海人酸致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化（可编辑）

海人酸致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化（可编辑） 海人酸致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化 海人酸致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化 王颖 计:学位论文: 页 格: 个 插 图: 幅 教授 指导教师:隋鸿锦 专业名称:燃恂弛畔 申请学位级别:硕士学位 论文提交日期: 年月 论文答辩日期: 年月 学位授予单位:大连医科大学 学位授予日期:年月 评阅人: 答辩委员会主席:叫『删删 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 垂幺 签字日期:旦年删埘?? 目 录 一、摘要 一中文摘要?海人酸急性致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化 王 颖 硕士生姓名: 指导教师: 隋鸿锦教授 指导小组: 于胜波副教授 专业名称: 人体解剖与组织胚胎学 摘要 目的:研究癫痫敏感性形成期大鼠海马区锥体细胞和齿状回颗粒细胞树 突棘的可塑性变化特征。 方法:采用大鼠颈部皮下注射海人酸//制作癫痫模型。动 物发作达到级后,即符合癫痫模型的。分别在发作后和,经心脏灌流 固定,取脑,制成包含海马结构的脑组织块。脑组织块进行高尔基染色,火棉 胶 包埋,切片。用光镜成像系统和. 图像分析软件在海马结构 内选取齿状回分子层和腔隙层测量分析树突棘的形态学特征。正常对照用生 理盐水取代海人酸。 结果: 齿状回分子层内带树突棘变化 树突棘密度在癫痫急性发作后天显著增多,至发作后天,树突棘密度持 续增加,显著多于正常对照组和组.。和组的无颈短 棘数目明显高于对照组.,但二者之间无明显差别;与对照组比较, 组有颈长棘数目变化不明显,但有颈长棘平均长度明显下降.;组 有颈长棘数目与对照组和组比较明显增加.,而且平均长度恢复到 对照组水平。从有颈长棘占树突棘总数的比例上看,组出现下降趋势,而 组显著增加.。 齿状回分子层外带树突棘变化 癫痫急性发作后天树突棘数量显著增多,至发作后天,树突棘数量持续 增加,显著多于正常对照组和组.。和组的无颈短棘 数目明显高于对照组.,但二者之间无明显差别;与对照组比较, 组有颈长棘数目和平均长度变化不明显;组有颈长棘数目与对照组和 组比较明显增加.。从有颈长棘占树突棘总数的比例上看,组出现 下降趋势,而组显著增加.齿状回分子层内、外带树突棘变化的比较 在组,内带树突棘密度明显低于外带.。组内、外带树 突棘密度无明显区别,但外带树突的有颈长棘数目以及其在树突总数中的比 例均 显著多于内带.。 海马区腔隙层树突棘计数 癫痫急性发作后天树突棘数量出现下降趋势,至发作后天,树突棘数量 明显减少.。 总之,齿状回分子层内带和外带的树突棘密度在癫痫发作周内均持续增加, 在癫痫发作天内以短树突为主,从发作后天至发作后天,成熟的有颈长棘 增加明显。通过内、外带比较可以看出,在癫痫发作后天,外带的树突棘数目 明显多于内带,在癫痫发作后天,内外带的树突棘密度已无显著差异,但外带 的有颈长棘数目却明显多于内带。 