先天性视网膜变性大鼠视网膜内核层的变性

先天性视网膜变性大鼠视网膜内核层的变性 先天性视网膜变性大鼠视网膜内核层的变 性 第l8卷第1期 2001年3月 实验动物科学与管理 LABORA呻RYAN1MAISCIENCEANDADMINSTRAT1ON V0【I8No MaT.200l 先天性视网膜变性大鼠视网膜内核层的变性 张纯,王薇,石晶 (1DepartrnemofPathology,YaleUniversitySchoolofMedicine,NewHaven,CT06510?US 2.北京大学第三医院眼科,北京100083) 摘要:目的:证实先天性视网膜变性(RCS)大鼠视网膜内棱层存在神经原变性.方法:使用出生后第18.20,28.35, 42,45,56,60,70和I?d的RCS大鼠视阿膜和正常sD大鼠比较,利用视网膜内拔层细胞标记物:抗Calbindln,PKC和 Calretinin血清,经免疫组化方法分别标记水平细胞,杆双极细胞及无长突细胞,并统计这三种细胞的数目.结果:和 正常sD大鼠视网膜比较.RCS大鼠从18—20d开始视网膜变性除了外拔层细胞死亡,内棱层细胞也有不同程度 的丢失,并表现为浓染或水肿统计结果表明,内棱层水平细胞数H从出生后60d开始减少,杆双极细胞在出生后 2Od即数目已减少,但可保持至100d才有进一步减少,无长突细胞虽然在出生后20—35d数目明显减少,但町一直 保持这个水平结论:RCS大鼠视网膜内拔层细胞存在神经原变性,水平细胞,杆双极细胞_无长突细胞发生损失 的时间不同,反映了中继神经原变性很可能是这些细胞变性的机理 关饕词:RCS大鼠;视网膜内核层细胞;中继神经原变性 中图分类号:R77413文献标识码:A文章编号:1006—6I79【2[xlI)0I一0004-04 视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium, arE)是位于Bruch氏膜和光感受器(Photoreceptor)之 间的单层立方体细胞,具有很多生理功能,其中,吞 噬视杆,视锥脱落的外节为其重要功能.在光感 受器细胞中,外节顶端不断有旧的盘膜脱落,这些脱 落的盘膜被RPE细胞吞噬,以维持正常的视觉功 能.而先天性视网膜变性大鼠(RoyalColiegeofSur— geonRat,RCSrat)因其RPE细胞吞噬功能缺陷,在光 感受器和RPE之间堆积了大量的脱落的外节膜盘 碎片,从而成为导致光感受器变性凋亡的重要原 因..人类许多眼病如某些视网膜色素变性和黄 斑变性都有相似病理改变.然而,到目前为止,RCS 大鼠的RPE病变是否会引起视网膜内核层细胞变 本文利用免疫组化方法标记RCS 性仍是未知的. 大鼠视网膜内核层细胞,并统计其数量以证实视网 膜内核层细胞变性的存在. 1材料与方法 本实验所用正常组动物sD大鼠和先天性视网 膜变性RCS大鼠,由北京大学医学部实验动物科学 部提供(京动许字1999第0O5);均为白化种,饲养条 件为12h(白天)f12h(黑夜)周期循环,使用动物每 组7,8只,在出生后第18,20,28,35,42,45,56,6o, 7O和10Od用co:处死动物. 1.1组织制备 我们将得到的大鼠眼球固定于4%多聚甲醛 中,并去除眼前节(包括角膜,虹膜和晶体)来自右 眼的视网膜经石蜡包埋,切片用于免疫组化研究. 来自左眼的视网膜经树脂包埋,切片用于光镜(经 1%Toludineblue染色)研究. 1.2免疫组化 我们用4m厚石蜡切片做间接免疫组化.第 一 抗体见表1,第二抗体为生物索标记.经ABC法及 DAB显色. 衰1本实验中使用的第一抗体 2结果 2.1RCS大鼠视网膜内核层的组织学改变见图1 收稿日期:2000-12一OI 第一作者简介:张纯(1965一),男,主治医师.现北京大学第三医院眼科副主任.主要从事视网膜变性机理研究. 2001年(第18卷)第1期实验动物科学与管理 围1RCS大量的视罔羼变性 内1/2可见水肿细胞. 和同年龄正常SD太鼠视网膜比较,RCS太鼠在细胞, 出生后18d,视网膜外核层大致正常,浓染细胞散在2.2免疫组化标记视网膜内核层细胞见图2 分布于内核层的外界和内界.出生后28d,视网膜在正常sD太鼠和RCS太鼠视网膜内核层的外 外核层细胞浓染且数目明显减少,内核层中仍可见侧,水平细胞的胞核和胞质被抗CaINndin血清标 到浓染细胞但是其数目已明显减少,位于内核层中记.在视网膜内核层的外侧,杆双极细胞的胞体,轴 部的细胞轻度水肿.出生后42d,视网膜外核层细室和树突被抗PKC血清标记.在视网膜内核层的 胞只有一层,内核层轻度变薄,少数细胞水肿.出生内侧,无长突细胞胞体及其位于内丛状层的突触被 后56,70d,视网膜外核层细胞太部分消失,内核层抗Calretinin血清标记. 厚度无明显改变,但是,在内核层的外1,2可见浓染 ?6?实验动物科学与管理2001年(第18卷)第1期 围2被标记的视网膜内核层细胞 2.3形态学统计视网膜内核层细胞的数目见 图3 和正常SD大鼠比较,水平细胞的数目在RCS 大鼠出生后20,45d无明显变化,出生后60d,内核 层水平细胞数目明显减少,至出生后100d,数目进 一 步减少(见图3一A).杆双极细胞数目在RCS大 鼠出生后20,60d,即有明显减少,但保持相对稳定 的数目.直到出生后100d,杆双极细胞数目才有进 一 步减少(见图3一B).无长突细胞数目在RCS大 35d,即有明显减少,以后其数目未有 鼠出生后20, 进一步减少(见图3一C). SDSOdRCS20dRCS35dRCS46dRCS60dRCS1OOD A? 3讨论 圈3视网膜内核层细胞的统计 本实验目的是证实先天性视网膜变性RCS大 鼠视网膜内核层的神经元变性.除了用光镜进行形 态学观察,我们也利用免疫组化标记不同的视网膜 内核层神经元.