声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞科研训练论文1

声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞科研训练论文1 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段 科研训练论文 题 目 : 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 学科、专业 : 病理生理学教研室 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 目 录 目 录.............................................................. 1 中文摘要...........................................错误～未定义签。 Abstract............................................................ 3 文献综述............................................................ 5 前 言............................................................. 12 材料与方法......................................................... 13 技术路线........................................................... 15 结 果............................................................. 16 讨 论............................................................. 19 结 论............................................................. 21 致 谢............................................................. 21 参考文献........................................................... 22 1 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 中文摘要 目 的:证明声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)巨噬细胞能够趋化单核细胞的聚集并探讨其机制。 方 法:将实验对象分为对照组、SDT组、ATPase组及SDT-ATPase组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞，而SDT组是在对照组基础上加入终浓度为15μg/ml的5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid, ALA)，孵育2小时后接受声动力治疗。ATPase组及SDT-ATPase组则是分别在对照组和SDT组基础上加入ATPase。将实验对象离心后取其细胞上清液并分别用transwell方法研究其对单核细胞的趋化作用;将实验对象分为对照组、SDT组、zVAD-fmk组及SDT-zVAD组。其中对照组为单纯THP-1源性巨噬细胞，SDT组是在对照组基础上加入 ALA，孵育2小时后接受声动力治疗。zVAD-fmk组及SDT-zVAD组则是分别在对照组和SDT组基础上加入N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)。将实验对象离心后，分别用荧光素酶方法检测细胞上清及细胞内ATP量的变化。 结 果:用transwell方法研究声动力治疗后的细胞上清对单核细胞的趋化作用时，从募集的单核细胞数量来看，声动力治疗组明显高于对照组(p<0.05)，加入ATPase并进行声动力治疗组与声动力治疗组相比显著降低，对照组与ATPase组无统计学差异(p>0.05);用荧光素酶方法，检测声动力治疗巨噬细胞后及加入凋亡抑制剂后细胞上清及细胞内ATP量的变化得出:声动力治疗组明显高于对照组，约为其3倍(p<0.05);加入zVAD-fmk并进行声动力治疗组较声动力组显著降低;对照组与zVAD-fmk无统计学差异(p>0.05)。 