【word】 A型肉毒杆菌毒素水凝胶去神经支配作用的定量研究

【word】 A型肉毒杆菌毒素水凝胶去神经支配作用的定量研究 A型肉毒杆菌毒素水凝胶去神经支配作用 的定量研究 ChinJApplphysiol2008;24(1 A型肉毒杆菌毒素水凝胶去神经支配作用的定量研究 陈静嫦,麦光焕?,余新平,余焕云,吴河坪,江福钿 (中山大学中山眼科中心,广东广州510060) 摘要目的:探讨改变剂型后的A型肉毒杆茵毒素(BTXA)的生物活性是否存在,并对其去神经支配作用进行定 量分析.:SD大鼠36只,随机分成4组.A--D组随机一侧腓肠肌肌内注射BTXA水溶液0.1ml(5U),BTX— A水凝胶0.1ml(12.5U),0.1ml(5U)及0.1ml(2U),对侧腓肠肌肌内注射0.1ml相应溶剂.于用药前,用药后5 d,2周,3周,1个月,2个月及3个月分别测定双侧腓肠肌复合动作电位(CMAV),并波幅.结果:不同时间段 用药侧与对侧腓肠肌CMAP波幅的下降幅度比较有非常显着性差异(P<0.01),用药后的用药侧与对侧腓肠肌 CMAP波幅的下降幅度均明显高于用药前(P<0.01);各组间的用药侧与对侧CMAP波幅的下降幅度比较有非常 显着性差异(P<0.01),A组及B组的下降幅度明显高于C组及D组(P<0.01),A组及B组比较则没有显着性 差异,C组的下降幅度高于D组(P<0.01).结论:水凝胶剂型的BTXA不仅保存了其去神经支配的生物活性.且 表现明显的量效关系和时效关系. 关键词:肉毒杆茵毒素;水凝胶;生物活性;去神经支配;复合肌肉动作电位 中图分类号:0436文献标识码:A文章编号:1000—6834(2008)01—104—04 近20多年来,A型肉毒杆菌毒素(botulinum toxinA,BTXA)成为治疗斜视及神经系统多种运 动障碍疾病的重要手段-lJ.它通过选择性作用于 外周神经胆碱能神经末梢,抑制刺激性或自发性突 触前膜乙酰胆碱的量子释放,阻断神经冲动的传播, 即化学性去神经支配作用,使其所支配的靶器官(肌 肉或腺体)出现功能减弱,从而达到治疗的目的[2l. BTXA治疗斜视最常见的并发症包括上睑下垂和垂 直性斜视,推测是药液通过扩散而引起邻近肌肉受 累麻痹_3I3.为了克服药液扩散的副作用,本研究拟 通过改变传统水溶液剂型,将BTXA制备成水凝 胶,以减慢和减少药物向周围弥散,从而使药物作用 范围局限化.然而,BTXA是一种蛋白质生物制剂, 其生物活性容易受到溶剂,温度,机械力量,稀释浓 度等因素的影响.因此,本研究旨在观察改变剂型 后的BTXA的生物活性是否存在,并对其去神经支 配作用进行定量分析. l材料与方法 1.1实验动物及分组 SD大鼠36只,体重0.15--0.2kg,排除全身病 变.随机分成4组(=9).采用自身双侧对照,随 机一侧腓肠肌为实验侧,肌内注射BTXA;对侧腓 肠肌为对照侧,肌内注射等体积溶剂.A组为传统 用药组,实验侧肌内注射BTXA水溶液0.1ml (5U),对照侧肌内注射水溶液0.1ml;B,D组分 别于实验侧肌内注射BT?水凝胶0.1ml (12.5U),0.1ml(5U)及0.1ml(2U),对照侧均肌 内注射水凝胶0.1ml. 1.2试剂和仪器 A型肉毒杆菌毒素(中国,兰州生物制品公司, 卫药准字(兰)S一01号);1.7%医用透明质酸钠凝 胶(中国,山东正大福瑞达制药有限公司);BL-420 生物机能实验系统(中国,成都泰盟科技有限公司). 1.3药物制备和给药 BTXA水凝胶的制备:分别按1:3体积将BTX— A(500×10U?L-,200×10U?L-,80×10U?L-) 和透明质酸钠进行混合.在透明质酸钠的原装注射 器中进行缓慢抽推混合,约50min.BTXA溶液的 制备:按1:3体积将BTXA(100×103U?L-)和生理 盐水进行混合.按体重予氯胺酮(50nag?kg-)和氯 丙嗪(25nag?kg-)混合液腹膜内注射麻醉;在小腿 后部膝关节中心和跟腱连线的中点进针,进针约2 ITUTI,注入药物o 1.4腓肠肌复合肌肉动作电位(CMAP)的测定 1.4.1测定时间注射BTXA前24h,注射BTXA 后5d,2周,3周,1个月,2个月,3个月. *收稿日期:2006—12—25;修回日期:2007—09—30 作者简介:陈静嫦(1971.),女,眼科学博士,主要从事斜弱视 的研究.