分子标记辅助育种技术

分子标记辅助育种技术 分子标记辅助育种技术是在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等重要作物上，通过利用与目标性状紧密连锁的 DNA 分子标记对目标性状进行间接选择，以在早代就能够对目标基因的转移进行准确、稳定的选择，而且克服隐性基因再度利用时识别的困难，从而加速育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种。 (一)发展回顾 我国的农作物分子标记辅助育种的研究始于90年代初，在过去的近十年时间里，取得了重要的研究进展:1.构建了水稻等作物的染色体遗传图谱;2.构建了水稻染色体物理图谱;3.利用分子标记对我国作物种质资源遗传多样性进行了初步的研究;4.对一些重要的农艺性状进行了定位、作图与标记，相应的基因克隆已在进行。 在基因组开展以来的短短的几年时间内，主要农作物的遗传连锁图的绘制均已完成。1996年我国用RFLP标记对水稻进行作图，构建了水稻12条染色体的完整连锁图。此后，又构成了有612个标记的水稻遗传连锁图，较好地满足水稻遗传育种工作的需要。除水稻之外，还绘制了谷子的RFLP连锁图。构建了大豆分子标记遗传框架图、小麦野生近缘植物小伞山羊草的连锁图以及小麦的第1、第5、第6染色体部分同源群RFLP连锁图等。 1997年，利用广陆矮4号水稻品种构建的BAC文库，建立了631个长度不同的跨叠群。用水稻遗传图谱上的RFLP标记及STS标记确定了631个跨叠群在水稻12条染色体上的位置，绘制出了水稻的染色体物理图。该物理图长为352284Kb，覆盖了水稻基因组的92%。 我国近年来对作物的重要性状，如育性基因、抗性基因及产量性状基因的作图与标记方面开展了大量研究工作。 在育性方面，找到了与光敏核不育水稻的光敏不育基因位点连锁的RFLP标记。定位了水稻不育系5460F的育性隐性单基因tms1，并找到与之紧密连锁(1.2cM)的RFLP标记。定位水稻野败不育系恢复基因的两个主效基因Rfi3和Rfi4，初步确定了与其中Rfi3基因紧密连锁(2.7cM)的RFLP标记，并已转化为STS标记。 在我国常用的水稻广亲合品种02428中检测出3对广亲合基因，分别位于第2、6和12染色体上，对育性的总贡献为57%。在另一广亲和品种Dular中检测到影响杂种育性的5个QTL位点，分别位于1，3，5，6和第8染色体上。除以上两个品种外，还将一个广亲合基因定位在水稻的第11染色体上，并初步认为是一个新的广亲合基因。 另外，找到了与棉花恢复系06132R恢复基因连锁的RAPD标记OPV15300，二者之间的交换值是13.0%。 在抗性基因方面，已经定位并克隆了广谱抗性的水稻白叶枯病基因Xa21和Xa7。Xa14也已定位在水稻第4染色体上的两个分子标记RG620和G282之间。定位了R55中的抗条锈病基因，并且用分子标记证实该抗病基因来源于圆锥小麦。我国学者参与了国内外已报道的7个抗白粉病分子标记中多个基因的标记。 确定大豆抗病品种科丰1号的抗性是由一个显性抗病基因控制,通过RAPD进行找到了与其连锁较紧密(7.7cm)的分子标记，并转化为SCAR标记。 利用分子标记技术研究了杂合性与杂种优势的相关性，结果发现基因型杂合度与杂种优势的相关性在不同中表现出较大的差异。发现上位性效应是杂种优势形成的重要遗传基础。 (二)主要进展 四川农业大学应用分子标记育种技术将抗稻瘟病基因[Pi-d(t)、Pi-d(t)2]和抗白叶枯病基因(Xa4、Xa21)分别导入不育系和恢复系，获得大量优质抗病保持系和不育系50个，并获得兼抗稻瘟病和白叶枯病的高产杂交水稻新组合8个，其中6个进入区试。育成稻米品质的主要指标达到国家一级米标准的新组合2个(E优540和E优532)，推广面积90万亩。 安徽省农业科学院水稻研究所育成抗白叶枯病光、温敏核不育系3418S和抗白叶枯病的BT型不育系，鉴定结果显示，上述不育系不育性稳定，不育度达标。其中3418S抗白叶枯病的能力有所增强，并且表现明显的光敏性和一定的感温性;BT型不育系皖21A和皖21B抗白叶枯病能力强，均为1级，且配合力好，所配组合米质优。实现了Xa21和Xa23基因的双聚合，得136份同时带有Xa21和Xa23基因的材料，利用田间选择与分子标记选择相结合，提高选择的准确度，利用花药培养与海南加代相结合的方法，加速稳定。同时，还实现了Xa21和Pi9基因的双聚合，得到30个同时具有Xa21和Pi9基因的纯合株系。 在小麦分子标记辅助育种方面，江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所筛选得到2份高抗赤霉病材料、研制出一个抗赤性超过苏麦3号的新抗源。育成了70多个优质、高产、抗赤霉病新品系，其中6个新品系已参加省区试。生选3号2001年秋扩繁800多亩，生产良种50多万斤，示范1万余亩。宁962390通过审定，是目前抗赤性最好，适宜制作面条的小麦新品种，可望在江苏、安徽、湖北等大面积推广应用。审定品种扬麦9号、生抗2号累计推广面积已超过350万亩。分别在抗源望水白、苏麦3号和宁894037上筛选到3个主效QTL，其中望水白和宁894037至今国内外尚未见报道。 中国农业科学院作物育种栽培研究所鉴定出源于粗山羊草D基因组的抗白粉病新基因 Pm-X，筛选出与该基因连锁(遗传距离约9.4?2.8 cM)的SSR标记。