并观察比较其剖检变化，同时采取幼犬的小肠、肝脏和脾脏(其中一部分于,,,甲醛中固定，另一部分冰冻备用。,(,病理组织变化的观察 将经甲醛固定的脏器，按文献〔,】方法制作成石蜡切片，普通光学显微镜下观察病理组织变化。,(,荧光抗体染色观察 将冰冻的脏器，按文献【,】方法(制成冰冻切片。固定后经,,, ,,,,,,,染色，荧光显微镜下观察。,结果,(,幼犬感染 ,、,两组幼犬在口服接毒后出现相同的临床表现:嗜睡、厌食、呕吐出未消化的牛乳;怕冷、常集堆以取暖，被毛略蓬松，少有光,军:排出黄色、黄白色水样或粘稠粥样粪便，其中有大量未消化的芝麻粒大小的自色的奶粒，有时会夹杂有血样黏液，恶臭;排泄物粘住肛门周围的被毛而使肛门周围不净，同时造成幼犬排便困难。对照幼犬,，临床表现正常。,(,剖捡变化 ,、,两组幼犬在,天内全部死亡(,组幼犬正常)。死亡顺序为,，、,,、,,、,,、,,、,,。主要剖检变化为:小肠呈急性卡他性肠炎，甚至有出血性肠炎经过。剪开肠壁，小肠内充满灰白色或黄绿色恶臭液体，肠管扩张臌气，肠壁菲薄呈半透明状，树枝样分布的血管清晰可见。出血性肠炎者在肠腔中有多量深红色粘稠液体;肝脏、心脏和肾脏稍肿大，切面中有深红色血液流出;脾的切面流出深红色血液;肺脏分布有灰白色或灰红色炎性病灶，病灶区质地稍变坚实(切面平整。大脑表面和切面可见到比健时清晰的血管网络。,(,病理组织变化 以;组幼犬的石蜡切片为对照，观察,、,两组幼犬的石蜡切片，呈现出相同的病理变化:,(,(,小肠:主要呈急性卡他性肠炎病变。小肠绒毛萎缩，小肠黏膜上皮细胞多量坏死脱落(图,箭头,)。固有层中毛细血管扩张充血并有炎性细胞浸润(图,箭头,略)。隐寓处腺体上皮细胞增生，数量增多(图,箭头,略)。,(,(,肝脏:肝淤血严重，肝细胞形态较完整。中央静脉扩张充血，窦状隙毛细血管扩张充血出血，见图,略。箭头所指即为窦状隙中扩张的毛细血管及其中大量的血细胞。,(,(,脾:脾窦充血并伴有少量炎性细胞浸润。图,箭头所指为脾窦中充满的血细胞。,(,荧光抗体染色结果 图,至,,为接种,,, ,,,,幼犬小肠、肝和脾冰冻切片的荧光染色照片。由图可见(荧光只着染细胞浆，胞核呈较暗的阴影，被染细胞有的轮廓较清晰，有的细胞形态不规则，有些细胞形态不完整;荧光在 ,,,, 第六旋全国会员代表大会暨 第, ,次学术研讨会细胞浆中呈连续性或局灶性分布。,(,(,小肠荧光染色结果:荧光主要分布于小肠绒毛固有层中的网状纤维和成纤维细胞，及其中游走的少量淋巴细胞中。图,为小肠绒毛的放大图象，箭头所指为分布有荧光抗体的一群细胞。图,箭头所指明亮的黄绿色荧光，主要分布于小肠壁增生的隐窝腺体上皮细胞的细胞浆中。含有荧光的细胞分布较有规律，且数量较多。,(,(,肝脏荧光染色结果:在肝切片的放大图中，荧光主要分布在门管区小叶问静脉的内皮细胞和周围的成纤维细胞中。图,箭头,所指的分布有荧光的细胞，为小叶问静脉的内皮细胞，箭头,指示为周围的成纤维细胞。,(,(,脾脏荧光染色结果:图,,箭头,所指，为分布有荧光小梁及小梁静脉血管内皮细胞。箭头,和,所指的荧光分布在小梁周围的少垣成纤维细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的细胞浆中。 。,讨论 ,(,通过荧光抗体的检测，荧光位于肠、肝和脾的血管内皮细胞、结缔组织和间质的细胞浆中，说明病毒易于侵害此处的细胞并在其中定植增殖。在各器官中这些被感染的组织虽然不是实质性组织，但却是器官中非常重要组成部分。它们互相配合，负责实质细胞、组织的营养供给和代谢产物的输出。如果这些组织被病毒侵害(整个器官的养料输入和代谢就要山现障碍(表现出特异的胃肠炎脱水症状。 从上述实验结果推测，大熊猫犬冠状病毒易于感染机体脏器的实质支持组织及细胞，严重影响了机体的营养吸收和代谢循环，这不仅加剧了大熊猫犬冠状病毒对动物本身的进一步感染，而且因此降低了机体的健康水平，从而破坏了机体的防御能力，使动物易于受到其他微生物的侵袭。这可能是犬冠状病毒病常与其它一些传染病协同发生的缘故。 ,(,石蜡切片和荧光染色切片的结果基本一致。石蜡切片病理变化显示，各脏器土耍呈急性的充血、山血性变化。荧光抗体染冰冻切片中。荧光主要集中分布在血管内皮细胞及周围的成纤维细胞和炎性细胞的细胞浆中(可以推断病毒侵害这些细胞后，在其中定植并大量复制，被侵害的血管内皮细胞通透性增加(甚至有些血管内皮细胞破裂，造成静脉血管中的血细胞进入到毛细血管及组织间隙中，就形成了肝脏的窦状隙的淤血，脾窦的扩张充血等病理变化。如果病毒侵害炎性细胞，炎性细胞会释放炎性介质，将会加强这种通透作用，从而加剧该病毒产生的致病作用。 ,(,与毒株,,, ,,一,,相比(本实验攻毒组使用的,,, ,,,,使实验动物更快发病并死亡，并且该株病毒使实验幼犬全部死亡，推测它可能是,株强毒株，具有较强的致病性。小肠、肝、脾的石蜡切片及应用特异性荧光抗体染色的结果显示，病毒确实侵害相应的组织，并在其中增殖，破坏动物机体的平衡，最终导致幼犬死亡( ,(,大熊猫死亡与,,,,,,,感染有十分密切的关系。用荧光抗体可以检测到,,, ,,,,在幼犬肠组织固有层、脾小梁和肝小叶问静脉周围的成纤维细胞、血管内皮细胞及其中游走的淋巴细胞中增殖。由此可以推断，当此株病毒侵害了上述组织和细胞时，不仅病毒本身给相应组织器官造成损害，而且它使机体正常物质供给和代谢发生异常，造成营养物质不易吸收和肠道脱水等，降低了机体的健康水平和防御能力(为其它病原的入侵提供了条件。 从大熊猫体内发现了另一株病毒，即犬瘟热病毒(,,,),,,,，很可能就是此时入侵机体，与,,,,,,,协同作用，加重了大熊猫的病情。正是在,,, ,,,,与,,,的反复作用，大熊猫的病情愈加严重，引起继发感染，在多种致病囚素联合作用下导致大熊猫死亡。本研究揭示，,,, ,,,,可能是大熊猫死亡的原因之一，至少是起到重要的协调作用。当然，两种病毒协同作用的致病机理，需要 进一步深入研究。参考文献略,,,,