残次龙须菜多糖及其降解物降血糖作用研究（可编辑）

残次龙须菜多糖及其降解物降血糖作用研究（可编辑） 汕 头 大 学 硕 士 学 位 论 文 题 目:残次龙须菜多糖及其降解物降血糖作用的研究 英文题目: The chemical degradation of defective Gracilaria lemaneifromis polysaccharide and the protective effect on diabetic mice 姓 名: 杨拉维学 号: 10808043所在学院: 理学院导师姓名:陈美珍 专 业: 生物化学与分子生物学 入学日期: 2008 年 9 月 答辩日期:2011 年 6 月 5 日 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文 中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它机构已经发或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在论文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名: 日期:年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档,允许论文被查阅和 借阅;学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索,可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文;学校可以向国家有关部 门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分 内容。对于保密的论文,按照保密的有关规定和程序处理。 作者签名:导师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 摘要 龙须菜是粤东沿海大规模养殖的主要经济海藻,资源丰富。残次龙须菜是指采收时因 处理不当而导致变色甚至出胶的龙须菜,目前尚未利用而被废弃,造成资源浪费并污染 环境。研究表明龙须菜多糖具有许多生理活性,分子量对多糖生物活性有重大影响。本 文对残次龙须菜多糖提取条件进行优化,分析比较多糖组成结构的变化,并对多糖进行 化学降解,研究多糖抗氧化、降血糖等生理活性与分子量的关系。本论文首次开展对残 次龙须菜及其多糖的应用基础研究。 (1)采用正交实验的对残次龙须菜多糖的提取工艺进行了优化,得到的最 佳提取工艺条件为:液料比 1:80,提取温度为 90?,提取时间 5h 时,在此条件下多糖 提取得率为 25.9%。 (2)对提取的残次龙须菜多糖化学分析结果显示,该多糖平均分子量为 12万 Da, 是正品龙须菜多糖分子量的两倍,3,6-内醚半乳糖的含量为 59.2%,略高于正品龙须菜, 硫酸基含量为 8.26%,与正品龙须菜相近,残次龙须菜多糖的红外图谱与正品龙须菜多 糖基本一致。 (3)采用 Vc和 H O 反应体系产生羟自由基(?OH)对高分子量残次龙须菜多糖 2 2 进行降解。在该反应体系中多糖的降解在 2h内基本完成,降解剂浓度为 3、 5、 7、 9mmol/L 得到的 4 个降解物的平均分子量分别为 57016、46238、18836 和 14289Da;降解后硫酸 基含量基本不变;3,6-内醚半乳糖含量则呈现随降解物分子量的降低而减少的趋势;降 解物红外光谱图与原料多糖的红外光谱图基本一致,表明多糖降解后,其主体结构和关 键的活性基团没有改变。 (4)体外抗氧化实验表明不同分子量多糖均有一定程度的抗氧化能力,其中分子量 在 5~10万 Da之间抗氧化能力最强,当分子量高于 10万 Da或小于 5万 Da时,其抗氧 化能力均会降低。 (5)探讨不同分子量多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,结果表明,龙须菜多糖能 够有效的抑制α-葡萄糖苷酶的活性,其中分子量在 5~10 万 Da 之间的降解产物抑制能 力最强。提示残次龙须菜多糖降解物可以用来开发降低餐后血糖水平的保健品或药物。 ( 6)采用四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型进行降血糖作用试验,灌胃给予 200mg/kg.bw 剂量的不同分子量多糖,糖尿病小鼠的血糖浓度显著降低p0.05;血清 I TC、TG 和 LDL 含量均显著降低p0.05,血清 HDL 含量明显升高p0.05;肝脏和肾 脏组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明显增强p0.05,MDA含量明显降低p0.05; HE染色小鼠组织(胰脏,肝脏和肾脏),结果显示多糖降解物可修复糖尿病小鼠损伤的 胰脏,肝脏和肾脏。由此可知,残次龙须菜多糖降解物不仅能降低糖尿病小鼠血糖水平, 而且还能调节血脂紊乱,提高肝肾抗氧化能力,改善肝、肾等组织形态异常,对糖尿病 小鼠组织器官损伤具有一定的保护作用。根据实验结果推测多糖 可能是通过清除体内自 由基来达到修复组织器官功能,从而实现其降血糖作用。 