筛选出与源于中间偃麦草第7部分同源群染色体长臂的小麦黄矮病抗性基因Bdv2共分离的SSR和RAPD标记，用于分子标记辅助育种。将Bdv2转育到高产农艺亲本中麦16、宛7107中。在选育兼抗黄矮病、白粉病小麦品种方面，利用分子标记选择，获得具Bdv2、Pm4 、Pm13 、Pm21兼抗黄矮、白粉病的F2植株5株;将Bdv2、Pm-X 转育到中麦16、宛7107和优质小麦中优9507、郑州9023中。目前与山西科院小麦所合作，通过穿梭育种育成的临抗1号推广25万亩;与甘肃省张掖地区农科所合作，通过穿梭育种，育成的高产优质抗黄矮病小麦新品种张春19和张春20，于2001年推广243万亩。 云南农业大学通过分子标记检测技术，在国际上首创利用水稻遗传多样性控制稻瘟病方法，获得重大的突破，并受到国际著名学术刊物《自然》的高度。已筛选出的51个水稻品种优化种植组合，在云南、四川等地完成358万亩大面积示范，调查结果显示，稻瘟病的防治效果在76%到96%之间，抗倒伏率100%，减少农药施用量60%以上，每亩净增产40至70公斤，社会经济效益达4亿余元。目前，在水稻遗传多样性利用品种搭配组合的分子标 记筛选研究中已经筛选出S1/AS3, XLRR for/XLRR rev, Pto-Kin1/Pto-kin2, Ptofen-S/ Ptofen-AS 和NLRR for/NLRR rev等五对引物分子标记，并完成了332个品种的分子标记分 析，筛选出68个组合可进一步供水稻生产上使用。 (三)热点问 1、重要农艺性状基因的精确定位以及适用分子标记的开发 许多重要农艺性状基因，例如水稻抗稻瘟病基因，仍然没有找到共分离或紧密连锁的分子标 记。以PCR为基础的分子标记等适用标记的发现也是热点之一，这类适用标记的开发将有 利于并加速分子标记辅助选择在作物育种中的应用。 2、分子标记辅助选择在聚合育种中的作用 由于分子标记辅助选择可以实现多种基因的累加，培育出多抗或广谱的种质或品种，因此在 分子标记的利用上多个基因的导入或多个性状的同步改良已成为分子标记辅助育种的发展 方向。尤其是通过与转基因技术相结合，最终实现品种设计〔Crop design〕育种理念的新突 破。 野生稻高产基因及其分子标记辅助育种研究 野生稻高产基因及其分子标记辅助育种研究 邓启云1, 袁隆平1, 梁凤山2, 李继明1, 李新奇1, 王乐光2, 王 斌2 ( 1 国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙 410125;2 中国科学院遗传与发育生物学 研究所, 北京 100101) 摘要:传统遗传育种方法在挖掘和利用水稻栽培品种的遗传资源方面日趋饱和，进一步提高 杂交水稻产量潜力必须考虑利用水稻野生近缘种的有利基因库。随着分子生物学技术的发 展，分子标记辅助选择在定向导入远缘有利基因方面的研究日益成为活跃的研究领域。介绍 了马来西亚普通野生稻的2个高产QTLs的发现，及其分子标记辅助育种的初步进展，并展 望了这一领域的研究前景。 关键词:野生稻高产基因(QTL);杂交水稻;分子标记辅助选择(MAS) 中图分类号: 文献标识码: A. 文章编号: Studies on Yield-enhancing Genes from Wild Rice and Its Marker-assisted Selection in Hybrid Rice DENG Qi-yun1, YUAN Long-ping1, LIANG Feng-shan2, LI Ji-ming1, LI Xin-qi1, WANG Yue-guang2, WANG Bin2 ( 1 China National Hybrid Rice Research and Development Center (CNHRRDC), Changsha, Hunan 410125, People’s Republic of China; 2 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, People’s Republic of China ) Abstract: Facts have proved that genetic improvements are the most practicable way to increase rice productivity. But it is now quite limited to further raise the rice ceiling through traditional breeding methods based on the exploitation of genetic diversities within Oryza sativa. As the biotechnology fast developing recently, it becomes more and more important research field that breeders try to introduce distantly related favorable genes into rice cultivars from wild relatives of rice. It is described here that the discovery