结 论:声动力治疗巨噬细胞通过促进凋亡相关的ATP释放趋化单核细胞 关键词:ATP 动脉粥样硬化 声动力疗法 巨噬细胞 2 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 Abstract Purpose: This paper is designed to investigate the effects of monocytes recruitment after sonodynamic therapy and delve into its mechanism. Methods: The subjects were divided into four groups: The control group,the SDT group, the ATPase group and the SDT-ATPase group.The control group merely contains THP-1 derived macrophages.The SDT one,containing and sonosensitizer ALA ,was incubated with fresh medium for macrophages 6 h before being exposed to pulse ultrasound irradiation. The ATPase group was a mixture of the control group and ATPase. Similarly,the SDT-ATPase group , was comprised of the SDT group and ATPase. Cell-free supernatants from each group were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay.For a further study of ATP concentrations changes, we use another four groups of subjects: The control group(macrophages alone),the SDT group, the zVAD-fmk group(added caspase-inhibitor zAVD-fmk ) and the SDT-zAVD group(like the SDT group pretreated with zAVD-fmk).Supernatants and cell debris after high speed centrifugation from these four groups were investigated respectively. Results: Cell-free supernatants with SDT were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay. The SDT group induced an approximately sixfold greater recruitment of monocytes than the control group did(p<0.05), while the monocytes migration of the SDT-ATPase group decreased significantly compared to the SDT group.Besides, there was no statistic difference between the control group and the ATPase group(p>0.05). Luminometer was used to measure the change of ATP content.The ATP concentration of the SDT group was increased about therefold in comparison with the control group (p<0.05),and the SDT-zAVD group had a distinct decrease compared with the SDT group. The control group and the zVAD-fmk group showed no statistic difference(p>0.05). Conclusions: This study demonstrates that SDT could induce the 3 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 recruitment of monocytes by promoting the release of ATP in THP-1 macrophages via caspase-dependent pathway . Key words: ATP, atherosclerosis, sonodynamic therapy, macrophages 4 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 文献综述 动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种多因性疾病，近年来，尽管AS的诊断与治疗有了长足的进步，但人们对其病因学的认识仍然不足。