我们发现,RCS大鼠出生后18至35 d,随着RPE介导的光感受器细胞的死亡,杆双极细 胞和无长突细胞最早开始变性,细胞数目减少.出 生后60d,水平细胞才开始减少. 在我们的研究中,RCS大鼠病变RPE致外核层 光感受器细胞死亡后,杆双极细胞和无长突细胞最 先开始变性,组织表现以细胞浓染和水肿为主.在 视网膜神经传导中,光感受器细胞(大鼠中主要是视 杆细胞),杆双极细胞和无长突细胞分别构成一级, 二级和三级神经元.Simth等曾观察到某些神经 原的死亡是由于其突触连接了受损的神经细胞,这 种现象称为中继神经原变性(Transneuronaldegenera. tion).在我们的实验中,杆双极细胞和部分无长突 . :0 ?蛐帅蓦:加?0 2001年(第J8卷)第1期实验动物科学与管理 细胞是继光感受器细胞死亡后开始变性的,非常类 似中继神经元变性,其机理可能是丧失了前一级神 经元提供的营养.本实验中,水平细胞的变性发生 较迟=原因可能是在视网膜中,水平细胞属侧枝神 经元,主要起反馈调节作用水平细胞不仅和视杆, 杆双极细胞间有突触联系,水平细胞间也存在着大 量的细胞间缝隙连接,使几乎所有视网膜水平细胞 联成一个网络整体.因此,水平细胞具有较强的损 伤防御和营养供应.在出生后70,100d的RCS大 鼠视网膜中,仍有部分内核层细胞存活,这可能是由 于形成了新的神经通路或Miiller氏细胞营养所 致. 我们通过实验结果证实RCS大鼠视网膜内核 层存在神经元变性;而且不同的神经元发生变性的 时间不同.此研究为探讨A视网膜变性的机理和治 疗提供了参考依据. 参考文献 [1]BokDRetiredphotorecep4or-pigmentepitheliuminteractions ^删oj,htha/mdV/s&【1985;26:1659 2]TsoMOM,ZhangC,AlblerASApoptosisdstooholoreeep? totdegenerationininheritedretinaldystrophyofRCSrats.? Op~mot忆Sei1994;35;2693. [3]ChaitinMHandHallMODefectiveingestionofrodouter ~gmentsbycultureddystrophicratpigmentepitheliumcells. Invest0蝴mSci1983;24:812 [4]StraussO,SamppffF.MeerS.etalTheRoyalC~llngeof SurgeonsRat:Ananimalmodelforinheritedretinaldegenera? tionwithastillunknowngeneticdefectActaAnat1998; 162:101一I11 [5]SmithMC.Histolnglealfindingsafterhemicerehelleetomyin man:anterngrade,retrogradeandtransneuronaldegeneration BrainRes1975;95(2—3):423—42. [6]WahlinKI,CampaehiaroPA,ZackDJ,AdlerRNeurotrophie factors(=aI|seactivationofjnLr?ce?ularsignalingpathwaysin MflllercellsandotherceBsoftheinneruJ1a.butnotphoto- reeeplors.hu~st却mfSci2000;41(3):927—36 TheNeuronalDegenerationintheInnerNuclearLayerofRCSrat ZHANGChun一,WANGWei,SillJing (DepartmentofPathology,yaleUniversity,SchoolofMedicine,NewHaven,CT06510.US A DepartmemofOphthalmology,ThirdHospital,PekingUniversity,Beijing100083,China) Abstract:Obj~tive:Todetermlnethe口—ldeg~mfioninthej… lMIehayerelRCSlt.Methods:The~tlnalfi~ue…uetedfromRCSratswith ages咖日edfrom1吕.20,28.,42.45,56.60,70tol00daysTheretin~normalage-retchedSDr 山鼬Hed船controlLmmunshlat~hemicalm~arodw船 plied10Labelhorizontaleeli,rodbipolarcUsand~finethvusingmlin?口calbindin.PKCamdeal~tinin,~peetive[yMoq~omeaicstudy—also dResuhs:ComparingwithaonmlSDmm,.~tlnaldegenerali~.includingo~te[andi…I?la~ersohse~edinRCSmjmafterpost. mtal18—20day.Morl~orneaficstudyshowed山n…losshminmudus且Itpost~tal60days.I帼sofrodbioo]~cellsafter20days.and】嘴samae一 …IIs加一35dayintheinnernuclearofRCSi'als.C~laslons:Our~saltsindicatedthau化is~uronalge口哪inthe…rreIjna0fRCS lt.T~euronaldegenerati~mybethenlb呲 Keywo:RCSrat;rmlck盯layer;TI哪?即I讲口曲nI肌