of the two yield-enhancing QTLs from wild rice and preliminary studies on marker assisted selection (MAS) in hybrid rice breeding program. And the prospects in the realm of MAS breeding were also discussed in the paper. Keywords: Yield-enhancing genes (QTLs) from wild rice; Hybrid rice; Marker-assisted selection (MAS) 我国现有人口超过13亿，人均耕地面积不足867 m2, 预计本世纪30年代，我国人口将增加 到16亿，人均耕地将减少到667 m2左右，粮食自给仍然是摆在我们面前的紧迫问题。从全 球范围看，由于人口增长以及环境恶化和城市化发展所带来的耕地面积减少的趋势在相当长 一段时间内还无法逆转，因此继续提高主要粮食作物单位面积产量始终是各国政府和科学家 关注的热点课题。水稻是最重要的粮食作物之一，实践证明，通过遗传改良来提高水稻单位 面积产量是最行之有效的途径。 1 水稻产量性状遗传改良的现状和挑战 近三十年来我国常规水稻育种在发掘产量潜力方面基本处于徘徊状态，目前大面积推广的常 规早稻新品种，其产量潜力基本和60年代选育的广陆矮4号相同。三系法杂交水稻的培育 成功带来了一次水稻单产的飞跃，为解决我国粮食问题做出了巨大贡献。但近年来，由于受 现有亲本遗传基础的限制，单产也出现了徘徊局面。在超级杂交水稻理论提出后，在充分利 用水稻形态改良成就和亚种间杂种优势相结合的基础上，水稻产量又获得了显著提高。但是， 由于水稻栽培种遗传资源的利用已日趋饱和，并且许多改良品种具有相同或相似的遗传来 源，容易造成遗传上的单一性，因此，在现有高产或超高产的前提下，欲进一步提高水稻产 量潜力，必须寻求新途径，创制和利用具有丰富变异的新材料，这将是未来水稻产量潜力获 得进一步突破的方向。 进一步扩大亲本间的遗传差异，可以考虑从远缘种群中引入高产基因资源。栽培水稻有20 多个野生近缘种，包含有极其丰富的遗传变异。为了拓宽栽培品种的遗传多样性，许多育种 家都试图发掘这一重要的遗传资源宝库，并为此做出了不懈的努力，在质量性状方面已经取 得了显著成效。如60年代发掘和利用来源于O. nivana的水稻草丛矮缩病持久抗性[1~2]; 70年代，我国科学家又从O. rufipogon中找到雄性不育细胞质基因，实现了杂交水稻的三系 配套[3~4];近年来人们又在长药野生稻中发现了高抗白叶枯病基因Xa-21，并将其转移到栽 培稻中。但产量属于数量性状，由多基因控制，直接利用野生资源中的某一特定基因来改良 水稻产量等数量性状，目前尚无先例。究其原因主要存在两大障碍:一是野生稻中存在大量 对产量不利的性状干扰，使高产基因型的鉴定十分困难;二是连锁累赘，即目的基因与不利 基因的紧密连锁是常规的远缘杂交育种中难以克服的难题。因此，要发掘和利用野生稻有利 基因以用于改良栽培水稻产量潜力，必须开拓相应有效的新技术。 2 分子标记的发展与应用 近20 a年来迅速发展的基于DNA的分子生物学技术，如分子标记和作图技术，不仅使鉴定 数量性状基因位点成为可能，同时给育种提供了崭新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助 选择”(marker-assisted selection，MAS)。 分子标记基于DNA分子变异，与形态学标记和同工酶标记相比，具有下列优点:(1) 基因 组DNA的变异十分丰富，因此分子标记的数量几乎是无限的;(2) 多数分子标记(如RFLP， SCAR，SSR)都是共显性标记，对选择隐性基因控制的农艺性状十分有利;(3) 不同发育阶 段、不同组织的DNA均可用于标记分析，使对作物基因型的早期选择成为可能;(4) 分子 标记直接揭示来自DNA的变异，使育种家有可能依据植株基因型而不只是表现型来选择优良性状。 随着分子标记技术的发展，分子标记辅助选择和聚合育种技术亦得到迅速发展，大大提高了育种效率，加速了育种进程。Sheng Chen等通过分子标记辅助选择方法对杂交水稻恢复系明恢63进行改良，将Xa-21基因转移到明恢63，获得了抗白叶枯病的明恢63，从而达到对杂交水稻汕优63进行遗传改良的目的[5]。黄宁等利用分子标记辅助选择将白叶枯病抗性基因Xa-4, Xa-5, Xa-13 和Xa-21 聚合到同一水稻品种中，大大提高了其对白叶枯病的抗性[6]。在番茄的果重和可溶性固相物含量的改良方面，应用RFLP图谱技术定向转移微效数量性状基因已经获得成功。在已构建的RFLP图谱中定位了6个控制果重的QTL，每一位点的作用幅度为3.5~6.0 g。还定位了4个控制可溶性固相物含量的QTL，每个位点的作用幅度为0.83%~1.89%[7]。采用分子标记辅助选择技术，已成功地将这些有用的QTLs转移到商用番茄杂交种的染色体中，使产量增加20%以上。 3 野生稻高产基因的发掘 为从野生稻中发掘和利用有利基因以进一步提高杂交水稻产量潜力，自1992年以来，国家杂交水稻工程技术研究中心与美国康奈尔大学合作，着手从分子水平进行研究，从马来西亚普通野生稻(O. rufipogon)中发掘高产基因资源。