ADR细胞的5型腺病毒感染率研究

ADR细胞的5型腺病毒感染率研究 ADR细胞的5型腺病毒感染率研究 浙江理工大学,第27卷,第5期,2010年9月 JournalofZhejiangSciTechUniversity Vo1.27,No.5,Sept.2010 文章编号:16733851(2010)05—0795—04 K562/ADR细胞的5型腺病毒感染率研究 牛娜,贾晓渊,路巧然,李新,陈磊,陈侃 (浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所,杭州310018) 摘要:腺病毒是目前肿瘤基因治疗研究的常用载体,而5型腺病毒(Ad5)以其复制效率高,栽体容量大等优 势而被广泛用于基因治疗的相关研究.比较5型腺病毒对人白血病细胞K562及其耐药株K562/ADR的感染效率, 并引起这种差异的分子机制.流式细胞术及荧光显微镜观察,结果显示,5型腺病毒对K562/ADR的感染效率 明显高于K562;RealtimePCR定量分析明K562/ADR细胞株表面的CAR表达水平约为K562的1.33倍(P< 0.05),而整合素dv表达则是K562的4.36倍(P<O.01). 关键词:5型腺病毒;K562;K562/ADR;CAR;整合素av 中图分类号:R733.72文献标识码:A 0引言 白血病是造血系统的恶性肿瘤,其发病率在欧美国家为6.14/10万,死亡率居肿瘤的第六位,是严重危 害人类身体健康的恶性疾病之一[.目前白血病的治疗仍以化疗为主,导致白血病化疗失败最主要的原因 是白血病细胞产生的多药耐药性(multidrugresistance,MDR)l2_3l.研究认为MDR产生机制有多个因素参 与],例如P糖蛋白介导多药耐药,细胞解毒功能增强导致耐药,凋亡耐药,微环境耐 药等.阿霉素(adria— mycin,ADR)对治疗白血病有良好效果,但在临床使用中常受到自身毒性以及易产生耐药性的限制_5]. 5型腺病毒是目前基因治疗中较常用的载体,腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到 细胞表面的特异性受体开始的,首先与细胞表面的第一受体CAR(多数为柯萨奇病毒一腺病毒受体,COX— sackie/adenovirusreceptor,CAR)结合l6],然后腺病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD(精氨酸一甘氨酸一 天冬氨酸)再与细胞表面的avI33和ave5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体. 研究表明CAR的表达与肿瘤的生长,预后及腺病毒的减瘤效应有密切的关系l_7],它已成为肿瘤发生发展机 制和治疗领域的热点;整合素(integrin)是一类细胞表面跨膜糖蛋白,在细胞黏附,迁移,增殖与分化及特异 性基因转录调控中起重要作用l8. 本研究旨在探讨5型腺病毒对人白血病细胞K562及其耐药株K562/ADR感染效率的差异,以及引起 这种差异的分子机制. 1材料与方法 l_1材料 重组腺病毒AdS—EGFP,人慢性髓性白血病细胞株K562及其阿霉素耐药细胞株K562/ADR由本实验 收稿日期; 基金项目: 作者简介: 通讯作者: 2009—10—3O 国家自然科学基金(30800093);浙江省重中之重学科开放基金资助(SWYX0821) 牛娜(1984),女,江西萍乡人,硕士研究生,主要从事肿瘤的靶向基因病毒治疗. 陈侃,电子邮箱:chenkan—xjtu@163.tom 浙江理工大学2010年第27卷 室保存.所有细胞在5CO,370C(培养箱中)条件下培养.细胞培养液为含10胎牛血清的RPMI1640 培养基,内含青霉素100U/mI,链霉素100g/mL(以上均购自GIBCO公司),MTT试剂购自SIGMA公 司,Trziol购白Invitrogen公司,ReverTraAceqPCRRTKit,SYBRGreenRealtimePCRMasterMix均购 自TOYOBO公司. 1.2方法 1.2.1MTT法检验耐药细胞株的药物敏感性 取对数生长期的K562和K562/ADR细胞,分别接种于96孔板,1×10/孔,待细胞贴壁后加入不同浓 度的阿霉素(1,2.5,5,10txg/mL),每个药物浓度设5个平行孔,放入培养箱,在37?,5CO.条件下培养, 48h后离心弃上清,分别加入无血清培养基180L和5mg/mL的MTT溶液2OL,37?孵育4h,弃上 清,加入DMSO150L,室温振荡10rain使其充分溶解,测595nm吸光值(OD值).用以下计算细胞 存活率:细胞存活率一(加药组()D值一空白对照组OD值)/(对照组OD值一空白对照组OD值)×100, 绘制细胞存活率曲线,利用该曲线求出抑制细胞生长的药物浓度(IC.)和耐药系数(resistanceindexRI)[RI — IC50(H46Fu)/IC训?6)]]. 1.2.2荧光显微镜观察EGFP的表达 将K562及K562/ADR细胞分别以2×10./:rE接种于24孑L板,每孔含培养液500L,次日每孔加入 Ad5一EGFP1.6×10.vp(virusparticle)感染细胞,每组设3个平行孔,24h后在荧光显微镜下观察细胞绿色 荧光表达情况,来分析检测5型腺病毒感染K562及K562/ADR的能力. 