不同品种猪α1-岩藻糖转移酶基因遗传变异初析

不同品种猪α1-岩藻糖转移酶基因遗传变异初析 不同品种猪α1-岩藻糖转移酶基因遗传变异 初析 中国畜牧杂志2OO4年第40卷第3期 不同品种猪1.岩藻糖转移酶 基因遗传变异初析 晏学明,郭源梅,丁能水,任军,黄路生 (江西农业大学江西省动物生物技术重点开放实验室,江西南昌330045) 摘要:本实验采用PcR-RFLP对5个瘦肉型猪种杜洛克,长白猪,大白猪,汉普夏猪和皮特兰猪共计250头猪 的al一岩藻糖转移酶基因(兀m)进行多态性.结果明:本研究中的5个猪种在该FUrl基因座位存在多态 性,均分布着三种基因型(AA,AG和GG),抗性基因型从分布频率为0,028,易感基因型AG与GG分布频率分别为 0.244和0.728.卡方检验结果表明,长白猪与大白猪基因型频率差异极显着(P<0,O1),与皮特兰猪之间差异显着 (P<0.05),其它猪种之间差异均不显着. 关键词:畜牧,兽医科学基础学科;遗传变异;a1.岩藻糖转移酶基因;大肠杆菌F18;猪 中图分类号:S828.2文献标识码:A文章编 号:02587033(2OO4)03.0008.03 肠毒素大肠杆菌F18(EntemtoxigerlicEscherichia coliF18,ECF18)是引起仔猪断奶后水肿和腹泻病的 主要病原菌…1.ECF18通过其黏附素黏附于仔猪小 肠黏膜上皮细胞刷状缘,产生类肠毒素,通过渗透, 引发组织胺的释放,导致血管壁损伤,水分大量渗出 而引起水肿和腹泻病J.4,12周龄仔猪因此病原 菌感染的发病率为30%,40%,发病仔猪死亡率为 40%,有时甚至高达90%…,这在养猪业中造成了 极大的经济损失.ECF18能否致病决定于仔猪小肠 黏膜上皮细胞刷状缘有无受体.研究表明,a1.岩藻 糖转移酶基因(a1fucosytransferaseFUT1)可作为 ECF18受体蛋白的候选基因.FUTl基因中存在一 个G/A点突变位点,从型为ECF18抗性猪,GG型 为易感猪,等位基因G对A是显性.3J,据此鉴别育 种群个体的FUT1基因型,通过标记辅助选择(Mark. er.assistantselectionMAS),进行抗病遗传育种,可望 培育出抗仔猪水肿和腹泻病的猪群.本文旨在通过 PCR.RFLP方法分析不同猪种FLJT1基因遗传多态 性,为培育新的抗病猪品系提供一定的科学依据. 1材料与方法 1.1实验材料采用随机抽样,采集5个瘦肉型猪 种250个体(见表1)的耳组织块为实验材料,用于 基因组DNA的提取. 收稿日期:2OO2—12—20;修回日期:2003-06.24 基金项目:国家自然科学基金(3o06o058)资助 *通讯作者 1.2方法 1.2.1DNA提取:猪耳组织DNA的提取方法参照 文献[5]. 1.2.2PCR扩增:PCR引物依据参考文献[6]设计, 由上海生工合成.引物序列如下: P1:5一CTI’CAGCCAGG0c1=‘CC1r兀’AAG.3 P2:5.CTGCCTGAACGTCrAT?从GACC一3 PCR反应体系为25,其中基因组DNA100 ng,引物0.25ttmol,dNTPs为0.2mmol,Taq酶为1U, 1xPCRBuffer(10mmolTns—HC1pH8.4,50mmol KC1,0.1%TritonX100),MgCl2为1.5mmol.PCR反 应条件:95?3min;94?45S,56?45S,72?45s, 36个循环;最后72~C延伸7min. 1.2.3Hin6I限制性内切酶消化:PCR产物的酶切 反应体系:取10皿PCR产物,加入0.1ktL(10units/ )的限制性内切酶Hin61,2L的10×BufferY/ TANqoTM(33mmolTfis.acetatepH7.9,10mmol MC,,66mmolKAC,0.1mg/mLBSA),加灭菌水至 总体积为20,37~C温浴3,5h或过夜. 1.2.4电泳检测:PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电 泳检测.酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶以5V/cm 的电压电泳检测,紫外透照台观察结果并拍照. 2结果与分析 本实验的FUrI11基因扩增片段长度为421bp,在 其开放阅读框的第307bp处存在一个点突变,即G突 变成A,从而失去一个Hin6I酶切位点.PCR产物经 限制性内切酶Hin6I酶切后,产生多态图谱.FUT1一 中国.