【doc】登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

【doc】登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究 登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA 介导的抗病毒作用的研究 41卷3期 2001年6月 微生物 AetaM/cro~aaMca 41No3 June2001 登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导 的抗病毒作用的研究 于曼秦鄂德赵卫胡志君苑锡同 (军事医学科学院微生暂流行病研究所北京100850) 摘要:将扩增的登革2型病毒株PrM基因导^psFv载体的SF6启动子下游.筛选出含该基 因正,反向插^的重组质粒DNA.用I酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化,井将其 体外转录成5末端含帽子结构的RNA.再将这两种RNA共转染BHK细胞.然后将转染的 宿主细胞用登革2型病毒株攻击.并分别观察含正,反义PrM基因的重组甲病毒RNA舟导的 抗病毒效果.通过碱基序列测定,筛选出含P基周正,反向插^的psFV.PrM重组质粒.井 获得了经重组RNA与辅助RI~'A共转染细胞而产生的重组病毒颗粒.含有反义PrM基因的 重组病毒RNA,在宿主细胞中具有抗登革2型病毒复制的作用.而且强于含正义PrM基因的 重组病毒RNA. 关键词:登革2型病毒,PrM基因,甲病毒载体,抗病毒作用 中田分类号:R37333文献标识码:A文章编号:0001—62o9【2001)03.0334-06 登革病毒为单股正链RNA病毒,包括4个血清型.这类病毒均可经蚊媒传播而导致 登革热或登革出血热,登革休克综合症的流行.近年来登革热的发病率呈上升趋势,据报 道,全球每年发病人数约达1亿…,尤其是东南亚各国及我国的东南沿海地区是该病的高 发区.但目前对这类蚊媒病毒病仍无有效的防治. 甲病毒表达载体(psFV)系统具有感染宿主细胞范围广,转录和释放外源基因效率高 等特点.并且用该表达系统制备的重组RNA和重组病毒颗粒均可直接作为免疫原.以病 毒自然感染的方式诱发宿主产生强的免疫应答.此外,这种载体系统还可以将携带的 目的基因定向导人靶器官.该载体系统包括表达载体和辅助载体两部分:前者含有SFV 病毒的包装信号序列和病毒复制所需的酶即4种非结构蛋白(NSP1一NSP4)的编码序列: 辅助载体则含有编码病毒结构蛋白的基因.当将两者同时共转染宿主细胞时.可产生大 量的含外源基因的病毒RNA和SFV病毒的结构蛋白,进而包装成重组病毒颗粒】.登 革病毒的PrM基因编码蛋白为病毒的结构蛋白,存在于病毒复制早期,在4个型登革病 毒中其核苷酸序列的同源性很高,该蛋白与病毒装配成熟密切相关.本研究将从我国广 西登革热患者中分离的登革2型病毒(D:.43)株的PrM基因导人甲病毒载体系统,构建成 携带登革病毒正,反义PrM基因的重组SFV病毒颗粒,观察含该基因的重组病毒RNA介 国家自弈!;科学基金贷助项日(39770036) 作者葡介:于曼(1953一).女,山西长泊市^,军事医学科学院擞生物流行庸研究所病蠢室高援实验师.主要从 事分子病毒学研究工作. 参加此项工作的^员还有:耻丽卿段鹕元揭佩英 收蕾日期12000~6.14.回日期:2?o_l1_08 3期于曼辱:登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究335 导的抗登革病毒感染作用,为登革类疾病防治新途径的探讨提供依据. l材料 . 1.1毒株和抗体 登革2型病毒43(D:.43)株由本室从广西登革热患者血清中分离".该毒株的鼠免 疫腹水抗体由本室制备.羊抗鼠荧光抗体为原平皓公司产品. 1.2甲病毒表达载体系统和宿主细胞株 甲病毒载体pSF%'和辅助载体.2,均为G1BCOtBRL产品.BHK.21t13细胞株由本所细 胞库提供. 1.3PrM基因的扩增 依据D:一43病毒株的PrM基因序列上,下游引物.以由—43株病毒的感染C6t 36细胞制备的总RNA为模板进行RT-PCR扩增.方法见文献[8]. 1.4台PrM基因的重组pSFV质粒DNA的构建及鉴定 将扩增的全长PrM基因片段导人psFv载体的SF6启动子下游的BamHl位点,构建 成重组质粒(简称osr?rM)详细构建方法见文献[8].重组质粒DNA中插人PrM基 因 的方向及核苷酸序列,用ABiPRISMTM377DNAsequcllcel"仪,由上海生物公司进行测 定.不同方向插人片段的重组质粒枸建见图1,正,反向插人PrM基因的重组质粒分别称 为pS'F'rM;和pSF'n? 1.5重组psF-rM2后毒颗粒的制备与激活 1.5.1重组病毒RNA和辅助RNA的制备:帽子结构类似物mc(5)PPP(5)G,4种NTP 和SP6RNA聚台酶,均为GIBCO/BRL公司产品.