关键词:残次龙须菜,多糖,降解物,抗氧化,α-葡萄糖苷酶,降血 糖作用II 汕头大学硕士学位论文 Abstract AbstractGracilaria lemaneiformis is the main economic seaweeds in the eastern Guangdong , rich in resources. Defective Gracilaria lemaneiformis is caused due to improper handling when the asparagus harvest, has not yet been abandoned, resulting in waste of resources and environmental pollutionIn this paper, defective Gracilaria lemaneiformis polysaccharide(DGLP) was degraded by free radical from ascorbic acid and hydrogen peroxide in combination to discuss the effect of polysaccharide molecular weigh t on the hypoglycemic,then the hypoglycemic activity of DGLP and its degraded products was examinedExtraction conditions of DGLP were obtained by the orthogonal design,while dry alage to water ratio of 1:80, temperature of 90?,time of 5 hours was the optimum,the ratio of polysaccharide to dry alage was 25.9% in this conditionDGLP was degraded by free radical from ascorbic acid and hydrogen peroxide.The reaction is mainly affected by the time and concentrations of the two reagents,The results showed that degradation reaction basically completed in 2 hours.When the concentration of ascorbic acid and hydrogen peroxide was 3、 5、 7 and 9mmol/l, the molecular weight of degradation products were 57016 、 46238、 18836and 14289Da.The sulfate contents of products basic had no changedwith reduce of molecular weight. The contents of 3,6-anhydro-galactose decreased a little with reduce of molecular weight. The infrared spectrumIR analysis showed that the mainly units composing were not changed in the degradationThe antioxidant activities of degradation products in vitro were investigated by chemical spectrometric methods.The results showed that the degradation products all have antioxidant activity,the medium molecular weigh products are more effective on antioxidant activitiesThe hypoglycemic effects of the degradation products and DGLP in alloxan-induced diabetic mice were examined. The results of hypoglycemic experiment showed the administration of the polysaccharide and its degraded products caused a significant decrease in blood glucose levels.in diabetic mice.Simultaneously,the polysaccharide and its degraded products caused a significant increase in activities of enzymic antioxidants and a decrease of III 汕头大学硕士学位论文 Abstract maleic dialdehydeMDA in diabetic mice.The tissues were stained with hematoxylin / eosin,the results showed the tissues were repairedKey words:Gracilaria