盲襻综合征大鼠D-,L-乳酸和短链脂肪酸的代谢

盲襻综合征大鼠D-,L-乳酸和短链脂肪酸的代谢 盲襻综合征大鼠D-,L-乳酸和短链脂肪酸的 代谢 第14卷第4期 2007年7月 肠外与肠内营养 Parenteral&EnteralNutrition ? 201? Vo1.14No.4 Ju1.2O07 ? 论着? 盲襻综合征大鼠D一,L一乳酸和短链脂肪酸的代谢 谭力,周济宏,王羽,赵小平,李幼生,刘放南 (南京军区南京总医院解放军普通外科研究所,江苏南京2100002) 摘要:目的:研究盲襻综合征大鼠血浆D-,L.乳酸和短链脂肪酸代谢的变化.方法:建立大鼠盲襻综合征模型, 将大鼠分为对照组(假手术组)和实验组(盲襻组).于术后第1,2.3和4周分批处死大鼠,取肠液行细菌培养计 数,取静脉血进行血常规和生化以及D-,L-乳酸和短链脂肪酸.结 果:与对照组比较,实验组大鼠体质量明 显减轻,术后4周出现血红蛋白水平下降(P<0.05),平均红细胞体积 增加(P<0.01),血清总蛋白水平降低(P< 0.01),清蛋白水平降低(P<0.05).实验组血浆D-,L-乳酸和短链脂肪 酸水平随着时间的延长而显着上升,在第4 周时均显着高于对照组;肠液菌落数2周后>1.0×10/mL,4周后达 1.1×10/mL.结论:盲襻综合征大鼠血浆 D-,L-乳酸和短链脂肪酸水平明显升高,能较好地反映肠液菌群的增 殖程度. 关键词:D.,L.乳酸;短链脂肪酸;盲襻综合征;大鼠 中图分类号:R459.3文献标识码:A文章编 号:10o7-810x(2oo7)04-0201-04 ThemetabolismofD-.L-lacticacidandshort-chainfattyacidsinblindloopsyndromerats TANLi,ZHOUJi-hong,WANGYu,ZHAOXiao-ping,LIYou-sheng,LIUFang-nan (ResearchInstituteofGeneralSurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PL4, Nanjing210002,Jiangsu,China) Abstract:Objective:ThestudywasdesignedtoinvestigatethemetabolismofplasmaD,L-lacticacid andshort-chainfattyacidsinbhndloopsyndromerats.Methods:Firstly,ablin dloopsyndromerat modelWasestablished.MaleSprague-Dawleyrats(250—350g)wererando mlyassignedtotwogroups: shamoperationgroupandblindloopsyndrome(BLS)group.Ratsweresacrificedonpostoperativeday 7,14,21and28.ThebacteriainbowelfluidWasculturedandcounted.Bloodroutine,serumbiochem— icalcheckingandsenllTllevelsofD..L.1acticacidswereanalyzed.Results:Fourweeksaftertheopera. tion,allbhndloopratshadlittleweight-gettingthantheshamoperatedanimals,andhadlargermean corpuscularvolume(P<0.O1),smallerhemoglobin(P<0.05),lowerserumtotalproteinCP<0.01) andloweralbumin(P<O.05)thantheshamoperatedanimals.BLSratsplasmaD-,L-lacticacidsand