先将pSF?rM重组质粒DNA和辅助DNA 经Sl酶切使之线性化,并按常规法纯化后,分别将其体外转录成RNA,方法见文献[8]. 1.5.2RNA转录物的共转染:采用Bio.Rad公司的C-onePulser1I型电穿孔仪,将口sF?rM, 重组RNA和辅助RNA共转染BHK.21t13细胞,制备重组病毒颗粒.转染条件:2× 10BHK一21/13细胞,12/~gpSF?帆重组RNA和等量的辅助RNA;850V,25"F,300D, 脉冲2 次. 1.5.3oSF.rM2病毒颗粒的收集及其括化:将受转染的BHK细胞接种于25c细胞瓶 中,置37?培养.分别于转染后16h和24h收取培养上清液,该液中含有pSF?rM:病毒颗 粒.将收取的上清液先于液氮中速冻15min后,置一70?贮存备用. 从一70?取出0.5mL含重组病毒的细胞培养液,于室温快速融化后,加人0.05mL糜 蛋白酶A4(激活剂,Sigma产品)至终浓度为200~g/mL,混匀,置室温10min;再加人2751~L 抑蛋白酶肽(Sigma产品),置冰浴10rain.此时的pSF?rM:病毒为激活的病毒,具有感染 性.取lmL,接种于用PBS液洗好的BHK细胞单层上.铺匀,置37?吸附60min后, 去除 吸附液,加人5mL生长掖,置37?继续培养,观察细胞病变(CPE). 1.6对登革府毒复期的干扰试验 向每个细胞瓶中,加人用体外转录的pSF?RNA和辅助RNA共转染的约1×10的 BHK细胞,置37?培养.分别于接种后16h和24h,用.43株病毒进行攻击,剂量分别为 } —————————————......................................................————................. —..—. 336微生物4l卷 loo'rciD和1000TCID.置37?吸附1h后,去除吸附液,加入5mL维持液.同样温度下 继续培养至48h,收取用病毒攻击的细胞制作抗原片,详见文献[8].利用该抗原片采用 免疫荧光法,观察含PrM基因的重组RNA对登革病毒复制的干扰作用. 1.7间接免疫荧光检测 取于不同时间,用不同剂量登革病毒攻击后制备的细胞抗原片,按常规法,以D:.43 病毒株免疫的鼠腹水抗体为第一抗体进行间接免疫荧光染色,然后于荧光显微镜下观察. 2结果 2.1含正,反义PrM基因的重组质粒的构建与鉴定 首先采用RTPCR方法扩增了我国登革2型病毒的PrM基因,全长567b9.然后将其 导入pSF%'载体的双启动子下游,分别构建成相对于SP6启动子方向的正,反义PrM基因 的重组质粒DNA(图1).对重组质粒中插入的PrM基因的碱基序列测定结果表明,该基 因的序列与本已发表的序列是一致的.同时还鉴定出台正向和反向插入基 因的 重组质粒. PrMgerm(A口日?0d呲l啪).p汀'r嗨 PrM目(s?e咖e6m),p口'f 图1台正,反义PrM基因的psF.T重组质粒13NA梅建 F1Constructionthe~e~mbinampSF'rpl~mldcontainedandanti~一PrMne 2.2含PrM基因的重组病毒颗粒的{镧备及其致细胞病变作用的观察 如前所述,pSIW表达载体系统包括可导入外源基因的含SFV病毒包装信号的表达载 体和仅含该病毒结构蛋白的辅助载体两部分.为了构建含正,反义PrM基因的重组病 毒,首先应将含PrM基因的pSFV重组质粒和辅助质粒DNA分男?体外转录成RNA.为此, 将构建的含正,反义PrM基因的重组质粒pSr?和pSr?r一及辅助质粒DNA线性化 之后,在帽子结构类似物m~G(5)9pp(5)c的存在及SP6RNA聚合酶作用下,分别将其体 外转录成5端含帽子结构的重组RNA.含PrM基因的重组质粒和辅助质粒DNA的体外 转录产物经1%琼脂糖凝胶电泳,与标准分子量比较,重组RNA和辅助载体RNA的分子 大小,分别约为2.7kb和1.5kb,与预期结果一致.为了证明这两种RNA的特异性.分别 将体外转录物用核糖核酸酶进行消化,结果表明它们均被该酶降解,证明它们是RNA. 为制备含P基因的重组病毒颗粒,首先采用电穿孔法,分别将含正,反义基目的重 毒 3期于曼等:登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究337 组RNA和辅助载体RNA共同转染BHK细胞.但是,在转染细胞中装配成的重组病毒颗 粒,由于对SFV病毒突起蛋白基因预先进行了突变,所产生的病毒蛋白前体不能被裂解, 因而缺乏感染性.因此,需用麇蛋白酶进行处理,才使产生的重组病毒颗粒具有感染性. 为此,在两种RNA转录物共转染之后,分别于l6和24h收集细胞培养液,用麇酶进行处 ,并观察它们的致细胞病理,然后再用这种具有感染性的重组病毒感染BHK细胞 变作用 (cPE).