在癫痫发作天后,内带的有颈长棘长度明显变短,萎缩。 腔隙层树突棘在癫痫发作后天没有明显下降,而在癫痫发作后天下 降明显。 结论: 在癫痫敏感性形成期,齿状回分子层和腔隙层树突棘发生显著的形态 学改变,可能参与癫痫敏感性形成机制。 齿状回分子层外带树突棘可塑性变化更显著。 齿状回颗粒细胞树突棘的可塑性变化可能导致锥体细胞的再次损伤。 关键词:癫痫海人酸树突棘高尔基染色发病机制 : : ?:& : :. :., , // . , % . . . 、析. , ?、? ., . 、 : , , .. . ., , .; 诵廿 , 诵口.. . ,.., , 口.. . ., , 口嘶 ;谢也.. . 骶,口.... ,,、析 ... , , ..,, ., ,’ , ,,. , . , . , : ,. , .。.: 海人酸急性致痫大鼠神经元树突棘的可塑性变化 硕士生姓名: 王颖 专旨导教师: 隋鸿锦教授 指导小组: 于胜波副教授 专业名称: 人体解剖与组织胚胎学 刖 置 癫痫是一种慢性脑部神经系统疾病,其特征为因脑内一群神经元 过度的同步并持续的放电所致的反复的一过性痫样发作。典型的发作表现 为惊厥伴随意识障碍,也可发生感觉、精神活动或内脏功能的异常。 癫痫是常见病,在世界范围内,癫痫的患病率%,根据我国流行病学调查材 料,患病率.%【】,这表明了其危害人民健康的严重性和加强对其研究的重要性。 随着抗癫痫药物的不断创新和扩展以及人们对癫痫及癫痫综合征认识的深 入,目前大约有%~%的癫痫患儿可以得到理想的控制,但仍有约%.% 患几经抗癫痫药物治疗不能控制发作。目前国际上对难治性癫痫尚缺乏统一准确 的定义,临床上将经过合理使用多种抗癫痫药物,血药浓度已达到最大耐受剂量, 但癫痫发作仍不能得到有效控制者称为难治性癫痫。 难治性癫痫的发病机制目前仍不完全明确,根据国内外的研究情况,神经网 络及环路的重组为难治性癫痫形成的重要原因。%以上的颞叶癫痫是难治性癫 痫,尤其是颞叶内侧癫痫患者,几乎都对抗癫痫药物耐药。高清晰度的核磁共振 ?检查发现,难治性癫痫患者多数有海马硬化和萎缩,术后脑组织切片发现 海马齿状回细胞有明显的深入外分子层的苔藓纤维芽孢形成, 并与附近的神经元 形成异常的突触联系。在动物实验中发现,慢性癫痫大鼠齿状回分子层的内层出 现异常的苔状纤维发芽现象【】。急性海人酸 ,诱发大鼠癫痫后,齿状 回颗粒细胞的树突总长度和树突棘密度均显著增加,即树突发芽,并发现齿 状回分 子层突触出现了先减少后恢复的可塑性变化一。 可见颗粒细胞在癫痫敏感性形成的机制中发挥重要的作用。 树突棘是神经元树突上的功能性突起结构,形成兴奋性突触的部位。树突棘 形态与功能密切相关,其形态受很多因素的影响,处于不断的调整变化过程中, 与突触结构适应外界环境而发生的改变保持一致,因而树突棘可塑性是中枢神经 系统突触功能可塑性的一个重要方面。由此推断,树突棘可塑性变化可能在癫痫 敏感性形成中发挥重要作用。本研究应用大鼠海人酸癫痫模型和高尔基染色法, 定量分析急性癫痫发作周内海马区和齿状回树突棘的密度和形态变化特征, 进一步探索癫痫敏感性形成的形态学机制。 材料和方法 实验动物 健康?雄性大鼠只,体质量?合格证号:辽 .大连医科大学动物实验中心提供。 试剂 海人酸红藻氨酸, ,, 公司 水合氯醛,扬州市奥鑫助剂厂 多聚甲醛,美国公司 重铬酸钾,上海莲冠生物化工有限公司 硝酸银,上海森灏精细化工有限公司 火棉胶,美国公司 主要仪器 分析天平,瑞士产品 病理切片机,德国美康公司 , 显微镜照相分析系统 ,日本公司 .