short-chainfattyacidslevelsweresignificantlyincreased(P<0.01).Bacteriagrewquickly,whichat— tainedto1.0×10/mLonpostoperativeday14andto1.1×10’/mLonpostoperativeday28inBLS group.Cone/us/on:TheincreasinglevelsofplasmaD-,L-lacticacidandSCFAinBLSratscouldre— flectthedegreeofbacterialovergrowthinbowelfluid. Keywords:Lacticacid;Short-chainfattyacid;bhndloopsyndrome;rat 收藕日期:2006-09-04;修订日期:2007-01?10 作者简介:谭力(1962.),女,江苏南京人,副主任技师,理学博士,从事分析化学专业. 肠外与肠内营养2007年7月第14卷 0引言 盲襻综合征(blindloopsyndrome,BLS)是指 小肠襻的内容物淤滞,细菌过度繁殖而造成的吸 收不良综合征.1959年,Reilly_1和Card_2首次提 出BLS的概念.随后,许多学者对BLS的临床诊 断,症状,治疗及病因做了大量的研究,认为是因 肠道细菌大量增殖而导致肠内环境的改变J,其 中主要的变化包括短链脂肪酸(SCFA)含量升高, 已成为肠道细菌增殖的重要指标J.在肠液中 SCFA浓度升高,引起pH值下降,酸性环境可使耐 酸的菌种如乳酸杆菌大量繁殖,产生D.,L哥L酸, 尤其是D哥L酸被吸收入血,致使体内D.,L哥L酸浓 度明显地升高J,但其确切的机制并不清楚.因 此,我们希望通过实验,揭示BLS在形成过程中大 鼠的生长状况,小肠细菌的增殖程度与血浆中SC. FA,D-,L-乳酸,尤其是D哥L酸代谢变化之间的关 系,从而为BLS的患病机制及临床诊断提供帮助. 1和方法 1.1实验动物健康sD大鼠(购于中国科学院上 海实验动物中心).体质量为250—350g,普通饲料 喂养.随机分为两组,对照组(假手术组)仅行腹壁 切开和缝合;实验组(盲襻组)行空肠造襻手术.无 损伤缝合线(5-0,上海医用缝合针厂生产),一般手 术器械,氯胺酮注射液. 1.2手术方法大鼠术前禁食24h,自由饮水.用 1%氯胺酮100mg/kg腹腔麻醉.腹部剃毛备皮. 取上腹部正中切口,长2cm.距Treitz韧带20cm 处横断空肠,近端闭合关闭,远端留作吻合.于 Treitz韧带下5cm处对系膜缘肠壁0.5cm纵行切开 空肠,与预留空肠远端作吻合.5-0无损伤缝合线 全层缝合4—6针.1号丝线两层缝合关腹.单笼 饲养,术后禁食24h,自由饮5%葡萄糖盐水,日后 用普通饲料喂养.对照组大鼠术前,术后及麻醉方 法同实验组,仅行与实验组相同的剖腹和关腹手术. 1.3观察指标术后每天称体质量,并观察粪便情 况.分别于术后1,2,3和4周用乙醚麻醉大鼠,剖 腹获取标本.见腹腔粘连不明显,无腹水.盲襻肠 段在术后1周增粗,直径为1.5—2.0cm,长为14— 17cm,充满肠液及未消化的食物. 1.3.1血常规和生化检查各取静脉血1mL,采 用自动血常规仪和自动生化仪检测. 1.3.2小肠液细菌计数取盲襻内肠液1mL,稀 释1万倍,于培养皿中培养48h,计数菌落. 1.3.3血浆D-,L碍L酸的测定取静脉血1mL,肝 素化,离心后取上清液即获血浆.采用Tan等_6建 立的测定方法. 1.3.4血浆短链脂肪酸的测定取静脉血1mL, 肝素化,离心后取上清液即获血浆.采用Tan等[7] 已建立的测定方法. 1.4统计学方法所有数据以SPSS11.5软件进 行统计分析,结果以均数4-差(4-s)表示,组间 差异以单因素方差分析法分析,以P<0.05为差异 有显着性统计学意义,P<0.01为差异有非常显着 性统计学意义. 