图2是于不同时间收集的培养液,经糜蛋白酶处理前后对BHK细胞的致病变作 用.从中可看出,未经麇酶活化的重组病毒对BHK细胞不产生细胞病变(见图2,A), 而经靡酶活化的重组病毒在BHK细胞中可产生CPE,随着时间的延长,病变则更严重(见 图2,13和c).表明在转染后的细胞培养液中释放有重组病毒颗粒. 图2psr?重组病毒颗粒在BHK细胞中产生的细胞痈变(CPE) Fig2Theevtopathloeff~tpr0duc.dinBHK.eJnl~tedW|山therecombinantvSr'rM2pcIe A:BHKcells?24hciteri叽山theta~$mi3xtmtvsr椰2静; B衄dC1BHKeeUsat16h皿d24hm%riafeeti~theretnm~inantvsrrMzparticle treatedby-ehymotr~nA4,respectively. 2.3PrM基因的重组病毒RNA介导的抗病毒活性 为了进一步观察含正,反义PrM基因的重组病毒RNA在宿主细胞中对登革病毒复制 的干扰作用,将重组病毒RNA和辅助载体RNA共转染BHK细胞后.分别对于16h和24]3 不同剂量登革2型病毒攻击细胞而制备的抗原片,进行间接免疫荧光检测.结果表明, 在转染细胞后16h,攻击的登革病毒剂量无论是100TCID还是1000代ID,害正,反 义P 基因的psF?rM:均可完全阻断登革2型病毒的复制.而于转染后24h,含正义PrM基因的 pSF?rr,t~,用100TCID,o和1000TCID的登革病毒攻击,仅观察到少数具特异荧光的阳性细 胞,约占细胞总数的5%(图版I—A,B).表明在转染后24h吉正义PrM基因的psF?rM: 并不能完全阻断病毒的复制.从图版I—c,D可以看出,含反义PrM基因的pSF?. RNA在转染后24h,攻击病毒的剂量无论是100312m还是10OOTC/Ds,均未观察到古特异 荧光的阳性细胞.表明反义PrM基因具有极强的抗登革病毒复制的作用.图版I中的 E,F和G,分别为正常细胞对照,登革2型病毒感染的细胞阳性对照和不舍PrM基因的重 组甲病毒感染的细胞对照. 338擞生物41卷 3讨论 本研究的初步结果显示.由含登革病毒正,反义PrM基因的重组RNA与辅助RNA共 转染所产生的重组病毒在宿主细胞中具有抗登革病毒复制作用.转染后16b的抗病毒教 果优于24h.这可能与SFV病毒颗粒的复制包装成熟时间有关.SFV病毒基因组为单股 正链RNA,5端有帽状结构.3端具有聚A尾.当SFV病毒借助于受体介导的内吞作用进 人宿主细胞之后,首先合成大量的正,负链RNA,然后合成病毒的结构蛋白,并能快速抑 制宿主细胞蛋白的合成.从复制到成熟病毒颗粒释放,于24h之内即可完成.本研究 表明,体外转录的含PrM基因的重组病毒RNA在转染细胞后6,16h之间可能是重组病 毒复制的高峰期,宿主细胞内存在大量的携带登革病毒PrM基因的重组病毒RNA分子, 此时抗登革病毒复制的效果最佳.而24小时之后病毒已包装成熟,并释放到宿主细胞 外,因而其抗病毒效果弱.再者,实验结果证明,吉反义PrM基因的重组病毒RNA抗登革 病毒复制的作用强于吉正义PrM基因的重组病毒RMA,表明反义PrM基因阻断登革病毒 基因组RNA复制的效率更高,可能是由于反义基因与登革病毒的基因组RNA结合,阻止 了棱糖体在翻译期间的附着或延伸.而且结合了反义PrM基因的病毒RNA容易被RNase ,识别而降解,有效地减少了mRNA的量,从而阻止了登革病毒基因组的复制.另外反义 PrM基因结合到正链的基因组RNA上,则在负链合成期间阻止了病毒复制酶的结合和链 的延长.使病毒的复制终止".因此,含反义PrM基因的重组病毒RNA抗病毒作用强于 含正义PrM基因的重组病毒. 另外,对于psFv重组病毒的生物安全性问题,由于在pSFV载体辅助系统编码的衣 壳突起蛋白基因中插人了一突变序列,带有突变的突起蛋白的病毒颗粒无感染性,需经蛋 白酶水解才能恢复其感染性J,因此,由该系统制各的重组病毒颗粒是安全的,并可直接 作为免疫原.经体外转录的psF?rM:重组RNA也可以直接进行免疫,从而避免DNA整合 的潜在危险,可为登革疫苗研制新途径的探讨提供依据.目前,我们正用构建的重 组 RNA及重组病毒颗粒免疫动物,以观察对动物的保护作用. 参考文献 MonathTP./'roeAeadSeiUSA,1994.91:2395—244)O TsujiM,BergamanCC,Takita-ScotodaY,a/JVko/,1998,72(8):6907—6910 HarlharanMJ.嘶啊OA.w盯附K,Ha/.JV~-o/,1998,72(2):950,958 Li日曲mP血曲Bieuchmo~,1994,5【5):495—5OO. BeP,Sjob~M,C-aroffH.B/o,I993,11t916—920. 扬佩黄,秦邵藩.登革热和壁革出血热北京:^民军医出版杜.299934—43 橱佩英,司婀银,株祜芳,等.