用普通野生稻与栽培稻V20A不育系杂交，再用V20B连续回交两代，从BC2的3000株中选300株与测64-7测交配制成300个组合，每个组合含1.5%~11.5%不等(平均为4.5%)的野生稻遗传信息。考种结果表明，大多数组合中含有的野生稻等位基因对产量没有增产效果或相对于栽培种中的等位基因是有害的影响。但来自野生稻1号染色体上RM5标记位点处以及2号染色体上RG256附近的2个QTLs却能明显地使产量增加，分别具有18%和17%的增产效应。同时，这些组合在千粒重、株高和生育期上与对照没有明显区别。1995年从300个BC2测交群体(V20A/马来西亚普通野生稻//V20B///V20B×测64-7)中发现有7个品系比对照(威优64)增产30%以上。经进一步分析，发现分别位于1号和2号染色体上的两个正向QTL位点(即yld1.1和yld2.1)，每一个具有在现有三系杂交稻基础上增产约18%的效应[8~9]。 这一发现后来从其他一些野生稻产量QTL分析群体得到进一步证实，如国际热带农业研究中心(CIAT)的巴西粳稻群体[10]等，其高产基因也定位在第1染色体上与yld1.1相近的位置。2002年，我国学者李德军等以江西东乡普通野生稻为供体亲本, 在桂朝2号的遗传背景下，在第2和11号染色体上也发现了来自东乡野生稻的2个高产QTL，分别能使桂朝2号单株产量增加25.9%和23.2%[11]。由此可见，普通野生稻(O. rufipogon)是一个重要的有利基因库，其中存在高产QTLs的事实已毋庸置疑，而且借助于分子标记等技术最终可能通过育种程序将这些QTLs集中起来加以利用，以提高水稻产量潜力。 4 分子标记辅助育种策略 应用分子标记辅助选择利用远缘有利基因的策略主要有回交转移、杂交转移、轮回选择和基因累加等方法，其中应用较多的是回交转移和杂交转移的方法。 4.1 回交转移 在利用分子标记辅助选择进行外源基因的转移时，必须保证目标基因位于足够大的染色体片断之内，同时又不能使这个片断太大，因为片断太大会使与目标基因连锁的非期望基因或不利基因也转移到受体亲本中，即带来连锁累赘(linkage drag)。 以普通野生稻为高产基因供体，以生产上大面积应用的优良恢复系为高产基因受体和轮回亲本，进行杂交和连续回交，使分子育种建立在一个产量水平较高的平台上，有利于充分发挥高产基因的增产效果。通过回交并对每个回交世代进行分子标记辅助选择，逐步建立起野生稻高产基因近等基因系，对中选的优良恢复系材料进行测交鉴定，最后根据大量测交F1的产量表现再决选恢复系株系。配制的杂交组合还同时进行生产试验和大面积示范以确认其实 际增产效果。采用这种分子标记分析与田间选择、杂种鉴定相结合的方法，可以避免由于交换造成的含野生稻高产基因的DNA片段丢失。 传统的回交转移方法最大的缺陷是多代回交后还存在着大量的来自供体亲本的非期望基因。利用分子标记辅助选择可直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而可望在很大程度上解决连锁累赘的问题，同时可以减少回交代数[12~13]。理论上，可能在回交一代就有一些个体的一些染色体是纯合的而目标基因是杂合的，选择它们进行回交将大大缩短育种进程，但这需要以前景选择(foreground selection)和背景选择(background selection)为前提[14~16]。比较好的办法就是多进行两轮回交选择，即大大降低分子鉴定的费用。在西红柿上利用分子标记辅助回交育种方面的工作十分出色, 野生种的不少有益基因成功地转移到了栽培品种中[17~20]。 4.2 杂交转移 杂交育种是杂交水稻亲本选育中一种普遍使用的育种方法。就前述野生稻高产基因yld1.1和yld2.1而言，由于它们是两个控制产量性状的主效QTL，每个QTL对产量的贡献值都非常显著，因此也适合采用分子标记辅助的杂交育种策略将高产基因进行亲本间转移。近年来，以初步育成的携带野生稻高产基因的强优恢复系Q611为供体亲本与生产上大面积应用的优质或多抗的优良恢复系直接进行杂交，在F2或回交F2进行分子标记辅助选择，并将筛选的优良单株与不育系进行测交鉴定，比直接从普通野生稻中导入高产基因更容易稳定，中选的优良单株几率大大提高。玉米分子标记辅助育种研究证实，在杂交育种的早期世代就可以开展分子标记辅助选择[21]。但仅仅根据分子标记进行选择并不太有效，分子标记分析必须与田间选择相结合方可明显提高效率。 5 野生稻高产基因分子育种效果 由于野生稻高产基因yld1.1和yld2.1都是具有显著增产效应的主效QTL，因此借助分子标记辅助选择将其转入优良恢复系中，培育具有超高产潜力的杂交水稻新组合，从技术上讲是完全可行的。近年来，我们借助SSR等标记技术着手将两个高产QTL先后转移到优良恢复系测64-7、9311、明恢63等遗传背景中，并逐步建立近等基因系，已经培育了一批强优恢复系材料，对部分材料进行了测交鉴定，其杂种F1表现出强大的杂种优势，有望培育出超高产杂交稻新组合。 以优良恢复系测64-7为受体的分子标记辅助育种为例，先以受体亲本与野生稻高产基因供体材料(来源于野生稻V20B回交系与测64-7的测交后代，即V20A/rufipogon//V20B///V20B ////Ce64)杂交、回交，在每个回交世代分单株提取基因组DNA，然后以与yld1.1和yld2.1紧密连锁的SSR标记进行扩增、分析，筛选在这两个位点含有野生稻扩增带的杂合基因型单株，再以受体亲本为轮回亲本连续回交至BC3F1。