精密计,上海精密科学仪器有限公司 动物分组 大鼠只,应用随机字表进行完全随机化的分组。按体重编号?号, 从随机数字表抄录个数字,将各数一律以除之,并以余数、、分别代表用眼科 剪和眼科镊去除硬脑膜,在小脑与端脑间处切断脑干,取出鼠脑。放入% 多聚甲醛磷酸缓冲液,?后固定。 高尔基染色 .组织准备 固定后鼠脑,去除软脑膜,正中切开,将右半脑的前、后进行部分切除,制 成包含海马结构的脑块。左半脑用作其它实验。 .固定媒染 重铬酸钾固定媒染液配 福尔马林 重铬酸钾 水合氯醛 双蒸馏水 将脑块用滤纸吸干后置入固定媒染液中?每块脑组织用量,即固定 媒染液倍于脑组织的体积,浸泡过程中每天更新固定媒染液。 .镀染 将脑块从固定媒染液中取出用滤纸吸干,移入.%硝酸银溶液,经数次银液 涮洗,直至再无红色的铬酸银沉淀出现时,将脑块置入.%硝酸银溶液中每块 脑组织用量银液,置于暗处。 .快速包埋 快速脱水 将己镀好的脑块,移入%酒精中.,再纯酒精次,每次,再移 .。 入:的乙醚.纯酒精。 快速浸胶和硬化 火棉胶配制密闭深色容器: %火棉胶液火棉胶、纯酒精、乙醚 %火棉胶液火棉胶、纯酒精、乙醚 浸胶步骤: %火棉胶液浸渗 %火棉胶液浸渗 氯仿蒸汽硬化.密闭容器 .切片 冠状切面切取含海马结构脑片,厚。 具体步骤: 以毛笔沾%酒精切片,旋即移入%酒精; 纯酒精×次; 冬青油透明下沉; 二甲苯次; 贴片、合成树脂封片。 光镜下观察和图像分析 分别取生理盐水组或海人酸处理、组脑片,用光镜成像系统和树突棘的形态 学 具体方法如 选取独立显 测量和计数 测量和计数 形态学指标 统计方法 采用 异。结果 示神经元树突野 高尔基染色可完整显示海马神经元:胞体、树突及树突 棘清晰。齿状回颗粒细胞的树突野呈灌木丛状,树突分支呈 扇形分布图。区锥体细胞顶树突粗大,在放射层 以树突干为主,无大分支,在腔隙层树突干常发出.支主干 支,并发出密集分支,分子层可见大量的树突分支终末图。 图 锥体细胞高尔基染色: 图齿状回颗粒细胞高尔基染色:长箭头 示胞体,短箭头示树突 长箭头示胞体,短箭头示顶树突 海马齿状回颗粒细胞树突棘计数 .分子层内带树突棘密度 在树突野距离胞体.扇形范围内,树突棘的分布密度见表。结果显 示癫痫急性发作后天树突棘数量显著增多,至发作后天,树突棘数量持续增 加,显著多与正常对照组和组.。进一步观测发现,和 组的无颈短棘数目明显高于对照组如.,但二者之间无明显差别;与对照组 比较,组有颈长棘数目变化不明显,但有颈长棘平均长度明显下降.; 组有颈长棘数目与对照组和组比较明显增加.,而且平均长度 恢复到对照组水平。从有颈长棘占树突棘总数的比例上看,组出现下降趋势, 而组显著增加.。图. 表海马齿状回分子层内带树突棘密度树突棘数/肛和长度 长棘平均 长棘占棘总数 短棘数 长棘数 分组 无颈 有颈 百分比% 茎主警 长度岬 .?. .?. .?. .?.‘.?. ,士..:,与组比较.;,与、组比较.;,与组比较 .;,与、组比较.:’与组比较.;,与组比较. . . . 籁. 囊 ? 镯《. 霉 ? . ? . . . 树突棘总数 短棘数无颈 长棘数有颈 图海马齿状回分子层内带树突棘密度树突棘数/ ,与组比较.:,与、组比较.;,与组比较.:,与 、组比较. ,、. 