既往和晚近提出的AS发病学说，如血栓形成学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反应学说、剪切应力学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学说、内皮功能紊乱学说、氧 [1]化应激学说等都不足以完全解释AS的发病基础。近年来的基础研究与临床研究结果提示，AS炎症学说应重新受到重视。有充分的证据显示，在AS性疾病的 [2]不同临床现形式中，炎症参与其发生和发展的所有环节。这一发现，为临床治疗AS提供了理论依据及研发新药提供了新思路。 1. 巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化 近年的研究表明，动脉粥样硬化病灶内脂质中心的大小、炎细胞尤其是巨噬细胞的数量、纤维帽的厚薄及新生血管的多少是决定斑块稳定与否的最主要的因素，而巨噬细胞则通过对斑块内脂质含量、炎症反应、纤维成分的降解及新血管形成等方面来影响动脉粥样硬化病变的进展，从脂质条纹的发生到最终斑块破裂和血栓形成，巨噬细胞在动脉粥样硬化的所有阶段都起着极其重要的作用。 1.1巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化不同病变阶段的机制及作用 近年来，细胞凋亡在动脉粥样硬化的形成和进展中的作用日渐成为研究热点，斑块破裂伴血栓形成是造成动脉粥样硬化临床急性症状的主要原因，而大量 [3]的细胞凋亡直接造成斑块不稳定，凋亡过度是不稳定斑块的明显特征。据相关报道，在斑块的不同区域凋亡率具有一定的差别，富含巨噬细胞区细胞凋亡通常 [4]要高于其他区域。斑块的“肩部”最容易发生破裂，纤维帽薄，含有大量激活的巨噬细胞，并存在凋亡残体及许多内含凋亡细胞的巨噬细胞和淋巴细胞，凋亡细胞和凋亡残体对巨噬细胞具有强烈的化学趋化活性，而巨噬细胞本身也遭受细胞凋亡所释放的细胞因子的影响而发生凋亡。巨噬细胞的吞噬作用在动脉粥样硬化不同的病变阶段有着很大的差异，所以在病变早期和晚期其凋亡对动脉粥样硬 5 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 化的影响是不同的。在病变早期，巨噬细胞吞噬功能很强，主要针对脂蛋白，也可有效清除凋亡细胞，其表达的TG2不但能促进凋亡细胞的清除，而且能限制活 [5]体内动脉粥样硬化病变的大小，因此，动脉粥样硬化早期巨噬细胞凋亡可减少 [6]病变成分而抑制病变进展。 巨噬细胞能表达多种清道夫受体(scavenger receptor, SR)，包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及SR-E(LOX-1)等，它迁入内膜后能通过其表面的SR摄取氧化修饰后的脂蛋白，绝大多数脂蛋白被转运到溶酶体中消化并降解为氨基酸和游离胆固醇，过多的游离胆固醇以胆固醇酯的形式储存在胞质里，从而转变为泡沫 [7]细胞。粥样坏死中心的形成与泡沫细胞的聚集和凋亡密切相关。研究表明，斑块脂质中心有巨噬细胞抗体CD68的表达，说明坏死物中有巨噬细胞的残片，这也间接支持粥样坏死中心是在泡沫细胞聚集凋亡的基础上形成的。而且，斑块中的脂质越多，其纤维帽中的巨噬细胞及T淋巴细胞也越多，说明粥样坏死可能在单核细胞向内膜迁入过程中起一定的促进作用。在成熟病变中，吞噬细胞吞噬血小板、红细胞、凋亡细胞及脂蛋白，其中对凋亡细胞的吞噬有利于斑块的稳定， [6]清除凋亡细胞的能力可能对急性粥样血栓性临床事件起决定作用。但晚期病变中，许多因素可引起吞噬细胞清除凋亡细胞的功能受损，导致斑块内坏死、炎症 [8]及血栓形成。斑块中细胞大量凋亡不仅直接造成脂质中细胞数量的减少，而且由于巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡后形成的凋亡物质难以清除，发生继发性坏死和炎症反应，细胞膜完整性破坏，脂质为主的胞浆内容物释放后堆积形成脂质池，从而促进斑块脂质中心的形成并逐渐增大。因此，在动脉粥样硬化晚期，巨噬细胞的凋亡对斑块的稳定是不利的。加强巨噬细胞整体的吞噬功能并非完全有益，然而选择性加强其对凋亡细胞的摄取，可能有助于动脉粥样硬化病变的抑制。 1.2斑块中巨噬细胞凋亡与血管平滑肌细胞凋亡的相互关系 在动脉粥样硬化斑块中发现血管平滑肌细胞和巨噬细胞都经历着凋亡与坏死，而凋亡占主导地位。血管平滑肌细胞分散于粥样病灶内皮下纤维部分及斑块纤维帽深部中膜的下层，而巨噬细胞成簇分布于内皮下、富含脂质的病灶中心和纤维帽的肩部。