通讯作者.E.mail:ghm44@163.com 中国应用生理学杂志.2008;24(1 1.4.2重复神经刺激参数刺激强度:15mV;刺 激时限:0.05ms;刺激频率:2Hz;滤波:1kI-Iz. 刺激强度的确定:逐渐增加刺激强度.诱发出最大 CMAP相对应的刺激强度,在此基础上再增加30 %,作为本研究的刺激强度.电极:金属针样电极, 直径0.51TUTI,记录面积23.55舢n2. 不同时间段和不同组间的用药侧较对侧腓肠肌 CMAP波幅的下降幅度的比较,采用线性模型重复 资料方差分析,两两比较采用线性模型下的LSD法 进行. 2结果 1.4.3动物解剖为明确刺激电极与记录电极的A,D组不同时间段和不同组间的用药侧及对 位置,对大白鼠的后下半部解剖,熟悉坐骨神经与腓侧腓肠肌CMAP波幅见表1,用药侧较对侧腓肠肌 肠肌解剖位置和行程.刺激阳极:靠近尾部后背中CMAP波幅的下降幅度见表2.不同时间段用药侧 线皮下;刺激阴极:后坐骨棘与股骨大转子连线的与对侧腓肠肌CMAP波幅的下降幅度比较有非常 中央,靠近骨壁;活动记录电极:膝关节中心与跟显着性差异(P<0.01,图1),用药后的用药侧与对 腱连线之间,斜行进入肌腹,近贯穿全长,深度约为侧腓肠肌CMAP波幅的下降幅度均明显高于用药 3mm;参考电极:靠近跟腱的皮下组织,不进入肌前(P<0.01);用药后第5dCMAP的下降幅度明 肉组织;地电极:小腿前外侧皮下.所有电极的插显高于用药后1,3个月(P均<0.01),与用药后第 人位置均作标记,以备下次实验相同部位插人电极,2周和第3周相当;用药后1个月用药侧较对侧腓 提高重复性.肠肌CMAP波幅的下降幅度明显低于用药后第5d 1.4.4CMAP的测定按体重予氯胺酮(50mg?(P<0.01),与用药后第2 周和第3周相当,明显高 kgJ)和氯丙嗪(25mg?kgJ)混合液腹膜内注射麻于用药后2个月及3 个月(P<0.01);用药后2个 醉,并将其后半部的体毛刮除.固定大白鼠,插入刺月CMAP波幅的下 降幅度明显高于用药后3个月 激电极和记录电极,再固定大白鼠膝关节,避免因腓(P<0.01).各组 间的用药侧与对侧腓肠肌CMAP 肠肌收缩时导致电极位置的改变.选取前三次峰一波幅的下降幅度 进行比较,经线性模型重复资料方 峰波幅,取其平均值,作为当次波幅值.差分析,结果有非常显着性差 异(P<0.01,图2), 1.5数据统计A,B组的下降幅度明显高于C,D组(P均<0.oo), 实验室数据用均数?标准差(?S)表示,统计A组和B组比较则没有显 着性差异,C组的下降幅 分析采用统计软件SPSS12.0进行分析.A,D组度高于D组 (P<0.05). Tab.1Compoundmuscleactionpotentialamplitudeofbothgastrocnemiusm usclesbeforeandafterthetreatmentofbotulinumtoxin AingroupA,D(mV,?s,7/=9) Tab.2Reductionsofcompoundmuscleactionpotentialamplitudeofthetreate dgastrocnemiusmusclescomparingthecontrolbefore andafterthetreatmentofbotulinumtoxinAingroupA,D(%,j?s,7/=9) 106 100 80 60 40 20 0 的】— -卜Reduci吣nsofCMAP l~fore5d2W3Wam2m3m Fig.1Reducitonsofcompoundmuscleactionpotentialampli— tudeofthetreatedgastroenemiusmusclecomparingthe controlatvarioustime Before:Beforetreatment;5d,2W,3W,1m,2m,3m:5 days,2weeks,3weeks,1month,2months,3monthsafter teatment (%)一. 70广. 60 50 40 30 20 l0 O GroupAGroupBGroupCGroupD Fig.2Reductionsofcompoundmuscleactionpotentialofthe treatedgastrocnemiusmusclecomparingthecontrolin groupA,D(%) 3讨论 大鼠的小腿腓肠肌肌腹肥厚,肌腹及其支配神 经坐骨神经在活体下容易暴露和解剖定位,常被用 于BTXA去神经作用定量分析的活体研究【.