1.2.3流式细胞术检测EGFP的表达 将K562及K562/ADR细胞分别以5×10./孑L接种于6孔板,次13每孑L加入Ad5一EGFP1.6×1Ovp感 染细胞,24h后去掉培养液,PBS洗涤2次,用1mL含2血清的PBS重悬细胞,在流式细胞仪上用480nm 的蓝色光源检测K562及K562/ADR细胞的绿色荧光表达情况. 1.2.4RealtimePCR检测CAR及整合素dv的表达 取对数生长期的K562和K562/ADR细胞分别以5×10/孔接种于6孔板过夜,PBS洗涤2次,加入 Trizol(按10cm/ml比例加入)后,室温放置5min,使其充分裂解;将细胞裂解液转移到1.5mL离心管 中,12000r/min离心5min,弃沉淀;加入氯仿(比例为200L氯仿/mLTrizo1),振荡混匀后室温放置3, 5rain.4~C,12000r/min离心15min.吸取上层水相,至另一离心管中;加人异丙醇(比例为0.5mL异丙 醇/mLTrizo1)混匀,室温放置5,10min;4~C,12000r/rain离心10min,弃上清,RNA沉于管底;加入 DEPC水稀释的75乙醇(比例为1mI75乙醇/mLTrizo1),涡旋震荡;4~C,7500r/min 离心5min,弃尽 上清;真空干燥5,10min;最后用20LDEPC水溶解RNA样品,55~6o~C放置5,1Omin;测OD值定量 RNA浓度. 按照ReverTraAceqPCRRTKit说明书,进行DNA第一链的合成.RealtimePCR检测引物序列如 下: GAPDHF:5GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3 GAPDH—R:5GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3 CARF:5CAGAAGCTACATCGGCAGTAATCA3 CAR—R:5TCTGAGGAGTGCGTTCAAAGTC3 avF:5AGATCTGGACCAGGATGGTT3 Q—R:5ATCTGTGGCTCCTTTCATTG3 所有定量实验均重复3次,各组数据以"均值?差"表示.本实验以GAPDH为参照基因,待测基 因的表达量相对于GADPH为2,(?ct一待测样本ct参照基因ct). 1.2.5统计学分析 统计学软件采用Excel2003,各组数据以"均值?标准差"表示.组问比较用t检验,P<O.05代表差别 显着,P<O.01代表差别极显着. 第5期牛娜等:K562/ADR细胞的5型腺病毒感染率研究 2结果 2.1耐药细胞株的药物敏感性分析 经MTT法检测,得出两种细胞在不同浓度下的存活 率曲线(如图1所示),采用拟合曲线进行回归分析,得出 ADR对K562和K562/ADR的IQ.分别为0.565g/孔 和2.45g/孑L,K562/ADR的RI为4.33. 2.2荧光显微镜下观察EGFP的表达情况 为了比较5型腺病毒对K562及K562/ADR细胞的 感染效率,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况. 结果显示,与K562相比,K562/ADR具有较高的Ad5一 EGFP感染效率(如图2所示). 2.3流式细胞术定量检测EGFP的表达情况 为进一步的检测5型腺病毒A小EGFP对K562与 K562/ADR细胞的感染效率,采用流式细胞术分别检测两 种细胞被病毒感染后EGFP的表达情况.流式结果与荧 薄 姆 性 器 ADR药物浓度/(1~g/mL) — ?一K562,—?l—K562/ADR 图1K562和K562/ADR对ADR的耐药性 光显微镜下观察所得结果一致(图3).从图3可看出,K562细胞有6.4的GFP阳性率,而K562/ADR细 胞此项数据达20.7,所以与K562相比,K562/ADR具有较高的Ad—EGFP感染率. 一图2Ad5一EGFP感染48h后荧光显微镜观察K562与 K562/ADR细胞中EGFP的表达情况(×100) 2.4RealtimePCR检测CAR及整合素(IV的表达 图3流式细胞术检测Ad_EGFP在K562与 K562/ADR中EGFP的表达情况 CAR和整合素OtV的分布和表达数量都影响着腺病毒介导的基因治疗的效果.为了深入了解5型腺病 毒对K562/ADR细胞感染率增高的原因,采用RealtimePCR分别检测了两种细胞CAR及整合素I:lV的表 达.从图4(a)可以看出,K562/ADR细胞CAR表达置覆K562细胞高(P<0.05);从图4(b)看出,K562/ ADR细胞整合素aV表达量较K562细胞高(P<O.01),整合素CtV在两种细胞的差异量要高于CAR. 喜 砉 长 《 细胞系细胞系 (a)K562与K562/ADR细胞CAR的表达(b)K562与KSB2/ADR细胞整合素仅v 的表达 图4Realtime检测CAR及整合素av的表达 浙江理工大学2010年第27卷 3讨论 腺病毒尤其是5型腺病毒,是肿瘤基因治疗最常用的载体,其对肿瘤的治疗效果取决于与靶细胞的结合 能力和进入细胞的数量.腺病毒的外壳蛋白是病毒结合和内化的基础,因而对这些蛋白的修饰可以改变腺 病毒进入细胞的途径[9j.腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开 始的,首先与细胞表面的第一受体CAR结合,然后腺病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面 的avl33和av5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体.CAR是一种相对分子量 为4600的I型跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族l1,是腺病毒在细胞表面的严格的锚定位点,与腺病毒 有极高的亲和力,但它在不同的组织细胞中表达并不相同,有报道指出有些肿瘤细胞对重组腺病毒的转染不 敏感,如胰腺癌,肾细胞癌,乳腺癌,血癌等[1113]. K562/ADR为人慢性髓系白血病阿霉素耐药株,其耐药性的产生主要与多药耐药基因MDR1的高表达 有关,而K562/ADR与K562相比对5型腺病毒的敏感性有何变化,目前尚未见报道.在本研究中,通过荧 光显微镜的观察和流式细胞术的检测结果发现5型腺病毒对K562/ADR有较高的感染率,因而推测,人白 血病阿霉素耐药株K562/ADR细胞表面的腺病毒受体可能发生了变化,通过RealtimePCR检测发现,与 K562相比,K562/ADR细胞表面的CAR表达水平约为K562的1.33倍(P%0.05),而整合素av表达则是 K562的4.36倍(P<O.01).因而推测,K562/ADR具有较高的5型腺病毒感染率, 是与其细胞表面整合素 av高表达有关,因为整合素是通过构型改变对细胞内外的刺激作出反应,并进行双 向跨膜信号转导,在细胞 黏附,迁移,增殖与分化及特异性基因转录调控中起重要作用,从而为应用5型腺病 毒治疗白血病耐药提供 了实验基础. 参考文献: E1]干定云,陈燕.慢性粒细胞白血病分子靶向治疗的新进展[J].临床血液杂 志,2006,19(3):190—192. [2]NooterK,HerweijerH.Muhidrugresistance(MDR)genesinhumancancer[J].BrJCancer,1991,63(5):663—669. [3]TakaraK,SakaedaT,OkumuraK.AnupdateonovercomingMDR1一 mediatedmuhidrugresistanceincancercheroothera— py[-J].CurrPhamDes,2006,12(3):273—286. [4]()hEJ,KahngJ,KimY,eta1.Expressionoffunctionalmarkersinacutelymphoblasticleukemia[J].LeukRes,2003,27 (10):903—908. 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Keywords:proteasomeinhibitor;Hep3Bcells;apoptosis;ERstress;Caspase-12 f责任编辑:许惠儿) (上接第798页) ResearchontheInfectionEfficiencyofAd5inK562/ADR NIUNa,-,,AXia—yuan,LUQiao-ran,LIXin,CHENLei,CHENKan (XinyuanInstituteofMedicineandBiotechnology,SchoolofLifeSciences, ZhejiangSci—TechUniversity,Hangzhou310018,China) Abstract:Adenovirusisacommonlyusedvectorinresearchofcancergenetherapyatpresent,while theadenovirustype5(ADS)hasbeenwidelyusedforitshighreplicationefficiencyandhighca pacity?In thispaper,theinfectionefficiencyofadenovirustype5iscomparedinhumanleukemiacellK562andthe drug-resistantce11strainK562/ADR,andanalyzesthemolecularmechanismthatcausesthisdt1n? Theresuitsofflowcytometryandfluorescencemicroscopephotographsbothshowthephenomenathatthe infectj.nefficiencyofadenovirustype5inK562/ADRishigherthanthatinK562.Inaddition,theCAR levelinK562/ADRisabout1.33timesofthatinK562(P<0.05),andtheexpresslonlevelofngn is4.36timesofthatinK562(P<0.01). Keywords:adenovirustype5;K562;K562/ADR;CAR;integrin0【V f责任编辑:许惠儿)