因此，平滑肌细胞源性泡沫细胞的凋亡主要发生在纤维区，而巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡主要发生在病变的脂质核心处，后者比前者更易发生 6 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 凋亡，特别是在脂质核内和脂质核周围，在脂质核的非细胞部分可发现其凋亡残留物。 平滑肌细胞凋亡和巨噬细胞凋亡对动脉粥样硬化病变的意义不同，在斑块易损部位平滑肌细胞凋亡能引起纤维帽的强度减弱，平滑肌细胞凋亡只是斑块破裂的一个征兆，并非会直接导致斑块破裂，平滑肌细胞凋亡不可能通过纤维帽变薄 [9]来促进斑块破裂。有研究报道，巨噬细胞分泌的Fas配体可诱导血管平滑肌细 [10]胞凋亡，而血管平滑肌细胞凋亡也可增加巨噬细胞凋亡，由于这能减少巨噬细胞因过度表达基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)而对细胞外基 [11]质的破坏，所以有利于斑块的稳定。 1.3巨噬细胞与动脉粥样硬化的治疗 动脉粥样硬化是多因素作用的复杂病变，在其发生发展中巨噬细胞有着重要的作用，抑制巨噬细胞内脂质聚集、减轻炎症反应，以及选择性调控其凋亡程序将成为动脉粥样硬化新的有效的治疗手段。目前临床上已有多种对抗动脉粥样硬化的治疗方法，如降脂治疗、他汀类药物的应用及血管源性细胞活素疗法等，都直接或间接地影响着巨噬细胞的凋亡。相信，随着蛋白组学和基因芯片等技术的逐步完善，我们将会对动脉粥样硬化中巨噬细胞的凋亡进行更有利的调控，从而使动脉粥样硬化有更好更广阔的临床治疗前景。 2. 声动力治疗 2.1声动力治疗的概况 1989年国际超声学会议上，日本学者Umemura S首次提出了SDT这一概念。SDT是指对肿瘤患者静脉注射声敏剂后，应用一定频率和强度超声作用于肿瘤部位，使聚集在肿瘤部位声敏剂产生抗肿瘤因子从而对肿瘤细胞进行杀伤，抑制肿瘤的进一步生长。SDT有其独特的优越性:无创性、超声治疗装置简单易操作、靶向治疗、特异性强、副作用小。 2.2声动力治疗的机制 SDT作用机制目前仍不清楚，主要的有超声空化效应、自由基理论、单线态氧机制等。 7 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 2.2.1超声空化效应 超声空化效应是指液体中的微小气泡(空穴) 在声波作用下所发生的振荡、扩大、收缩乃至崩溃等一系列动力学过程，从而产生如化学反应、发光、次谐波等现象。 2.2.2自由基理论 自由基理论认为由于超声的空化作用激活空化泡内或临近的光敏剂，通过直接热分解弱键或与水热分解形成的?H 和?OH 反应产生光敏剂来源的自由基，自由基与O 反应形成烷氧自由基和过氧基对有机溶液中的有机分子反应活性低,2 [14]更容易到达靶细胞而发挥作用。 2.2.3单线态氧机制 超声过程中超声空化导致声致发光，光激活空化泡内或临近的光敏剂分子而 O 具有细胞毒性作用，其较大的扩散半径,能穿透线粒体膜,参产生单线态氧。 2 与电子传递和氧化作用;能穿透核膜，造成DNA 的损伤;导致胞膜脂质过氧化而杀伤细胞等。 2.3声敏剂 [15]目前研究中所使用的声敏剂主要分为三类:卟啉类化合物、抗炎药物、抗癌症药物。理想的声敏剂不但要求化学纯性、有效的声敏化作用，还要对靶组织有较好的选择性，对人体毒副作用小，可以迅速的从体内排除等，目前认为较好的声敏剂仍是以卟啉类为主。卟啉类化合物作为声敏剂用于临床诊断和治疗恶性肿瘤已有20多年，其能在肿瘤部位聚集，卟啉由通过超声产生的能量转移给电子而激发，产生具有细胞毒性的自由基。 ALA 属于第二代光敏剂。与其他光敏剂相比，具有光毒性副作用小，用药后避光时间短，渗透性好，对组织深层病变的疗效和选择性更佳等优点，成为目前光动力治疗领域研究的方向和热点。ALA是一简单的五碳化合物，多以盐酸盐形式存在。分子式为CHNO?HCl，为白色或微黄色针状结晶或粉末， 能溶于水和593 乙醇，极微溶于乙醚和乙酸乙酯。它是人体血红素代谢的内源性前体物质， 体 [16]内代谢途径见图1。 8 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 ALA在各种酶的激活下生成原卟啉(Pp?)，原卟啉?是血红素内源性合成代 [22]谢途径中的一种前体，其化学结构如图2所示。细胞内的Pp?是一种很强的光敏物质，最大吸收峰值位于630 nm，光敏毒副反应小，是重要的光动力治疗药物。Pp?是一种非常有效的光敏剂，它在一定波长的光照射下，发生化学反应， 产生单重态氧和氧化物， 引起细胞膜、线粒体和核酸的损伤，使病变细胞坏死、 [17]凋亡，从而起到治疗疾病的作用。 图1 ALA体内代谢途径 Fig1.The metabolic pathway of ALA in vivo B A 图2. 声敏剂分子结构 A. ALA B. 