lemaneiformis; polysaccharide degradation; molecular weigh; hpyerglycemic IV缩略语 bw Body weight 体重 CAT Catalase 过氧化氢酶 Da Dalton 道尔顿 Defective Gracilaria lemaneiformis DGLP 残次龙须菜多糖 Polysaccharide 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 1,1-二苯基-2-三硝 基苯 DPPH 2,2-Diphenyl-1-2,4,6-trinitrophenylhydrazyl 肼 GSH Glutathione 谷胱甘肽 GSH-Px Glutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化物酶 H&E Hematoxylin&eosin 苏木精&伊红 HDL High-density lipoprotein cholesterol 高密度脂蛋白 LDL Low-densitylipoprotein cholesterol 低密度脂蛋白 HDL High-density lipoprotein cholesterol 高密度脂蛋白 LDL Low-densitylipoprotein cholesterol 低密度脂蛋白 SOD Superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 TC Total cholesterol 总胆固醇 TG Triglyceride 甘油三酯 T/T0相对粘度 V 汕头大学硕士学位论文 目录 目录 摘要I AbstractIII 缩略语V 目录VI 第一部分 残次龙须菜多糖及降解产物的研究.1 第一章 前言1 1.1 海藻多糖生理活性研究进展.2 1.1.1抗病毒活性.2 1.1.2抗肿瘤活性.2 1.1.3抗凝血活性.3 1.1.4增强免疫力.3 1.1.5抗氧化作用和抗衰老作用.3 1.1.6降血脂和降血糖作用3 1.2几种海藻多糖的组成与结构..4 1.3藻类多糖构效关系的研究进展.4 1.4 分子量大小对多糖生理活性的影响.5 1.5 海藻多糖降解方法研究进展.5 1.5.1物理降解法.5 1.5.2 酶解法..6 1.5.3 酸解法..6 1.5.4 过氧化氢降解法.6 1.6 残次龙须菜多糖研究进展..7 1.7 本课题研究意义7 1.8本课题研究内容.7 第二章 多糖提取条件的优化研究8 2.1 材料与设备..8 2.1.1材料.8 2.1.2试剂.8 2.1.3主要仪器..8 2.2实验方法.8 2.2.1 多糖的提取8 2.2.2多糖含量的测定..9 2.2.3多糖得率的计算..9 2.2.4多糖提取条件优化研究..9 2.3 结果与分析10 2.3.1多糖含量测定曲线10 2.3.2多糖最佳提取条件正交实验结果..11 2.3.3残次龙须菜多糖与正品龙须菜多糖比较..12 2.4 讨论12 第三章 残次龙须菜多糖降解条件的研究.14 3.1 材料与设备14 3.1.1材料..14 3.1.2试剂..14 VI 汕头大学硕士学位论文 目录 3.1.3主要仪器15 3.2 实验方法.15 3.2.1 残次龙须菜多糖降解时间的选择.15 3.2.2 降解剂浓度的选择.15 3.3 结果与分析15 3.3.1 残次龙须菜降解时间的确定15 3.3.2 降解剂浓度的确定.16 3.4讨论.17 第四章 残次龙须菜多糖降解产物的化学组成及结构分析18 4.1 材料与方法18 4.1.1材料..18 4.1.2试剂..18 4.1.3仪器与设备..18 4.2 实验方法.18 4.2.1 不同分子量降解产物的制备18 4.2.2 降解产物平均分子量的测定19 4.2.3 降解产物的化学组成分析.19 4.2.4 降解产物的红外光谱分析.20 4.2 结果与分析20 4.2.1降解产物平均分子量的测定.20 4.2.2 降解产物化学组成分析..21 4.2.3 降解产物红外光谱分析..23 4.4 讨论24 第二部分 残次龙须菜多糖降解产物的生理活性研究..26 第五章 不同分子量多糖体外抗氧化活性的研究.27 5.1 材料与设备27 5.1.1材料..27 5.1.2 试剂.27 5.1.3 主要仪器..27 5.2 实验方法.27 5.2.1 不同分子量降解产物的制备27 3+ 5.2.2 多糖及其降解产物对 Fe 的还原力测定.28 5.2.3 多糖及其降解产物对羟自由基(?OH)的清除能力测定..28 5.2.4 多糖及其降解产物对 DPPH?自由基清除能力测定29 5.3 结果与分析29 3+ 5.3.1 多糖及其降解产物对 Fe 的还原能力..29 5.3.2 多糖及其降解产物对羟自由基(?OH)的清除作用.30 5.3.3 多糖及其降解物对 DPPH?自由基清除作用30 5.4 讨论31 第六章 不同分子量多糖对 α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究32 6.1 材料与设备32 6.1.1材料..32 6.1.2试剂..32 6.1.3 仪器和设备.32 6.2 实验方法.33 VII 汕头大学硕士学位论文 目录 6.