军事医学科学院院刊,1994,lS(2):81一 于曼,事鄂蒋,欧武,等.中华微生物学和免疫学杂志,2000,20(5):473—476 I|eloaiwA,咄kJ,尉咖K,a/.JCell8M,1980,粕:4一420 I~nhardtD.Am?YAead&.1992.660:70—76. …………………? 3期于曼等:登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究 339 sTUD?嗒0FTHERESIsTANCE0FTHERECoM【B玎ANT ALPHAVIRUSRNAsC0NTAD?NGDENGUE.2 PrMGENEToVIRUS?FECT10N YuManQinEdeZhaoWeiHuZhijm~YuanXitoog (脚,hatmce曲印如,增100850,) Abstract:TheamplifiedPrMgeneofdengue-2viresWO8clonedintothedownstreamSP6pr omoter 0fpsFvvectorandtherecombinantplasmid(pSF.rM2)DNAwhichcontained~!~ense-oranti seooe- PrMgene,w鼬selected.psF.rM2DNAandhelperDNAfineadzedbytheenzymeIdigestion werebothtranscribedinvitrointorecombinantRNAswhichconta/nedthecappinganalogont he5- endandcotaansfectedintoBHKcellsbyelectropormtion.111ethetransfectedhostcellswere cha1. 1engedwithdengue-2viresandtheresistantefficiencyofrecombinantviresRNAscontainingscnse- orantiscnse-PrMgenetov/msinfectionweroobserved,respectively.erecombinantplasmids(ps- FV-PrM)containingsense-ora~fisense.PrMgenewereselectedwithdeterminationofthenucleotlde seence.111erecombinantviresparticleswere0btainedwithrecombinantRNAandhelperRNAc0. tranofectedintoBHKceits.Hostcellstransfectedwithanfisense-PrMRNAderivedcompleteresis. tanc{~todengue-2virusreplicationandtheefficiencyw丑 shigherthaIlthatoftherecombinantvirus RNAcontainingsense.PrMgene. Keywords;Dengue-2virus,PrMgene,Alphavimsvector,Resistanttoviresrole 圈版说明 Explanationofslate psF.2重组病毒R,NA中正,反义PrM基西舟导的抗病毒作用的免疫荧光分析结果 {A.B.Hr2和psF, rMzRNA.转染BHK绑臆24h后,分别用100TCIDjo~Il?叽uD?的?43病毒攻 击:c,D.Hdper2和psF?r一 RNAs转染BHK细胞24h后,分别用100"mlD~o和J00叽?D蚰.的_43病毒攻击;E. 正常B}II(缅臆tF.D2.43病 毒感染的BHK绑胞;G.m和psFv的空载傩RNA转染B}II(细胞24h后,用 10OTEI~D2.43病毒攻击. I…onIl?%lidemifieatio~oftheandL…PrM0? therecombinantpsr?2RNA-&rlvedTe目_ t丑口髓todennHT叫0n.Aandh:BHKcdls,m24h妇c0lle嚆i帆 mRNAsHdper2aadpsF?, we他ehailea~dwithD2-43r啪m8100-口dt000q~tM-r~oocflvely~CandD:BHK?,m24haftercmml"0? withRNAeo/Hdp啦andpsF.,"唧出D2.43珊at100aadIO~OTCI,州,IE:咐m日l BHKb:F'positive~tzoi-BFlKceu且】蚍 edby.43rimeG:BHKcdh,24hafter~otnmdeefimtwithRNA*o/ H却andpsFV,bdl嘟.dwith.43珊ata10ercnho ecIGChitm*NNatural?fund(~YrTOtB6)