|i投毒志2OO4年第40卷第3期 Hin6I.RFLP电泳图谱如图1所示,等位基因G存在两 个Hin6I酶切位点,可产生241bp,93bp和87bp三种 酶切片段;而等位基因A只有一个Hin6I酶切位点, 产生328bp和93bp两种酶切带型.5个猪种的 FUT1基因型和等位基因分布频率结果列于表1. 328bp 241bp 93bp 87bp 图l猪刚l基因的PCR-RFLP结果 第1,2,3,4,5,7,8,9泳道为GG基因型,第6,10,11泳道为AG型 M为G?eRul50bpDNALadd~l”marker 由表1结果分析可知,在这5个猪种中,均分布 着三种基因型:从,AG和GG,且GG型均为优势基因 型,等位基因G为优势基因.在不同品种猪中易感 AG和GG型均占绝对优势(97.2%),而抗性从型仅 为2.8%.表2分析结果表明,长白猪与大白猪基因 型频率差异极显着(P<0.01),与皮特兰猪之间差异 显着(P<0.05),其它猪种之间差异均不显着. 表2不同猪种FUrl基因型分布卡方检验表 注:DR:杜洛克;LJ):长白猪;LW:大白猪;frr:皮特兰;liP:汉普 夏;*:P<0.05,**:P<0.01 表1不同猪种FUrl基因的基因型频率及其等位基因频率 3讨论 本实验对5个瘦肉型猪种检测结果表明,这些 猪种在FUrI’1基因开放阅读框的307座位均存在不 同程度的多态性,可清楚地区分为三种基因型即 AA,AG和GG型,其分布频率分别为:0.028,0.244 和0.728.等位基因A和G的基因频率分别为0.15 和0.85.根据Meijerink等lJ及Vogeli等l的报道, FUT1基因型为从型的猪抗大肠杆菌F18(ECF18), 而AG与GG型猪对ECF18易感,在其所检测的部分 猪种中抗性从型猪基因型频率小于5%,本实验结 果与其基本相符. 卡方检验结果表明,总体而言,这5个猪种之间 FUT1基因型分布频率差异均不显着,这与它们之间 在抗仔猪水肿与腹泻病能力方面相差不大的表型一 致.同时长白猪与大白猪,皮特兰猪基因型频率差 异分别为极显着(P<0.01)与显着(P<0.05),这与 长白猪在抗水肿与腹泻病方面比大白猪和皮特兰猪 相对差些的现象相符. 大肠杆菌F18能否引起仔猪断奶后水肿与腹泻 病,在于其进入仔猪小肠后能否在小肠黏膜上皮细 胞上黏附并产生肠毒素,而能否黏附的关键在于小 肠黏膜上皮细胞有无ECF18受体,Vogeh等l3J的研 究结果表明,ECF18受体蛋白基因位于猪的Chr6q”, 与血型抑制因子s及RYR1座位紧密连锁,其重组 率分别为e=0.05%和3.1%.而FUrI’1基因是 ECF18受体蛋白基因的最佳候选基因l3’4J,其多态性 检测方便,分析清晰,这为通过标记辅助选择开展抗 仔猪水肿与腹泻病的抗病遗传育种提供了可能. Klukowskal]的研究表明,在Zlotnicka花斑猪中 抗性基因A的频率为0.63,并认为地方猪种是进行 抗ECF18病原菌的有效种质资源.我国有着极为 丰富的地方猪种资源,下一步有必要对中国地方猪 种FUT1基因遗传变异及遗传多态性与抗病性状之 间的相关性作深入研究. 致谢:本实验在采样过程中承蒙各猪场及其上 级主管部门的大力支持与帮助,在此深表谢意! 参考文献: [1]ImberchtsH,DeGreveH,SchlickerC,da/.EJ].Infect IlffllWfll/1.1992.60(5)g1963—1971. 中国畜牧杂志2O04年第40卷第3期 体外成熟培养2022h牛卵母细胞激活及 孤雌发育的研究 罗光彬,金花子,郑英彩,金昌根 (1.沈阳农业大学畜牧兽医学院动物科学系,辽宁沈阳110161;2.延边大学农 学院动物科学系,吉林延边133400;3.韩国中央大学校产业科学大学动物资源科学科,韩国安城456—756) 摘要:本研究将体外成熟培养20,22h的牛卵母细胞,用Ca2+上升因子单一激活或组合Ca2+上升因子和蛋白质 抑制因子激活,其结果单一激活的卵子激活率在19.2%,28.O%,复合激活的卵子激活率在84.2%,86.8%.单一 激活组的卵子激活率显着高于对照组(P<0.05),复合激活组的卵子 激活率显着高于单一激活组(P<0.O1),而单 一 激活组之间和复合激活组之间无显着差异(P>0.05).复合激活组的卵裂率及孤雌发育都显着高于对照组. 关t词:畜牧学;牛卵母细胞激活;体外成熟;孤雌发育 中圈分类号:$823.3;$814.4文献标识码:A文章编号:0258.7033(2004)03—0010-03 受体卵子激活率高低与克隆胚胎的成功率有直 接关系.