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的测定33 6.2.2 多糖及降解产物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的测定..33 6.3 结果与分析33 6.3.1 多糖及降解产物对α-葡萄糖苷酶抑制作用..33 6.4 讨论34 第七章 不同分子量多糖对糖尿病小鼠的保护作用35 7.1 材料与设备.35 7.1.1 实验动物..35 7.1.2 材料与试剂.35 7.1.3 仪器设备..36 7.2 实验方法.36 7.2.1 不同分子量多糖的制备..36 7.2.2 小鼠糖尿病模型建立36 7.2.3 动物分组及给药..36 7.2.4 样本采集..36 7.2.5 生化指标分析37 7.2.6 数据处理与分析..37 7.3 实验结果.37 7.3.1 不同分子量多糖对糖尿病小鼠体重和血糖的影响37 7.3.2 不同分子量多糖对糖尿病小鼠血脂的影响38 7.3.3 不同分子量多糖对糖尿病小鼠抗氧化能力的影响39 7.4 讨论41 第八章 不同分子量多糖对糖尿病小鼠病理组织学的影响43 8.1 材料与设备43 8.1.1 实验动物..43 8.1.2 材料与试剂.43 8.1.3 仪器设备..43 8.2 实验方法.43 8.2.1 不同分子量多糖的制备43 8.2.2 糖尿病模型建立..43 8.2.3 动物分组与处理..44 8.2.4 样本采集..44 8.2.5 组织和形态学分析.44 8.3 结果与分析45 8.3.1不同分子量多糖对糖尿病小鼠胰腺组织的病理学影响..45 8.3.2 不同分子量多糖对糖尿病小鼠肝脏组织的病理学影响.46 8.3.3 不同分子量多糖对糖尿病小鼠肾脏组织的病理学影响.48 8.3.4 不同分子量多糖对糖尿病小鼠脾脏组织的病理学影响.49 8.4 结论50 结论与展望51 结论.51 展望.51 参考文献:53 致谢57 硕士期间已发表及待发表论文情况:.58 VIII 汕头大学硕士学位论文第一部分 残次龙须菜多糖及降解产物的研究 第一章 前言 龙须菜(Gracilaria Lemaneiformis)属于红藻门(Rhodophta),杉藻目(Gigartinales), 江篱科(Gracialaria Greville),是我国继海带、紫菜和裙带菜之后的第四种人工大规模养 殖的重要经济海藻,(徐永健等,2006;薛志欣等,2006),主要产于我国福建、广东、 广西和海南等省沿海。龙须菜是粤东沿海大规模养殖的主要经济海藻,年产干重 4000多 吨。龙须菜营养丰富,多糖含量占干重的 30%左右(余杰等,2006;廖兆辉等,2005)。 残次龙须菜是指采收时因处理不当而导致变色甚至出胶的残次藻体。在粤东地区,龙须 菜收获时间在每年的 3-5 月,属于霉雨季节。遇到潮湿天气,藻体难于晒干,常出现烂 条、颜色变浅,甚至出胶、腐烂,如遇上下雨天气情况就更加严重。椐估算残次龙须菜 约占龙须菜产量的 10~20%,但由于其出胶率较低,琼胶厂不予收购利用,大部分被废 弃污染了环境。 藻类多糖与其他多糖一样具有多种生理活性,诸如抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗突 变、抗氧化和增强免疫力等,因此海藻多糖已成为目前国内外海洋药物研究开发的热点 之一(谢苗等,2001;王利安,2002),龙须菜多糖属于琼胶类型,即由β-D-半乳糖和 3,6-内醚-α-L-半乳糖交替相连接的琼二糖构成的线性聚合物(Siddhanta A K et al, 1995)。据报道龙须菜多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗突变等生理活 性,而且其生理活性主要受多糖分子量、硫酸根含量等的影响(陈美珍等,2005,2010, 2010;杨文鸽等,2009;邓志峰等,1995)。 研究发现,分子量是影响多糖生物活性的一个重要因素(方积年,1986)。多糖分子 量越大,分子体积越大,越不利于多糖跨越细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。 但分子量太低,则多糖无法形成具有活性的聚合结构,从而导致多糖活性丧失。一般认 为,中等分子量的多糖,其生物活性大于高分子量及低分子量的多糖,因此,对多糖进 行适当降解可以提高其生物活性(赵婷婷等,2007)。 1汕头大学硕士学位论文1.1 海藻多糖生理活性研究进展 1.1.1 抗病毒活性 多糖的抗病毒作用己引起医药界的高度重视,尤其是硫酸多糖的抗病毒活性。自 1958 年 Girber等发现从石花菜中提取的多糖和卡拉胶具有抗流感 B和抗腮腺炎病毒活性后,科 学家们逐渐发现藻类多糖对多种病毒有着抗性。 王岳五等(2001)研究发现,甘草多糖对牛艾滋病毒、腺病毒和疱疹病毒等多种病毒 均有明显抑制作用。甘草多糖不仅可直接灭活病毒,而且可阻止病毒吸附和进入细胞,还 能诱生人全血细胞、单核细胞及扁桃体细胞产生 TFN-α和 IFN-γ。 Witvrouw(1994)从海洋红藻分离的硫酸半乳聚糖能在抑制 HIV 1 和 HIV 2引起的细 胞病变,对囊膜病毒表现出抑制作用。还可抑制其他被膜病毒,如囊膜病毒,沙粒病毒, 粘液病毒等,显示出对许多毒病原的广谱抑制活性。 李凡等(1995)从海带中提取的褐藻糖胶对脊髓灰质炎病毒 III 型、柯萨奇 B3 和 A1 型病毒、腺病毒 III型,EchoVI型病毒有明显的抑制作用。 Sutapa Mazumder等(2002) 研究了红藻皮江蓠的水提取物,发现它是一种高分子质量的硫酸化半乳聚糖,该半乳聚糖 硫酸酯有选择性抗病毒的活性,这可能是由于它能阻止病毒附着到宿主细胞上。 