2结果 2.1体质量变化与术前相比,实验组大鼠术后3 d体质量下降(7.24-2.6)g,3d一1周体质量增加 (17.64-2.5)g,1—2周体质量增加(13.24-4.3)g, 2—3周增加(4.74-2.5)g,3—4周降低(6.34- 4.8)g;对照组大鼠与术前相比,术后3d体质量下 降(3.54-2.2)g,3d一1周体质量增加(12.44- 5.3)g,1—2周增加(30.34-3.1)g.3d后实验组 大鼠体质量明显低于对照组(P<0.05). 2.2肠液茵落数的变化实验组盲襻小肠液内菌 落总数随时间的延长而逐渐增加,见表1. 2.3血浆D-,L-乳酸变化随着实验周期的延长, D-,L哥L酸都有所增加,特别是第4周,实验组D., L哥L酸不仅与对照组相比,有非常显着的升高,而且 与第1周相比也有非常显着的升高,见表2. 表1不同时间盲襻小肠液细茵计数(CFU/mL) Table1Measurementofbacteriainsmallintestinaljuiee (CFU/mL) 时间 1周 2周 3周 4周 表2两组大鼠不同时间血浆D-,L-乳酸浓度(mmol/L) Table2PlasmaD,L-lacticacidsconcentration(mmol/L) 与对照组相比,?P<0.05.??P<0.O1;与1周相比. 撑P<O.05.槲P<O.O1 一OOO 数一×××一OO5l菌一 一6889细一mmmm 一×××× 一O95l —l24l 第4期谭力,等盲襻综合征大鼠D.,L.乳酸和短链脂肪酸的代谢?203? 2.4血常规和生化指标的变化与对照组相比,实 验组大鼠第1,2和3周血红蛋白,平均红细胞体积, 血清总蛋白,清蛋白和球蛋白均无显着变化(P> 0.05);实验组第4周时,血红蛋白水平下降明显(P <0.05);平均红细胞体积显着增加(P<0.01);总 蛋白水平明显下降(P<0.01);其中清蛋白和球蛋 白水平均显着下降(P<0.05),见表3. 2.5血浆短链脂肪酸的变化不同时期BLS大鼠 的SCFA含量均比对照组高,而且随时间的延长 SCFA含量逐步升高.在第4周时,乙酸,丙酸和 丁酸与对照组相比具有显着性差异(P<0.05),见 表4. 表3两组大鼠不同时间血常规和生化指标 Table3Bloodroutineandsel’lllnbiochemicalchecking 与对照组比较,}P<O.05,#P<O.01 表4两组大鼠不同时间血浆短链脂肪酸浓度(g/L) Table4PlasmaSCFAsconcentration(L) 与对照组相比.?P<O.05 3讨论 BLS大鼠的模型很难建立,国外通常采用的方 法是距Treitz韧带10cm作长度为10cm的自动充 盈空肠盲襻_2],术后6,8周建成模型,大鼠死亡率 高.为了缩短实验时间,我们在该模型的基础上进 行了改良,将盲襻长度增加到15cm,盲襻口距Tre— itz韧带肠段缩短至5cm.目的是增加盲襻肠管的 贮留量,以利于细菌增殖,促进BLS早日出现.实 验结果发现,实验组术后1周,盲襻液菌落数达到 1.0×10/mL,2周后增加至2.9×10/mL,出现 了细菌过度繁殖.术后4周时,出现巨细胞贫血,低 蛋白血症和体质量停滞或下降等表现,BLS造模成 功.我们的方法比原方法缩短了2,4周,增加盲襻 肠管5cm,也就意味着有效小肠缩短了5cm,大鼠 空,回肠总长约为60cm,术后保存有效小肠为40, 45cm,占65%,75%,术后动物无明显腹泻,无血 电解质紊乱,可排除短肠综合征.我们用这种方法 建立的大鼠模型,具有典型的BLS表现,是较理想 的BLs模型. Chemov等最初报道,小肠细菌大量增殖的 病人,空肠液中含有高浓度的乙酸,丙酸和丁酸,无 其他短链脂肪酸.随后的实验研究却发现,在小肠 细菌大量增殖的病人,空肠液中除有乙酸,丙酸和丁 酸外,还有少量可再生的异丁酸,异戊酸和n.戊 酸.我们通过实验发现,BLS大鼠肠液菌群大量 增殖,血浆SCFA和D一,L哥L酸的水平随着时间延长 和肠液细菌数的增加而升高,尤其在术后第4周,血 浆SCFA和D一,L-孚L酸水平都有显着的增加,其中血 浆中乙酸,丙酸和丁酸的水平均显着高于对照组,而 异丁酸和异戊酸无显着性差异.这与肠液中SCFA 的生成情况相一致.肠液中SCFA主要通过主动扩 散被吸收入血,并且其吸收率随着底物浓度的增加 而增加.