自交多代后，主要根据农艺性状进行田间选择，筛选优良单株与V20A、金23A等三系不育系测交，根据大量测交F1的产量表现再决选恢复系株系，并进一步通过分子标记验证野生稻高产基因的存在与否。 5.1 田间选择和杂种优势表现 在以测64-7为受体的BC3F1中筛选了7个优良单株，种植成7个株系，每个株系200株以上，并从中筛选优良单株自交。以后每个世代根据综合农艺性状筛选优良单株自交。2000年从BC3F5中筛选到2个性状非常优良的株系Q608和Q611，测交鉴定表明，2个株系均具有强大的杂种优势。但进一步测交、制种试验显示，Q608本身容易受低温影响，结实率很不稳定，予以淘汰。而另一个株系Q611则结实稳定，花粉量足，与具有长江流域早籼稻遗传背景的不育系测交表现出强大的杂种优势，是配制三系超级杂交稻的强优恢复 1 番茄分子连锁图谱的研究进展 饱和连锁图是进行基因克隆、数量性状定位、分子标记辅助选择等遗传研究的重要工具。因此，不少科学家致力于分子连锁图的构建工作。在连锁图的构建过程中，亲本类型、分离群体的分类和分子标记的多态性等起着至关重要的作用。亲本间的多态性越丰富，分子标记的饱和程度就越高。在番茄最初的研究中，发现RFLP在现代栽培番茄品种间的多态性不到5%。有鉴于此，后来的研究者在构建番茄分子图谱时，都用种间杂交的分离群体或后代选系为材料。但种间杂交后代经常会遇到雄性不育、分离异常、优良和不良性状间的紧密连锁等问题，使这类杂交后代难以直接为新品种选育服务。 以普通番茄和潘那里番茄的种间杂交(VF36-Tm2a/LA716)的67个F2单株为材料，Tanksley等把1030个分子标记定位在番茄的12条染色体上，每条染色体上至少有50个分子标记，标记间的平均距离大约为1.2cM(约900kb)。由于染色体的大小有明显差异，所以各条染色体上的分标记数目也表现出明显的差异，这种差异与染色体的长度呈高度线性相关。在同一条染色体上，分子标记的分布也不均匀，着丝粒和端粒区域通常是分子标记的集中分布区。后来，Bernacchi和Tanksley分别又以普通番茄与多毛番茄(TA209/LA1777)的回交后代和来自普通番茄与醋栗番茄(TA209/LA1589)的回交自交系(Inbred backcross lines)为材料，对番茄12条染色体上的分子标记进行了补充。2002年公布的资料表明，每一条染色体上都有54个以上的分子标记，这些标记在染色体上的位点数目从22到44不等，位点间的平均最小距离为3.2cM。实际上，在第3，6，7，9，10染色体上，已经分别找到了距离为0.6cM的分子标记。如果把法国农业研究所的研究结果汇编进来，番茄12条染色体上的分子标记数目估计在1500个左右。 2 番茄分子标记辅助育种的前景 基因定位和分子标记是利用遗传工程技术进行品种改良的基础。受技术水平和物质条件的限制，目前的基因工程技术只是一种辅助性育种手段。它的研究重点主要放在受少数基因控制的抗病性、抗虫性、品质和固氮等方面。科学家利用交叉保护原理，把控制花叶病毒蛋白质外壳的基因转移到马铃薯、番茄、南瓜、烟草等多种作物中，有效地控制了花叶病的流行;利用反义基因育成了在自然条件下贮存两周而能保持其原有风味的番茄品种。这些成就的取得及其它领域的研究进展，使人们对基因工程技术潜在的应用价值深信不疑。 对于多基因控制的产量性状，转基因技术难以在分子水平上直接进行操作。目前主要采用数量性状位点(QTL)定位与数理统计相结合的方法，利用分子标记辅助筛选技术来提高有利基因的频率和进行杂种优势预测。借助于已知染色体座位的分子标记，追踪每一染色体片断的传递规律，不仅可以对QTL所在的基因组进行一段一段的分析，而且可以直接测量过去所不能鉴别的各染色体片段的效应，从而确定其在染色体上的位置、单个效应及互作效应。特定QTL的鉴别将为上位性、多效性及杂种优势基础的研究提供更有力的工具。已经定位的分子标记的应用将大大加快作物数量性状选择的效率和遗传改良进度。 分子标记辅助育种能否在番茄育种中取得成效，主要取决于3个因素:(1)分子标记应与目标性状同步分离或紧密连锁(遗传距离小于1cM)。就目前番茄分子标记的密度而言，大约只有42个分子标记位点间的距离小于1.5cM，多数标记位点间的距离在3-5cM之间。所以，有必要进一步增加分子标记的密度;(2)分子标记的测定方法应简单高效，具有对大群体进行鉴别和选择的能力。分子标记方法有很多种，选择哪种标记方法作为辅助育种的工具，一方面取决于研究目的，另—方面取决于该标记的多态性程度和将来的应用潜力。Powell等对RFLP，RAPD，AFLP和SSR在大豆育种中的应用潜力进行了比较。他们认为，尽管SSR和AFLP的成本较高，但由于其稳定性好、测定效率高，将来仍会得到广泛的应用。RAPD技术稳定性较差，测定效率不高，但它的测定方法简单、成本较低，所以在小实验室中会得到广泛应用。但是，成本和效率并不是一成不变的，例如，SSR技术的实验室成本较高，但它的多态性非常丰富，容易区分出不同的基因型，找到与目标基因紧密连锁的标记的 几率较大，SSR高度的专化性、丰富的多态性缩短了研究时间、提高了工作效率，因此它的研究成本并不高。番茄上的研究结果表明，就多态性而言，RAPD和AFLP比较接近，且明显高于RFLP，但RFLP标记在染色体上分布比较均匀，而RAPD和AFLP标记总是成簇出现，多数聚集在着丝粒附近;(3)分子标记应具有通用性，且经济有效、对环境良好。