累 . . 对. 言. . 氅. . 瓣: . . . 求忸籁蹈鬟衄嚣半 山 . . 图海马齿状回分子层内带长树突棘 图海马齿状回分子层内带长树突棘 占树突棘总数百分比,与组比 平均长度’与组比较. 较. ?图海马齿状回分子层树突棘,正常 组;,组;,组长箭头示 有颈长棘;短箭头示无颈短棘 .分子层外带树突棘密度 在树突野距离胞体.扇形范围内,树突棘的分布密度见表。结果显 示癫痫急性发作后天树突棘数量显著增多,至发作后天,树突棘数量持续增 加,显著多于正常对照组和组.,并且树突棘体积增大。进一步观 测发现,和组的无颈短棘数目明显高于对照组.,但二者之间 无明显差别;与对照组比较,组有颈长棘数目和平均长度变化不明显; 组有颈长棘数目与对照组和组比较明显增加.,但平均长度三组无 显著变化。从有颈长棘占树突棘总数的比例上看,组出现下降趋势,而 组显著增加.。图, 表海马齿状回分子层外带树突棘密度树突棘数/和长度 树突棘 短棘数 长棘数 长棘平均 长棘占棘总数百 分组 . . . 有颈。 总数‘ 无颈。 长度脚。 分比%。 逐瀛釜邈菠携燃毖瑟麴磊瀣滋熬杰艘舷鑫懑毽隧酝基滋美氨墓主鑫润 .. .?. .?. .?.。 .?.。 ,士..;,与组比较.;,与、组比较.;,与组比较 .; ,与、组比较.;,与、组比较. . . . 皇. ?隧 羹. ? 嗣 露. ? . ? . . . 树突棘总数 短棘数无颈 长棘数有颈 图海马齿状回分子层外带树突棘密度树突棘数, ,与 ,与组比较.;,与、组比较.;,与组比较.; 、组比较. 更 . 、一, 筮 . 求 籁 . 蹈 嬖 . 屯 鬟 . 半 . 图海马齿状回分子层外带长树突棘占树突棘总数百分比 ’与、组比较. .分子层内、外带树突棘密度分布比较 齿状回分子层内带和外带树突棘密度比较结果如下: 正常对照组的内、外带树突棘密度无明显区别;组的内带树突棘密度明 显低于外带树突棘密度.图;组内、外带树突棘密度无明显区 别。正常对照组和的有颈长棘数目内、外带之间无明显差别,而在 组外带的长棘数目以及其在树突总数中的比例均显著多于内带.图。 而无论正常对照组,还是组、组,内、外带的长棘长度均无明显差别。 . . . . 籁. 舞.? 蘧 蓑. 蓑. 絮 萋? . . . . . . 图海马齿状回分子层内、外带长树突棘总数 图海马齿状回分子层内、外带 ,与内带比较. 长树突棘数,与内带比较. 海马区锥体细胞树突棘计数 在腔隙层树突干上距胞体?范围内,树突棘的分布密度见表。结果 显示癫痫急性发作后天树突棘数量出现下降趋势,至发作后天,树突棘数量 明显减少图,。讨论 以复杂部分性发作为特征的癫痫发作大多数起源于中线颞叶。来自颅内深部 电极的记录清楚的显示出中线颞叶结构如海马、杏仁核、海马旁回有突发性 发作, 对合适的患者手术切除以上区域通常能消除癫痫发作【】。中线颞叶癫痫患者行手术 切除最常见的原因是海马硬化,其被广泛描述但原因不明。在海马硬化当中, 齿 状回门区和海马锥体细胞层出现选择性神经元缺失,齿状回颗粒细胞和一小部分 锥体细胞在海马角,海马的第二部分,保持相对恒定【.】。 对海马硬化形态学改变的细致研究, 引出了对在海马硬化下癫痫发生机制的 几种假说。最明显的改变是齿状颗粒细胞的苔藓纤维轴突发芽。苔藓纤维发 芽 ,是一种神经再生现象。生理状态下齿状回颗粒细 胞轴突苔藓纤维只向同一片层的门区及区投射。