说明血浆中的SCFA的浓度可反映肠液菌 群增殖的程度.我们的4周实验观察中,肠液细 菌数逐渐增加,到第4周时达到1.1×10.然而,.血 浆SCFA的浓度在前3周虽也有所增加,但无显着 性差异,直至第4周后,血浆SCFA水平显着升高, 说明大鼠行盲襻手术约4周之后,肠液细菌数增殖 至约10m时,血浆SCFA才发生了明显的变化.因 此,血浆SCFA的变化,为今后BLS病程和病情的临 床诊断及治疗效果的评价,提供了有力的依据.同 时,实验结果还揭示了乙酸是血浆SCFA的主要组 成,占总量的9o%以上.Prizont等通过实验研 肠外与肠内营养2007年7月第14卷 究,解释这种现象可能是乙酸优先被肠道吸收的结 果.但目前我们对SCFA吸收机制的认知,如非离 子型的主动扩散(尽管SCFA通过细胞脂质膜的主 动扩散率随着链长的增加而降低)和离子型交换等 还不能充分证实优先吸收的假设.另外,一些存在 于小牛肝和兔肠道的代谢酶是调控血浆和肠液中 SCFA的重要因素?2-n.实验中我们发现,大鼠行 造襻手术2周后,就有肝损伤现象如转氨酶升高. 这可能会影响SCFA和D一,L一乳酸的代谢,也可能是 引起血浆SCFA和D一,L一乳酸水平升高的机制之一. 还有文献报道,病人盲襻部的SCFA达到100mmol/, L时,会引起腹泻?.本实验第4周后,血浆中的 乙酸浓度达到248p.g/mL,如此高的酸浓度会引起 血浆pH下降,H增多,可能会引起代谢性酸中毒, 提示应引起临床重视,及时纠正酸中毒. 大量的文献报道,SCFA与肠道细菌有密切关 系,并且SCFA的量决定了D一,L一乳酸的产生.从而 推测D一,L哥L酸的量可间接反映肠道细菌的增殖情 况.但有关D一,L一乳酸和肠道细菌增殖情况的实验 研究较少,我们通过观察BLS大鼠形成过程中细菌 增殖和血浆中D一,L一乳酸的代谢变化,证明其水平 与细菌增殖程度相关性较好,血浆D一,L一乳酸的代 谢变化与肠道细菌的增殖程度密切相关,D一,L一乳酸 的量可间接反映肠道细菌的增殖情况.另一方面, D一乳酸是细菌发酵的代谢产物,血中的D一乳酸基本 上来源于肠道,其水平的变化与肠通透性密切相关. 当肠黏膜生物屏障受损时,肠道中细菌产生的D一乳 酸通过受损肠黏膜经循环人血,而哺乳动物无D一乳 酸脱氢酶,在D-2一羟酸脱氢酶(D-2一HDH)作用下代 谢为丙酮酸,但全身清除率低,只有L一乳酸的1/5. 所以,小肠黏膜上皮糜烂,坏死,固有层间质血管扩 张,充血,水肿和炎性细胞浸润,其严重程度与血浆 D一乳酸水平一致.在本实验中血浆D一乳酸浓度逐 渐升高,并在第4周时,显着升高,其原因可能是细 菌逐渐增殖导致血中D一乳酸的逐渐升高.第4周 时血浆D一乳酸显着升高,可能是肠黏膜受损,通透 性增加使得大量D一乳酸被吸收入血,实验中确实发 现大鼠盲襻肠黏膜存在损伤.因此,测定血浆D一乳 酸的水平,对BLS细菌增殖情况和肠黏膜损伤的评 价都有十分重要的意义.但血浆D一乳酸的水平是 否能准确评价BLS肠黏膜损伤程度,仍需进一步验 证.血浆中D一,L一乳酸的含量比对照组提高了很多 倍,从理论上讲L一乳酸的量已经能引起代谢性酸中 毒,而D一乳酸的量尚不能引起D一乳酸酸中毒.短肠 综合征并发D一乳酸酸中毒在临床已有报道,并引起 了足够的重视?.但BLS并发D一乳酸酸中毒的 临床报道较少.本次实验证明,BLS会引起血浆D一 乳酸水平的显着升高,有并发D一乳酸酸中毒的危 险,要引起临床的足够重视. 本实验研究结果证实,在大鼠BLS的形成过程 中,血浆D一,L一乳酸,乙酸,丙酸和丁酸等短链脂肪 酸的代谢发生了极大的变化,证明血浆D一,L一乳酸 和短链脂肪酸的代谢与肠道细菌的增殖密切相关. 