由 于大鼠或兔的眼外肌肌腹菲薄,肌纤维及其支配神 经在活体下均不容易暴露,故本研究采用大鼠腓肠 肌作为研究模型.复合肌肉动作电位(compound ITIL1scleactionpotential,CMAP)是受刺激的运动轴 突所支配的肌纤维的活动,是在记录电极区域该神 经支配的肌纤维动作电位的总和,被广泛应用于神 经传导,神经肌肉接头和肌肉生理病理等基础研究, 以及神经肌肉传递异常疾病,周围神经疾病和肌肉 疾病的临床诊断和预后评价.记录电极的种类和特 性对C记录有很大影响,不同种类和特性的电 极用于不同检测目的的电生理诊断方法.一般来 说,表面电极容易受皮肤,皮下组织以及其它肌肉的 干扰,适用于描述肌电活动的范围,但无助于对神经 肌肉疾病进行鉴别;而直接插入肌肉的针电极,可 准确描绘电信号,不同种类和记录面积的针样电极, ChinJApplphysiol2008;24(1 所记录到的肌纤维数目不同,记录面积越大,所记录 到的肌纤维数目越多.本研究采用的电极为模拟临 床巨肌电图的电极,有较大的电极记录面积,以记录 到更多的肌纤维的动作电位,更客观反映整体的肌 电活动.波幅是CMAP一个重要的参数,反映所检 测的神经纤维的数量和同步兴奋的程度,与兴奋的 肌纤维数量成正比.通过波幅的大小,可大致估计 执行功能的神经和肌纤维的数量.据此,本研究采 用CMAP的波幅作为评价指标,定量分析BTXA对 肌纤维的去神经作用.另外,CMAP可受个体,温 度,昼夜日差等因素的影响,为了提高可比性,本研 究采用自身对照,以用药侧小腿腓肠肌较对侧腓肠 肌CMAP波幅下降幅度作为比较指标. 据查阅文献所得,本研究为首次对水凝胶剂型 BTXA的去神经支配作用进行定量研究,也是我们 探讨BTXA水凝胶治疗斜视系列研究的一部分l5j. 研究结果显示,用药后CMAP波幅较用药前明显下 降,用药后第5d到第三周下降最为明显,用药侧较 对侧腓肠肌CMAP波幅下降幅度平均为82.2%? 2.2%,用药三周后,IAP开始缓慢恢复,用药一个 月后恢复逐渐加快,用药3个月后CMAP波幅下降 幅度平均为47.5%?1.3%,即相当于恢复至正常 水平的50%.结果与JohnM.Cichon的研究结果 基本一致L6J.既往的临床研究也发现,患者接受 BTXA治疗后1,14d开始起效,2,6周达最高峰, 10--12周疗效明显下降以至消失,与本研究结果也 基本一致.另外,同为凝胶剂型的B,D组CMAP 下降幅度相比,差异有显着性,呈现量效趋势;同剂 量的溶液剂型A组的下降幅度明显高于凝胶剂型C 组,而与高剂量的凝胶剂型B组相当,表明凝胶剂 型降低了BTXA对靶器官的总去神经支配效应. 这可能与凝胶剂型减慢和减少BTXA向注射部位 以外的肌纤维扩散有关,而且估计凝胶剂型的这种 去神经效应的减弱作用与注射肌肉的体积有关,肌 肉越肥厚,去神经支配效应的减弱作用越明显.有 鉴于此,各眼外肌相对菲薄而位置毗邻,故推测凝胶 剂型对BTXA单条眼外肌的去神经支配效应减弱 作用不明显,并可通过减少其向周围组织扩散而降 低并发症的发生.至于BTXA水凝胶的去神经支 配作用的减弱是否同时与BTXA在新剂型配制过 程中部分丧失了其生物活性有关,还有待进一步探 讨.因此,本研究不仅客观显示了水凝胶剂型的 BTXA保存了其去神经效应的生物活性,表现明显 中国应用生理学杂志,2o08;24(1 的量效关系和时效关系,而且凝胶剂型可能具有减 慢和减少其向周围组织扩散的作用. BTXA治疗是比较安全的临床治疗手段,至今 未见严重的全身并发症的报导,部分患者可出现发 热,乏力等类似感冒的症状.然而,本研究中各组大 鼠于用药后第5天至2周出现明显的精神不振,以 A组和B组明显,A,B组的非用药侧腓肠肌的 CMAP波幅也明显下降,相当于正常水平的一半,8 只大鼠在这期间不能耐受常规剂量的麻醉而死亡. 由此可见,大鼠可能出现了较为明显的全身反应,这 估计与用药剂量有关.1个国际单位BTXA相当于 18--20g小鼠(swiSS—webster)的半数致死量,而本 研究所采用的剂量为临床常用剂量,相对大鼠而言, 剂量偏大.