在将分子标记应用于育种工作之前，必须研究标记的有效性和通用性。有效性主要是指分子标记与目标基因的连锁关系不会因遗传背景的改变而改变。在改变亲本来源的前提下，无论在哪一个回交世代或杂交世代，以分子标记与目标基因之间的交换值都不应有大的改变，这样才能保证分子标记辅助育种的可靠性。 番茄的分子标记首先在抗病育种中得到了重视，以分子标记为依据可以提高抗病基因的筛选效率。抗烟草花叶病毒基因Tm-2是番茄抗病育种中广泛利用的一个主效基因，但该基因控制的抗病性往往和一些不良的农艺性状连锁在一起。用RFLP标记对不同来源的Tm-2品系进行分析，发现含有Tm-2的外源染色体片断的长度在不同品系间有很大差异，有的易位片断长达51cM，而有的易位片断只有4cM。以分子标记TG3和CD32A为依据，可以有效地鉴别Tm-2基因，排除含有非目标基因的染色体片断，达到抗病性和农艺性状同步改良的目的。分子标记在区分不同抗病基因和发现新的抗病基因方面有其独特的作用。根据RFLP标记TG591，新的抗晚疫病基因Ph-3被定位在第9染色体上，与原来的抗病基因Ph(定位于第7染色体)和Ph-2(定位于第10染色体)没有等位关系。分子标记与抗病基因连锁关系的确立为累加多个抗病基因、提高番茄抗病性、延长抗病时间提供了理论依据和技术保障。 高密度分布的分子标记对于研究番茄品质特性非常有利。Saliba-Colombani等的研究结果表明，决定番茄果型、果重、口感、风味、营养等26个性状的QTL主要分布在第2，3，4，8，9，11，12染色体的一些区域中，其中第2染色体上的QTL同时决定着果重(fw2.2)、果实弹性、含糖量、胡萝卜素含量等12个性状。果重基因两侧的分子标记TG492和TGl67相距5cM，在Tanksley等的试验中，TG492和TG167相距6.9cM，两组试验的结果基本一致。在后来的研究中，TG492和TG167之间又插入了一个分子标记TG91，fw2.2两侧的分子标记TG91和TGl67仅相距1.9cM左右。那么，根据这两个分子标记就能在任一发育阶段对番茄的果重进行选择。以分子标记Brix9-2-5为依据，在苗期就可以对番茄的含糖量进行选择。实际上，在整个番茄育种体系中，品质性状的测试最为繁琐，品质的测试必须要等到番茄正常成熟后才能进行，目前仍以感官评价为主，受主观因素的影响较大，工作效率极低。通过研究品质特性的遗传多样性，分析感官性状和各生化成分间的相关关系，筛选与主要品质特性密切相关的分子标记，便能摆脱番茄成熟期、保鲜条件、人为因素等对番茄品质评价的影响，在实验室淘汰大量的不含优质基因的个体，达到提高品质特性选择效率和遗传改良速度的目的。因此，利用分子标记改良番茄品质具有很大的潜力可挖。 此外，番茄的各种分子标记被广泛地用来鉴别和筛选抗线虫基因以及控制各种生理特性的基因。这些标记将在提高番茄的光能利用率、经济系数、营养价值、耐胁迫能力等方面，发挥不可替代的作用。 我国建立了分子标记辅助育种与常规育种相结合的技术体系 在国家863计划支持下，我国科研人员获得了一批农作物重要经济性状的分子标记，并应用于育种实践，建立了分子标记辅助育种与常规育种相结合的技术体系，提高了定向育种的效率和水平。 (1)在水稻、小麦等主要农作物重要性状分子标记及其在育种实践中的应用取得突破性 进展，建立了较为完善的分子标记辅助选择育种技术体系 水稻:对野生稻产量、耐冷、早熟等复杂性状的优异基因进行了系统发掘，已经获得与产量、芽期耐冷相关候选基因以及分子标记。利用分子标记技术有效转移了抗白叶枯病基因Xa21，育成R218、R8006、华恢2号等抗病恢复系;通过分子标记辅助选择，首次将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和持久抗性基因Pi-GD-1(t)与Pi-GD-3(t)，抗白叶枯病显性基因Xa-23、 Xa-21，分别聚合到两系光温敏核不育系和恢复系中，育成抗稻瘟病、白叶枯病双抗的材料，抗性水平提高3-5个等级。 小麦:对小麦体细胞杂种优质基因进行分子标记辅助育种研究，获得了类似小麦的优质高分子量麦谷蛋白新亚基1Bx13基因的分子标记，并已用于对体细胞杂种株系及杂交和回交后代的标记辅助育种，获得了优质、高产、抗病的新品系。获得了小麦优质亚基和糯基因的分子标记，构建了中国小麦品质性状数据库，并将分子标记用于亲本分类;运用RAPD、ISSR、AFLP和SSR等分子标记技术构建了小麦品种间和种间(亚种间)杂种优势群，建立了小麦杂种优势利用新模式。 玉米:完成了对我国90份核心玉米种质和250个国内常用自交系的分子标记指纹图谱分析，建立了干旱胁迫下抗旱、耐瘠群体改良技术体系;创建了利用控制双亲的混合选择法改良优质蛋白玉米群体的方法。 油菜:采用分子标记辅助选择技术对油菜抗菌核病、大粒、高含油量等重要性状进行DNA分子标记，并利用与上述性状紧密连锁的DNA分子标记进行抗病、高产、高含油量等性状的辅助选择，获得了双低特高含油量、高蛋白含量的高效油菜新材料，选育出抗(耐)菌核病恢复系7-5、RSH5900等以及显性细胞核雄性不育系1481AB等。 棉花:构建了陆陆杂交分子标记图谱，标记出与抗棉花黄萎病紧密连锁的QTLs;找到与纤维长度、比强度和马克隆值紧密连锁的QTLs;与棉花早熟性紧密连锁的QTLs为12个，3个对早熟性的贡献率达到30%以上，为棉花优质、多抗棉花新品种的聚合育种奠定了基础。 (2)在果菜类和一些重要杂粮类作物中，构建了一批具有应用价值的分离群体，获得了一批 重要经济性状的分子标记，并初步用于育种实践 建立了番茄、甜椒、茄子耐冷性、耐弱光的分子标记或生理指标鉴定技术;开展了黄瓜、辣椒、茄子、番茄、甜瓜抗病(霜霉病、炭疽病、黑星病、白粉病、枯萎病、病毒病、细菌性角斑病、疫病、青枯病、叶霉病、线虫病)、黄瓜全雌性、黄瓜性别分化、辣椒CMS不育与恢复基因、番茄高番茄红素、雄性不育ps-2基因、甜瓜雌雄异花同株、甜椒胞质雄性不育恢复基因的等重要性状的分子标记技术研究，构建了一批有应用价值的分离群体，获得了一批重要性状的分子标记或QTL;在国际上首次对黄瓜性别决定基因进行定位，构建了黄瓜欧亚生态型间的饱和永久分子图谱和大白菜分子连锁图谱;利用黄瓜白粉病分子标记技术对育种材料进行抗性鉴定和筛选，选出抗白粉病单株40余个。 建立了花生抗黄曲霉侵染的AFLP分子标记，两个AFLP标记与抗病基因间的遗传距离分别为3.5cM和9.4cM，并用于育种材料的抗性鉴定。建立了主要麻类作物(苎麻、红麻、亚麻)RAPD、SSR等分子标记技术，首次应用于麻类育种中。构建了谷子抗旱性、抗线虫病、抗黑穗病、抗锈病等重要农艺性状分子标记的分离群体和谷子标记图谱构建的RI群体;开发了谷子的一些SSR标记，并利用AFLP、ISSR和RAPD等对这些重要农艺性状进行分子标记。 首次发现了两个在抗病品系中稳定出现，可作为高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种标记应用的SSR标记:Xtxp13和Xtxp145。首次建立马铃薯青枯病抗性双侧翼标记辅助选择技术，使抗病性鉴定与田间评价结果一致性达到95%以上。建立了主效QTL位点数和QTL位点数结合评价马铃薯晚疫病水平抗性的策略，探索了QTL的实际应用的有效途径。 分子标记 在农业基础与应用研究领域，分子标记技术已开始应用于作物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很大的进展。 形态标记(morphologica markers)即植物的外部特征特性，如株高、穗长、粒色、千粒重等。此种形态标记简单直观，但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。在小麦抗叶锈病基因标记方面，SINGH[5]曾利用形态标记发现慢叶锈基因Lr34和小麦叶片尖部坏死基因紧密连锁。 细胞标记(cytological markers)主要是染色体核型(染色体鼠数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)，这类标记的缺点是数目有限。目前，还未发现用其进行小麦抗叶锈基因的标记。 生化标记(biochemical markers)主要包括同工酶和储藏蛋白。生化标记具有经济方便的优点，但其标记数有限。DAVlD[6]等曾利用生化标记内肽酶同工酶EP-Dld作为遗传标记对以Thatcher为背景的小麦抗叶锈病近等基因系进行连锁分析，发现EP-Dld与Lr19紧密连锁，重组值为(0.01士0.09)个作图单位。WINZELER[7]等利用含Lr19的小麦抗叶锈病近等基因系，发现生化标记内肽酶同工酶EP-Dl的无效等位基因EP-Dlc可以作为与Lr19紧密连锁的生化标记，遗传距离为(0.33士0.33)cM。 分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点:?在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。?数量多，遍及整个基因组。?有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。 目前，用于标记小麦抗叶锈病基因的分子标记主要有以下几种: 2.l RFLP技术在小麦抗叶锈病基因标记中的应用 RFLP(restriction fragment length polymorphism)作为遗传分析的工具开始于1974年，80年代开始应用于植物。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，产生相当多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA做探针把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱;它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。RFLP技术被广泛应用于小麦遗传图谱的构建标记和定位小麦的目的基因。 在小麦抗叶锈病基因的RFLP标记方面，SCHACHERMAYR等[8]将一编码受体蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的Hind?片段用Pst?分成六个亚片段，将这些亚片段作为RFLP标记，寻找到了特异的Lrk10片段可作为与小麦抗叶锈病基因Lr10紧密连锁的分子标记，将这一亚片段与已知抗性基因的单基因系进行Southern杂交，发现这一3.9Kb的Hind?片段仅存在于携带抗叶锈病基因Lr10的近等基因系中。