参考文献: [1]aeillyRW,Kirsner/B.Theblindloopsyndrome[J].Gastroen— terology,1959,37(6):491494. [2]CardWI.Blindloopsyndrome[J].ProcRSocMed,1959,52 (1):28-31. [3]JustusPG,MeherronLE,Ward”IT.Alteredmotilityandduration ofbacterialovergrowthinexperimentalblindloopsyndrome[J]. DigDisSci,1984,29(7):643-648. [4]KingCE,ToskesPP.Smallintestinebacterialovergrowth[J]. Gastroenterology,1979,76(5Pt1):1035—1055. [5]孙晓庆,付小兵,张蓉,等.创伤后肠道通透性改变血浆标 志物D乳酸的实验研究[J].ChineseCriticalCareMedicine, 2000,12(8):476-478. [6]TanL,WangY,uuXQ,eta1.SimultaneouseterminationofL— andD—lacticacidinplasmabycapillaryelectrophoresis[J].J ChromatogrB,2005,814(2):393-398. [7]TanL,ZhaoXD,LiuXQ.eta1.Headspaeeliquid—phasemicroex- chainfattyacidsinplasmaandgasehromatogra- tractionofshort— phy—flameionizationdetection[J].Chromatographa,2005,62 (2):305-309. [8]ChemovAj,DoeWF,GompertzD.Intrajejunalvolatilefattyacids inthestagnantloopsyndrome[J].Gut,1972,13(2):103—106. [9]HoverstadT,BjomeldettA,Fausa0,eta1.Short—Chainfatty acidsinthesmall-bowelbacterialovergrowthsyndrome[J]. SeandJGastroenterol,1985,20(4):492-499. [10]SallecVL,DietschyJM.Determinantsofintestinalmucosalup— take0fshortandmedium—chainfattyaeidsandalcohols[J].J LipidRes,1973,14(4):475_484. [11]PrizontR,WhiteheadJs,KimYS.Shortchainfattyacidsinrats withjejunalblindloops[J].Gastroenterology,1975,69(6): 1254—1264.. [12]AshR,BairdGD.Activationofvolatilefattyacidsinbovineliver andromenepithelium.Evidenceforcontrolbyautoregulation [J].BioehemJ,1973,136(2):311-319. [13]HenningSJ,HirdFJ.Ketogenesisfrombutyrateandacetatebythe caecumandthecolonofrabbits[J].BioehemJ,1972,130(3): 785-790. [14]BustosFernandezL,GonzalesE,MagiA,eta1.Fecalacidorrhea [J].NEnglJMed,1971,284(6):295-298. [15]MathiasJR,FranklinR,Q.astDC,eta1.Relationofendometriosis andneuromusculardiseaseofthegastrointestinaltrot:newin— sights[J].EndometriosisandFunctionalBowelDisease,1998,70 (1):81-88. [16]谭力,罗楠,刘放南,等.非衍生化气相色谱法测定人血 清游离脂肪酸谱[J].肠外与肠内营养,2003,10(4):236— 238.