因此,临床中使用BTXA时要注意用药 剂量.目前已有研究提出了临床治疗的安全剂量, 单个注射部位的注射剂量不超过50U,0.5ml,一次 用药量不超过400UL7j. 4参考文献 [1]CrouchER.Useofbotulinumtoxininstrabismus[J] CurrOpinOphthalmol,2006,17(5):435—440. 107 [2]mllsonsAM,DavisH.Diagnosisandmanagementof ocularmotilitydisorders[M].3rded,Blackwellscience Ltd,2001.161—162. [3]QuahBL,LingYL,CheongPY,eta1.Areviewof 5years’experienceintheuseofbotuliniumtoxinAin thetreatmentofsixthcranialnervepalsyattheSinga— poreNationalEyeCentre[J].SingaporeMedJ,1999, 40(4):405—409. [4]PearceLb,FirstER,MacCallumRD,eta1.Phar— macologiccharacterizationofbotulinumtoxinforbasic scienceandmedicine[J].Toxicon,1997,35(9):1373— 1412. 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Methods:36sprague-Dawleyratswererandomizedintofourgroups.Ingroup A-D,thegastrocnemiusmuscleofonelegwasran— dornlyselectedtoreceiveinjectionofBTXAsolution5Uin0.1ml,BTXAgel1 2.5Uin0.1ml,BTXAl5Uin0.1mlandrXA gel2Uin0.1mlrespectively.whilethegastrocnemiusmuscleofotherlegwasinjectedwith0.1mlofsalinesolutioningroupAand 0.1mlofgelingroupBtogroupDascontro1.Compoundmuscleactionpotential(CMAP)ofbothgastrocnemiusmusclesweremea— suredandtheamplitudeswererecordedbeforeinjections,and5days,2weeks,3weeks,1month,2monthsand3montksafterthe injectionsrespectively.Results:ThereductionofCMAPamplitudewassignificantlydifferentatvarioustime(P<0.01),andCMAP amplitudedecreasedsignificantlyafterthetreatmentofBTXA(P<0.01).ThereductionofCMAPamplitudewassignificantlydif— ferentingroupAtoD(P<0.01),andmorereductionwasfoundingroupAandB(P<0.01),andthereductionwashigherin groupCthaningroupD(P<0.05).However,therewerenosignificantdifferencesinthereductionofCMAPamplitudebetween groupAandgroupB.Conclusion:BioactivityofBTXAingelwasshowedandthedenervatingactionofBTXAingelwasdemon— stratedinadosageandtimedependentmanner. KEYWORDS:botulinumtoxin;gel:bioactivity;denervatingaction;compoundmuscleactionpotential