1.1.2 抗肿瘤活性 藻类多糖的抗肿瘤作用大致可以分为 2大类(Wattenberg LW et al,1985),一类是对肿瘤 细胞的直接作用,即多糖直接杀死了肿瘤细胞,包括对肿瘤细胞膜生化特性的作用、抗自 由基作用、诱导分化与诱导凋亡以及对肿瘤细胞超微结构的影响;第二类是作为生物免疫 反应调节剂,通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞。 陈毓强等(1997)从海带中提取了一种天然生物大分子海带多糖,是由 L-岩藻糖、 D-半乳糖等糖基组成的硫酸酯化多聚物,该多糖对小鼠肉瘤 S180 的抑制率可达 86.5%。 Ren 等(1995)从海萝属 G.tenax 中分离的海萝聚糖对艾氏腹水瘤、艾氏实体瘤、Meth-A 纤维肉瘤和 S-180 肉瘤细胞均有显著抑制作用。刘力生等(1991)研究发现,螺旋藻多糖 200 mg/kg可显著抑制小鼠体内腹水型肝癌细胞的增殖;它对肉瘤和腹水型肝癌细胞 DNA、 RNA 和蛋白质的抑制作用,在 3-24h 内均随作用时间的延长而提高;对癌细胞 DNA 合成 2汕头大学硕士学位论文的抑制作用属 DNA代谢干扰型。 1.1.3 抗凝血活性 刘力等(2002)研究了石花菜琼胶分级产物的抗凝血活性,发现其硫琼胶成分具有体 外抗凝血活性,体内可明显延长全凝血时间(CT)、凝血酶时间(TT) 、凝血酶原时间(PT)、 部分凝血活酶时间(KPTT),明显降低血浆纤维蛋白原(Fib)含量。 日本科学家在研究了绿藻门中八种硫酸多糖的抗凝血作用后发现,它们都具有依赖于 HC-II的抗凝血酶作用(hayakawa Y et al,2000)。 1.1.4 增强免疫力 周慧萍,陈琼华(1989)发现紫菜多糖(PP)有明显增强细胞免疫和体液免疫功能 的作用,如促进淋巴细胞转化;增加血清溶血素含量,增强巨噬细胞吞噬功能,并能增 强免疫器官重量。张全斌等(2003)研究坛紫菜多糖对脾细胞活性的影响,坛紫菜经热 水提取及 DEAE-纤维素层析分级得到 3个多糖组分, 3种多糖组 分都能够显著抑制紫外 线损伤的脾细胞活性,坛紫菜多糖对免疫细胞的活性具有明显的抑制作用,可能是一种 潜在的免疫抑制剂。 1.1.5 抗氧化作用和抗衰老作用 王炳岩等(1994)研究发现羊栖菜多糖能减少白血病 L615小鼠脂质过氧化物含量, 增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活力,表明海藻多糖能抑制自由基的产生和加快自 由基的清除,减少或防止羟基自由基和单线态氧的产生。唐纯青等(2001)研究表明低 剂量复合螺旋藻多糖能够提高小鼠的血清超氧化物歧化酶SOD活性,有效缓解衰老引 起的酶活性降低,显著对抗 D-半乳糖 125 mg/kg.d所致小鼠衰老。 1.1.6 降血脂和降血糖作用 王艳梅等(2003)研究表明,不同剂量的孔石莼多糖样品组均有显著的降甘油三脂作 用,中、高剂量组可显著降低血清中总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C,升高 3汕头大学硕士学位论文高密度脂蛋白胆固醇(HLD-C)。左绍远等(2000)研究螺旋藻多糖PSP能有效的降低血 -4 -6 糖,在浓度为 100×10 mg、200×10 mg 时血糖降低率分别为 23.6%和 30.1%。李福川等 (2000)也曾从海带中逐级提取出 3 种多糖能使四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖水平下降 50%-60%以上。 1.2几种海藻多糖的组成与结构 琼胶agar主要来源于红藻,是由硫酸基含量最低的中性琼脂糖(Agarose),硫酸基、 丙酮酸含量中等的酸性琼脂糖,以及硫酸基含量很高的酸性半乳聚糖连续分布组成的聚合 物。琼脂糖由(1?3)连接的 D-半乳糖和(1?4)连接的 3,6-内醚-L-半乳糖交替连接而 成。硫酸基和 3,6-内醚半乳糖一定程度上决定了琼胶的物理化学性质,以及它在食品、化 妆品和生物医学领域的用途(纪明候,1997)。 卡拉胶(Carrageenan)同琼胶一样,主要来源于红藻,是一些红藻的细胞壁多糖,主 要由一系列半乳糖分子通过糖苷键交替连接而成,包括了一个分散的结构系统(胡亚琴等, 2005)。根据 3,6-内醚半乳糖3,6-AG数量和硫酸基数量及位置不同而分为不同类型的卡 拉胶衍生物λ-,κ-,ι-型卡拉胶等。 褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan):从不同种属的褐藻,用不同方法得到的褐藻多糖硫酸酯, 其组成以岩藻糖和有机硫酸酯为主,还含有半乳糖、木糖及少量葡萄糖醛酸(Dennis.J et al, 1999),岩藻多糖主要由α(1?4)键连接的 L-岩藻糖组成(王晶,2010)。 褐藻胶(Algin)是褐藻共有的一种细胞间多糖,主要从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中 提取得到,藻胶主要由α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid) 和β-D-甘露糖醛酸(β -D-mannuronic acid)通过 1?4 糖苷键连接而成的直链多糖(韩文君,2003)。