进一步将此RFLP标记Krkl0-6转变为STS标记STSLrkl0一6，发现一282bp的片段仅存在于携带Lr10的品种中，F2群体分离进一步证明此282bp的片段与Lr10紧密连锁。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了与抗叶锈病基因Lr24紧密连锁的RFLP和RAPD的标记。在供试的115个RFLP探针中，其中6个与Lr24紧密连锁，从360个随机RAPD引物中，找到了11个能够揭示多态性的引物，其中一个与Lr24 紧密连锁，并将该RAPD产物克隆、测序将其转化为更为稳定可靠的STS标记，为分子标记辅助育种打下了良好的基础。FEUILLET等[10]利用小麦抗叶锈病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品种Frisal，通过F2群体分离，将37个RFLP中的16个定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之间揭示多态性，I1个RFLP探针能在近等基因系间揭示多态性，F2群体分离分析发现，其中3个与抗性基因连锁，其中一定位在染色体5D上的探针pTAG621证明与Lr1紧密连锁，并将这一RFLP标记转化为了更为可靠的STS标记。 AUTRIQUE[11]等利用4种含不同抗性基因的小麦近等基因系，根据抗性基因在其染色体上所处的位置选择克隆，同时，从大麦的RFLP连锁图谱和D一基因组RFLP图谱中，挑选了其它的克隆。通过杂交的方法来寻找多态性分子标记。结果发现，定位在染色体7DL和3DL上的8个分子标记，与抗性基因Lr19和Lr24共分离;来自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色体6B上，一克隆XksuD27与Lr9共分离，以及与Lr32紧密连锁的两个RFLP标记，遗传距离分别为(3.3土2.6)cM和(6.9土3.6)cM。 2.2 小麦抗叶锈病基因的RAPD标记 NAIK等[12]利用含Lr28的抗叶锈病近等基因系，从80个随机引物中找到了一个能在供体亲本和轮回亲本中揭示多态性的RAPD标记OPJ一O1。将此387bp的多态性产物克隆、测序，将其设计成更为稳定的STS标记，利用BSA法，对F3群体进行分析，发现387bp的特异性产物只出现在抗性群体中，而在感病群体中表现缺失。证明了RAPD标记OPJ一O1和STS 标记均与Lr28紧密连锁。SIELDLER等[13]利用400个随机引物和14个DNA探针筛选近等基因系Lr9的多态性，并通过F2群体进行遗传连锁分析。结果表明2个RAPD标记和一个RFLP标记可以区分抗感品系,且与Lr9紧密连锁。WILLIAM等[14]利用RAPD技术，从400个随机引物中，找到了3个能在抗病群体和感病群体中揭示多态性的引物0PG-05、0P1-16和OPR-03，将其克隆转化成探针后，对重组群体进行Southern杂交，确定其中前两个探针与持久抗叶锈病基因相关的数量性状位点(QTL)紧密连锁，其中定位在7BL上的QTL与抗叶锈病基因Lr34部分同源。SCHACHERMAYR等[15]从395个随机引物中筛选出了3个与小麦抗叶锈病基因Lr9连锁的RAPD标记，将其特异性产物克隆、测序，然后转化成更为稳定的STS标记，F2、F3分离群体检测发现，所有的3个RAPD标记0PA-07、0PJ-l3、OPR-15和一RFLP标记cMWG684与Lr9紧密连锁。另一RFLP标记PSR546也与Lr9紧密连锁，并与上述四个 DNA标记紧密连锁，遗传距离为(8士2.4)cM，此标记被定位在小麦染色体长臂6BL上。DEDRYVER等[16]利用含Lr24的小麦抗叶锈病近等基因系，在125个随机引物中，只有引物OP-H5能在抗病亲本RL6064中扩 增出一700bp的特异性的条带，而在感病亲本Thatcher中没有。F2群体分离证明，该标记与Lr24完全连锁。将其转变成稳定、可靠的SCAR标记，为分子标记辅助育种提供了有力的工具。 3 其它分子标记 虽然RFLP和RAPD是两种比较普遍的分子标记，但RFLP在小麦中检测的多态性较低，仅为20%--38%。RAPD是方便经济的分子标记，但是重复性和稳定性较差。其它的分子标记，如SSR、ISSR和AFLP的综合信息量大，在作物特别是小麦遗传资源的研究上有着广阔的应用前景。 4 分子标记辅助选择 目前，分子标记技术已开始应用于育种实践，并表现出其独特的优越性。寻找与重要的农艺性状紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择(又称分子育种)和通过作图克隆基因的基础。分子标记辅助选择(Molecular-assisted-selection简称MAS)是生物技术与传统遗传育种相结合而形成的，它可以减少传统的回交育种过程中很难消除的连锁累赘，还可以把不同抗叶锈病基因聚合到同一优良品种中，实现同效基因的累加作用，获得持久抗性。在获得稳定的分子标记的基础上，通过染色体步行(Chromosome walking)等方法分离克隆该基因。 由于分子标记育种技术目前尚不成熟和完善，因此还不能作为一种育种方法单独使用。我国传统育种经验丰富，因此，应注意将分子标记这一先进技术与育种家的丰富经验相结合，使分子标记辅助选择发挥其更大的作用。