多者研究发现,癫 痫反复发作可致在齿状回分子层、区下锥体层异常生长,形成异常的 局部兴奋性突触环路,导致海马发生形态变化【。。 其次是齿状颗粒细胞的树突发芽。隋鸿锦等利用海人酸致痫大鼠模型发现, 齿状回颗粒细胞在癫痫敏感性形成期后.天出现树突发芽【,即树突野 的伸展范围树突总长度、树突分支点数和树突棘密度均明显增加。这使得颗粒细 胞接受海马外传入的功能增强。癫痫敏感性成熟期后天在齿状回,颗粒细胞 分子层内带出现苔状纤维侧枝发芽齿状回颗粒细胞的轴突发芽的突触可塑性 变化 。向阳等通过电点燃模型发现点燃发作后天齿状回颗粒细胞树突棘密 度已超过正常水平,至天已显著高于正常组?。 在海马结构内部的三级突触兴奋性回路中,内嗅区锥体细胞的轴突形成穿通 通路纤维投射到齿状回分子层的外/,终止于颗粒细胞的树突远端树突棘;颗粒 细胞轴突苔状纤维到透明层,终止于顶树突的基部;锥体细胞的轴突的 侧支投射到同侧腔隙层,终止于锥体细胞的顶树突干;最后锥 体细胞轴突经下托达内嗅区皮质。可见,在兴奋性回路上,颗粒细胞是海马结构 ‘ 接受外部信息并向其内部传递的重要部位。 本研究在以往研究基础上,根据三级突触回路的轴突投射部位,进一步揭示 齿状回分子层内带和外带的树突棘的可塑性变化特征。结果发现:齿状回分子层 内带和外带的树突棘密度在癫痫发作周内均持续增加,在癫痫发作天内以短 树突棘增加为主,从发作后天至发作后天,成熟的有颈长棘增加明显。通过 内、外带比较可看出,在癫痫发作后天,外带的树突棘数目明显多于内带,在 癫痫发作后天,内、外带的树突棘密度已无显著差异,但外带的有颈长棘数目 却明显多于内带。树突棘新生时,先突起一个伪足,随后伪足与突触前末梢结合形成突触,最后缩 . 成长~岬的成熟树突棘【。 由此可见癫痫发作后的.天,新生的树突棘逐渐成熟。可能加强了海马内突 触环路兴奋性。 我们进一步检测区“健在神经元发现:接受锥体细胞的轴突的 侧支投射的腔隙层树突棘在癫痫发作后天没有明显下降,而在癫 痫发作后天下降明显。该结果间接说明,癫痫发作后.天齿状回分子层新生树 突棘成熟,形成有效的突触联系后,强化了海马内三突触环路兴奋性毒性,使具 有兴奋毒性敏感性的锥体细胞受到了再次打击,表现为树突棘密度明显下降。 我们还发现,在癫痫发作天后,内带的有颈长棘长度明显变短。在齿状回 的门区有苔藓细胞,其轴突穿过颗粒细胞层终止于分子层内带,和颗粒细胞树突 近段形成突触,形成反馈抑制。齿状回的门区是癫痫发作后神经元缺失的“重灾 区’’【】本研究发现分子层内带有颈长棘萎缩,可能与癫痫发作后门区细胞损伤后, 分子层内带有效传入减少有关。而癫痫发作后天,有颈长棘增多,可能与分子 层内带出现苔状纤维侧枝发芽构成异常的突触联系,形成正反馈回路。 总之,本研究在以往研究的基础上,揭示了齿状回分子层颗粒细胞树突棘的 可塑性特征,丰富了颗粒细胞参与癫痫发病形态学机制的内容。 结论 在癫痫敏感性形成期,齿状回分子层和腔隙层树突棘发生显著的形态 学改变,可能参与癫痫敏感性形成机制。 齿状回分子层外带树突棘可塑性变化更显著。 齿状回颗粒细胞树突棘的可塑性变化可能导致锥体细胞的再次损伤。 参考文献 李继东,刘汉东,李元柱.癫痫患者生活质量的研究阴.河北医药 ,:. 黄绍平,李丹.难治性癫痫的发病机制研究进展及前景展望【】.临床儿科杂 志, , :? 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