整个分子由 3种片段构成:聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronate, PM)、聚古罗糖醛酸(Poly-guluronate, PG)和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸杂合段乔奎蕴等,1989。 1.3藻类多糖构效关系的研究进展 尽管目前所发现的海洋生物活性物质很多,但其直接开发成药物的并不多。主要原因 是有些活性物质含量低,生物资源不够丰富,或活性低或毒性强。对活性低或毒性强的活 性物质,科学家根据构效关系研究的结果,以其为分子模型,通过 化学修饰结构改造,有 4汕头大学硕士学位论文效提高其生理活性或降低其毒副作用,才有可能开发出真正高效低毒的临床应用药物。在 大量相关研究的基础上,多糖的生物活性与结构之间关系逐渐明朗,构效关系的研究为药 物的开发提供了坚实的基础。大量的研究表明,藻类多糖的生理活性主要受多糖分子量、 硫酸根含量以及多糖的空间构象的影响(高小荣等,2004)。 1.4 分子量大小对多糖生理活性的影响 天然多糖常因分子量大、粘度高、溶解度低等特点制约了其临床应用。降低分子量可 能是解决这一问题的有效途径之一(乐晓桐等,2006)。 师然新等(2000)采用不同的提取和降解方法,得到不同分子量的角叉菜多糖,对其 进行小鼠肝癌 H22的抗肿瘤实验,发现角叉菜分子量适当减小可使抑瘤率升高,但分子量 太小又会使抑瘤率迅速降低,具有适中分子量的多糖能保持高的抑瘤率。张昆等(2006) 探讨了龙须菜多糖抗肿瘤活性与分子量大小的关系,结果表明随着多糖分子量的降低作用 逐渐增大,至分子量为 21587时(FGP5)抑制作用最强,当多糖继续被降解其抑制作用也 随之降低。于海燕等(2007)采用过氧化氢法降解异枝麒麟菜硫酸多糖和海带硫酸多糖, 发现降解后的低分子量多糖对草酸钙晶体生长有更强的抑制作用,使草酸钙晶体数量更 少,尺寸更小,表现预防结石的作用。 1.5 海藻多糖降解方法研究进展 1.5.1 物理降解法 物理方法主要有微波法、超声波法等。Zhou 等(2004;2005)采用密闭微波降解法对 λ-卡拉胶进行了降解,所得产物的硫酸根和总糖含量随分子量的降低而明显减少,说明随 着降解时间和压力的增加,λ-卡拉胶的结构和组成发生了变化。超声波降解多糖的降解过 程与降解程度易于控制,实验也超声波降解不会破坏多糖的结构。缺点就是低分子量 的水溶性产品收率太低,导致生产成本过高。马夏军等(2005)采用超声波辅助过氧化氢 氧化法降解麒麟菜硫酸多糖,降解得到的硫酸多糖的相对分子质量为 5000-40000,水溶性 明显增加,活性基团得以较好地保留。 5汕头大学硕士学位论文1.5.2 酶解法 酶解法是利用海藻多糖降解酶对海藻多糖进行降解制备低分子 量海藻多糖的一种生 化方法。反应条件温和,耗能低,而且酶催化具有高效性和专一性,能选择性地切断糖苷 键,可克服化学降解法存在的问题。 刘坷等(2002)将海带浆中加入纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶于酶解法提 取海带硫酸多糖,色谱分离得到分子量分别为 210、120、400和 140kD,其硫酸根含量分 别为 27.8%,29.7%,30.0%,33.2%。但是酶降解多糖成本高,且筛选酶的过程也是个比 较复杂的问题,所以在研制新药和进行工业化生产过程中是不可取的。 1.5.3 酸解法 酸性溶液能引起多糖中糖苷键的断裂,使多糖降解为低分子量片断,酸解条件不易控 制,且易引起多糖结构变化,使多糖中的硫酸根脱落,进而影响其生物活性.王长云等(2003) 用酸水解法对红藻多糖 K-卡拉胶进行降解得到低聚糖及寡糖,其平均相对分子质量 MW 在 1750-11500Da 之间,结果表明,用硫酸水解获得的低聚卡拉胶含硫酸基与原卡拉胶相 当,而用盐酸水解的含硫酸基的量则低于原卡拉胶的,用盐酸水 解有明显的脱硫酸基作用。 1.5.4 过氧化氢降解法 过氧化氢抗坏血酸降解法又叫诱导羟自由基降解法,该方法是模拟植物体内的 Fenton 反应而产生的。植物体内大量存在的抗坏血酸可以还原氧分子产生 H O ,植物体内的还原 2 2 态金属离子与产生 H O 的发生 Fenton 反应,产生羟基自由基。羟基自由基可以降解细胞 2 2 壁多糖,从而促进植物生长和果实发育(M iller J G et al,2001)。 杨钊等(2004)采用过氧化氢氧化法降解来源于褐藻胶的聚甘露糖醛酸,得到平均分 子质量为 1500Da 的褐藻胶寡糖。实验测定降解前甘露糖醛酸含量在 95%以上,降解后基 本没有变化,表明此法降解获得的寡糖保持了甘露糖醛酸的结构特点。赵婷婷等(2007) 采用过氧化氢氧化法降解坛紫菜多糖,制备了分子量分别为 50、30、13、8.2和 2.7 kD的 P1、P2、P3、P4 和 P5五种产品,P1、P2 和 P3产品的红外图谱与原料多糖的红外图谱一 致,表明这两种多糖的化学结构在降解过程中并未发生改变。 6汕头大学硕士学位论文1.6 残次龙须菜多糖研究进展据调查,残次龙须菜约占龙须菜产量的 10%以上。因此,就南澳县每年约有残次龙须 菜396吨(干重)。但琼胶厂不收购残次龙须菜,大部分被废弃,因此迫切需要开展对残 次龙须菜的综合利用技术的研究工作。 变色的残次龙须菜,其变色的主要原因是藻胆蛋白变性和叶绿素的降解,而多糖相对 较稳定,对于部分出胶的藻体,是因为藻体细胞自溶,可能更有利用多糖的提取。因此利 用残次的藻体制备多糖和开发营养保健食品是合理可行的。