牛卵母细胞体外成熟培养20,24h后,体 外受精率较高,但将这些成熟卵子单独用ca2上升 因子[如低温处理,乙醇,直流电脉冲,钙离子载体 (Ca-ionophore)等]处理时,则不容易引起卵子激活. 这是因为在卵细胞质中含有高活性的促成熟因子 (maturationpromotingfactor,MPF).牛卵母细胞在单 收稿日期:2003-03-03;修回日期:2003-07.31 一 激活处理时,其激活率高低依赖于卵子体外成熟 时间的长短[1,.体外成熟时间30h开始卵子的激 活率明显上升,40h可得到90%以上的卵子激活 率[,引.因此,核移植时都采用体外成熟时间(44h) 长的卵子.然而,使用体外成熟时间长的卵子作为 受体时,核移植卵的发育率比体外成熟时间短的受 体卵子明显降低[,.将ca2上升因子与放线菌酮 (eyeloheximide)合并使用时,即使是体外成熟时间较 短的卵子,也可以得到很高的卵子激活率,但是有 [2]施启顺,谢新民,柳小春,等.[A].中国动物遗传育种研(第2版)[M]. 金冬雁,黎孟枫,候云德,等.北京:科 究(第十一次全国动物遗传学术会议论文集)[C.北学出版社,1998. 京:中国农业科技出版 社,2001.[6]MeijerinkE,FriesR,VogehP,eta/.1JJ.Mamm [3]VogefiP,BertschingerHV,StammM,eta/.1J].AnimGenome,1997,8:736 -741. Genet,1996,27(5):321.328.[7]VogeliP,MeijerinkE,FriesR,eta/.[J].Schwe izArch [4]MeijerinkE,NeuenschwanderS,FriesR,eta1.[J.Im—Tierheik,1997,13 9(11):479_48_4. munogeneties,2OO0,52:129—136.[8]KlukowskaJ,UrbaniakB,SwitonskiM.:J].JAnim [5]SambrookJ,FritsehEF,ManiatisT.分子克隆实验指南 BreedingGenet,1999,116(6):519—524. StudyOntheGeneticVariationofet1.fueosytransferaseGeneinI~l’erentPig Breeds YANXue—ming,GUOYuan—mei,DGNeng—shui,RENJun,删 ANGlm—sheng (JiangxiProvincialKeyLaboratoryforAnimalBiotechnology,ji~xiAgriculturalUniversity,ji~xiNanc}laflg330045) Abstra~:111egeneticvariationofal—fueosytransferase(FUT1)genein250 pigsfrom5westerneommemialpigbreeds includingDuroc,[andrace,【丑聊 lite,HampshireandPietminwereinvestigatedbythemeansofPcR一 ?’.ItWaS demonstratedthatdiffemntgenotypes(AA,AGandGG)ofthisFUT1locushavebeendetectedinthe5p唔breeds.e frequencyofresistancegenotypeAAWaS0.028.andthatofsusceptibilitygenotypeAGandGGWaS0.244and0?728, respectively.111eresultofChiSquaretestshowedthatthedifferenceofgenefrequencybetweenl_an&aceand itewasgreatlysignificant(P<0.01),l_,andraeeWaSsignificantlydifferent(尸<0.05)toPietmin,andthereWaSno differenceamongotherpigbreeds. Keyword~:AnimalandveterinaryscieBeebasaldisciphnes;Geneticvariation;al—fucosytransferasegene;EcohF18;pig