但目前国内外尚未开展此项研 究工作。 1.7 本课题研究意义 鉴于残次龙须菜多糖含量丰富,及其多糖属于琼胶型高分子多糖,高分子多糖难于通 过机体屏障到达细胞而发挥其生物学功能等特性,本文对残次龙须菜多糖进行降解,研究 多糖及降解产物的降血糖等生理活性,探讨多糖分子量对其生理活性的影响。其研究成果 不仅可丰富龙须菜多糖生理活性的研究,而且可为残次龙须菜的 高值化利用提供理论依 据,具有重要的理论和实际意义。 1.8本课题研究内容 本课题主要研究以下几方面的内容: 采用正交实验,优化残次龙须菜多糖的提取工艺,以提高多糖的提取利用率。 采用抗坏血酸诱导产生自由基降解残次龙须菜多糖,以相对粘度为考察指标,寻找残 次龙须菜多糖最适宜的降解条件。 通过化学分析、凝胶色谱及红外光谱,对残次龙须菜多糖及降解产物的分子量及组成 结构进行初步分析,并与正品龙须菜多糖加以比较。 探讨不同分子量的残次龙须菜多糖体外抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶抑制活性。 通过建立高血糖糖尿病小鼠模型,研究不同分子量的残次龙须菜多糖对糖尿病小鼠的 降血糖作用,缓解糖尿病并发症和对机体的保护作用,探讨其作用机制。 7汕头大学硕士学位论文第二章 多糖提取条件的优化研究 2.1 材料与设备 2.1.1 材料 残次龙须菜,由汕头大学海洋生物研究所南澳试验站提供。 2.1.2 试剂 葡萄糖(标准品),乙醇,浓硫酸,氢氧化钠,氯仿,正丁醇等均为国产分析纯。 2.1.3 主要仪器 UNICO UV2100型分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司),DK-S22型电热恒 温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),-40 ?超低温冰箱(日本 SANYO 公司), BT124S 型电子分析天平(德国 Sartorius 公司),CT5DL型日立离心机(Tokyo公司)。 2.2实验方法2.2.1 多糖的提取 将残次龙须菜用自来水冲洗干净,铺成薄层晾干表面水分,然后在 60?干燥箱中 烘干,后取出粉碎过 20目筛,保存于密封玻璃瓶中备用。 取一定量上述处理好的残次龙须菜在 100?干燥箱中进行恒重,后准确称取残次龙 须菜并用锥形瓶装好,按 1:90 加入蒸馏水后于 90?的恒温水浴中浸提 5h。浸提液于 7000rpm 中离心 10min 弃去沉淀,后将浸提液用旋转蒸发仪进行浓缩。按多糖:乙醇1:3 将无水乙醇加入到浓缩液,4?低温放置 6h,进行醇沉。取出于 7000rpm 中离心 10min 收集沉淀,后用温水溶解。于多糖液中加入 Sevege 试剂(氯仿:正丁醇 4:1,V/V) 除去多糖液中的蛋白质,按多糖:Sevege 试剂3:1 充分混匀后离心。取上清,重复上 述操作 2~3次。将糖液用透析袋装好,先用流动的水透析两天后再用蒸馏水透析一天, 将透析后的糖液进行冷冻干燥或于 4?下存放备用。冷冻干燥得到的多糖样品(简称 8汕头大学硕士学位论文DGLP),其多糖含量为 98.2%,蛋白质含量为 0.03%,用于后面的实验。 2.2.2 多糖含量的测定 总糖含量-还原糖含量 多糖含量 ×0.9×100% 样品质量 式中 0.9为转换系数 1) 总糖含量的测定-苯酚硫酸法(马莺等,2005) 葡萄糖标准溶液:准确称取预先在 105?干燥至恒重的葡萄糖AR0.1000g,用纯水 溶解并定容至 100mL,此溶液 l mL相当于 1mg葡萄糖标准溶液。 标准曲线的制作:准确称取标准葡萄糖 20mg 于 500mL 容量瓶中,加水至刻度,分 别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8及2.0mL,各以蒸馏水补至2.0mL, 然后加入 6%苯酚 1.0mL 及浓硫酸 5.0mL, 静置 10min,摇匀冷 却,室温放置 20min 后 于490nm测光密度,以2.0mL水按同样显色操作为空白,横坐标为总糖含量(??),纵 坐标为光密度值,得标准曲线。 样品总糖含量测定:取适合的待测样品液,以蒸馏补至2.0mL,以2.0mL水为空白, 同标准曲线测定方法操作。以标准曲线计算含糖量。 2) 还原糖含量的测定-DNS 法(黄建华等,2005) 标准曲线的制作:在 7 支比色管内加入 1mg/mL葡萄糖标准溶液 0.00,0.05,0.10, 0.30,0.50,0.70,1.00 mL,各补加纯水至 1 mL,加入 DNS 试剂 1 mL摇匀,置沸水 浴中加热煮沸 5 min,取出放冷后,补加纯水至 10 mL,摇匀,于 530 nm 波长下,以 1 cm 比色杯,用零管调零,测定出各管溶液的吸光度值。 2.2.3 多糖得率的计算 所得多糖的质量 多糖得率 ×100% 干藻样品的质量 2.2.4 多糖提取条件优化研究 影响多糖浸提的因素主要有浸提温度、浸提时间、料水比等(贾建会等,2002), 9汕头大学硕士学位论文针对这些因素对龙须菜多糖的提取条件 进行研究,在原有单因素实验的基础上,采用三 因素三水平进行正交实验,以除蛋白后的多糖提取得率(%)为考 察指标,优选多糖提 取的最佳条件,正交实验安排如表 1-1所示。 3 表 2-1 残次龙须菜多糖提取 L 3 正交实验表 9 因 素 水 平 数 A (时间/h) B(温度/?) C(料水比: m/v) 1 3 80 1:80 2 4 90 1:100 3 5 100 1:120 2.3 结果与分析 2.3.1 多糖含量测定标准曲线 总糖含量测定标准曲线如图 2-1。 0.7 y 0.0099x - 0.1143 0.6 2 R 0.9909 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 糖含量(μg 图 2-1 苯酚-硫酸法测定葡萄糖标准曲线 还原糖含量测定标准曲线如图2-2。 10 吸光值A490汕头大学硕士学位论文 图2-2 还原糖测定标准曲 线 代入计算得残次龙须菜多糖的含量为 29.64% 2.3.2 多糖最佳提取条件正交实验结果 3 表 2-1 正交实验结果与极差分析(L 3 ) 9 Table.2-1 Theorthogonal experiment result and analysis of range 试验号 A B C 多糖得率% 1 1 1 1 19.2 2 1 2 2 19.9 3 1 3 3 20.8 4 2 1 2 20.9 5 2 2 3 21.5 6 2 3 1 21.9 7 3 1 3 23.7 8 3 2 1 22.4 9 3 3 2 24.1 K1 19.967 21.267 21.167 K2 21.433 21.267 21.633 K3 23.400 22.267 22.000 R 3.433 1.000 0.833 11汕头大学硕士学位论文 表 2-2 正交实验方差分析 Table 2-2 Theorthogonal experiment result and analysis of variance 因素 偏差平方和 自由度 F值 Fa 显著性 温度 17.807 2 2.562 F0.055.140时间 2.000 2 0.288 F0.0110.900料水比 1.047 2 0.151 误差 20.85 6 由表2-1极差分析的结果可见,影响龙须菜多糖提取率的因素主 次顺序为:ABC, 即温度对实验结果的影响最大,其次为提取时间,料水比的影响 较小。 正交实验结果分析表明残次龙须菜多糖最佳提取条件为:ABC,即温度为 90?, 2 3 1 时间为5h,料水比为1:80。在所选择的最佳提取条件下进行放大验证实验,多糖得率 为25.97%,高于表中实验9的提取率,实验结果表明,所选多糖的最佳提取条件是可 行的。 由表2-2方差分析的结果可以看出,温度、时间、料水比对残次龙须菜多糖提取率 影响均不显著,表明藻体浸泡出胶后,多糖更容易提取。 2.3.3 残次龙须菜多糖与正品龙须菜多糖比较 通过第三章对残次龙须菜多糖的化学组成,分子量及红外光谱的测定可以发现,与 正品龙须菜多糖比较,残次龙须菜多糖的红外光谱区别不大,多糖的特征吸收峰和一些 重要官能团的吸收峰没有改变,残次龙须菜多糖的平均分子量升高,从 5万 Da升高到 10万 Da以上,多糖硫酸基含量略有降低,可能是由于长时间的海水浸泡,一些小分子 量多糖溶出,藻体中残留的都是大分子量的不难溶多糖,且大分 子量的难溶多糖中硫酸 基含量略低。 2.4 讨论 残次龙须菜是指采收时天气潮湿或因处理不当而导致变色甚至出胶的龙须菜,常常 被废弃。测定了残次龙须菜多糖含量,发现残次龙须菜多糖含量并没有减少,高达 29.64%,与正品龙须菜(31.05%)接近,具有很好的开发利用价值,如被废弃将是对 12汕头大学硕士学位论文多糖资源的极大浪费。 通过正交实验的结果可以看出,与正品龙须菜提取最佳工艺条件(廖?辉等, 2008) 比较,残次龙须菜的最佳提取条件发生改变,影响正常龙须菜多糖的提取因素的主次顺 序是料水比时间温度,而影响残次龙须菜多糖的提取因素的主次顺序是温度时间 料水比,而且残次龙须菜中的多糖更容易提取,提取率高达 25.97%,大于同样条件下 正品龙须菜的最大提取率。这可能是由于藻体长时间吸水,细胞发生自溶,更有利于多 糖的提取。说明残次龙须菜多糖提取更加容易,在工业中有应用的潜力。 13汕头大学硕士学位论文第三章 残次龙须菜多糖降解条件的研究 多糖的生理活性主要受多糖分子量、硫酸根含量等的影响。 分子量是影响多糖生物活性的一个重要因数。多糖分子量越大,分子体积越大, 越不利于多糖跨越细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。但分子量太低,则多糖无 法形成具有活性的聚合结构,从而导致多糖活性丧失。一般认为,中等分子量的多糖, 其生物活性大于高分子量及低分子量的多糖,因此,对多糖进行降解得到适宜分子量的 多糖可以提高其生物活性。 多糖降解的方法主要分为化学降解法、物理降解法和酶法。化学降解法中酸降解 和碱降解法反应条件不易控制,且易引起多糖结构变化,进而影响其生物活性。此外, 酸降解产物分子量分布较大,分离纯化困难。物理降解法对仪器设备有较高要求,酶解 法所需酶专一性强,而且酶水解所需的糖苷酶分离纯化困难,价格较昂贵。 过氧化氢降解法又叫又叫诱导羟自由基降解法或氧化还原降解法,是利用抗坏血 酸诱导过氧化氢产生羟基自由基来攻击糖链,使糖链发生非专一性的断裂。在产生自由 基的过程中,有 Vc和铁离子两种诱导剂,分别为 Harber-Weiss 反应和 Fenton反应,研 究表明,Harber-Weiss 反应较和缓而 Fenton 反应产生自由基较激烈(岳真等,2008), 因此本论文采取了 Vc 和过氧化氢共同作用,产生羟基自由基降解残次龙须菜多糖,由 于海藻多糖富含还原态的金属离子,该方法是目前研究海藻多糖降解常用的方法。 3.1 材料与设备 3.1.1 材料 残次龙须菜多糖(DGL