原卟啉IX 2.4声动力治疗与动脉粥样硬化斑块 Fig. 2 Molecular structure of sonosensor A. ALA B.protoporphyrin IX 9 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 1989 年Umemura 等通过在体和细胞的实验研究表明，血卟啉介导的超声治疗比单纯的超声诱导肿瘤细胞坏死明显增多，由此首次提出了声动力治疗的概念[18]。其机理可能是主要地与超声的空化作用激活聚集在癌组织的血卟啉产生单线态氧，引起病变组织细胞的坏死和凋亡。 2002年Arakawa K等研究了声动力治疗用于兔股动脉置入支架后再狭窄预 [19]防作用，而声动力治疗对动脉粥样硬化斑块的作用的研究目前国内外未见报道。 3. ATP 三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“分子通货”，储存和传递化学能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。 3.1 机体内ATP生物学作用 三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“分子通货”，储存和传递化学能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。人体中ATP的总量只有大约0.1摩尔。人体每天的能量需要水解100-150摩尔的ATP即相当于50至75千克。这意味着人一天将要分解掉相当于他体重的ATP。所以每个ATP分子每天要被重复利用1000-1500次。ATP不能被储存，因为ATP的合成后必须在短时间内被消耗。 ATP还可作为能源物质。肌肉中储藏着多种能源物质，主要有三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸(CP)、肌糖原、脂肪等。 ATP亦参与能源物质的代谢:(一)无氧代谢:剧烈运动时，体内处于暂时缺氧状态， 在缺氧状态下体内能源物质的代谢过程，称为无氧代谢。它包括以下两个供能系统。 ?非乳酸能(ATP—CP)系统—一般可维持10秒肌肉活动 无氧代谢 ?乳酸能系统—一般可维持1~3分的肌肉活动 非乳酸能(ATP—CP)系统和乳酸能系统是从事短时间、 剧烈运动肌肉供能的主要方式。ATP释放能量供肌肉收缩的时间仅为1~3秒， 要靠CP分解提供能量，但肌肉中CP的含量也只能够供ATP合成后 分解的能量维持6~8秒肌 10 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 肉收缩的时间。因此， 进行10秒以内的快速活动主要靠ATP—CP系统供给肌肉收缩时的能量。 乳酸能系统是持续进行剧烈运动时，肌肉内的肌糖元在缺氧状态下进行酵解， 经过一系列化学反应，最终在体内产生乳酸，同时释放能量供肌肉收缩。 这一代谢过程，可供1~3分左右肌肉收缩的时间。 (二)有氧代谢:是在氧充足的条件下，肌糖元或脂肪彻底氧化分解，最终生成二氧化碳(Co2)和水(H2O)， 同时释放大量的分解代谢，称为有氧氧化系统。 3.2 ATP与“find-me”信号 人体内每一天都会更新数以亿计的细胞，而这种快速的、有效地、免疫的清除死亡细胞的方式需要通过吞噬细胞选择性识别、吞噬凋亡细胞来实现。近期研究表明一类由凋亡细胞释放的可溶性介质在趋化吞噬细胞中起到了重要作用，而这种介质我们称之为“find-me”信号。这些信号包括溶血磷脂酰胆碱、趋化因子、ATP、UTP、S1p等等。其中ATP等确认可以在体内环境下，起到对单核细胞的吸引作用，因此“find-me”信号这一概念证实了凋亡细胞确实对趋化吞噬细 [12]胞有积极地作用。 3.3 ATP与caspase 凋亡细胞释放核苷酸依赖于caspase途径的调节功能。在诱导细胞凋亡之前加入caspase抑制剂zVAD-fmk后所取上清液不能够诱导单核细胞聚集，证明凋 [13]亡细胞释放的ATP依赖于caspase途径并受其调节。 11 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 前 言 动脉粥样硬化是一种与多种危险因素有关的复杂疾病，炎症是其发生发展重要的病理生理机制之一，炎症细胞在动脉粥样硬化斑块内大量浸润会导致斑块的不稳定，而不稳定斑块的破裂恰恰是许多急性心血管事件的触发点。声动力治疗是通过超声诱导声敏剂来杀伤细胞的新方法，但是在声动力治疗巨噬细胞后死亡的巨噬细胞及斑块内堆积的脂质需要趋化更多的单核细胞进入斑块进行清除，才能达到改善斑块内的炎症环境的目的。本研究用transwell方法证明声动力治疗后的巨噬细胞上清能够趋化单核细胞，而且这种趋化能够被ATP酶部分的抑制。用荧光素酶法，证明声动力治疗巨噬细胞后细胞内及释放到上清中的ATP增多，而在抑制了caspase途径凋亡后，这种增多的趋势减弱。本研究验证了声动力治疗巨噬细胞能够趋化单核细胞，并探讨了ATP在趋化过程中的作用，对声动力治疗动脉粥样硬化的机制进行了有益的探索，并为动脉粥样硬化的治疗提示了一个可能的新方向。 12 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 材料与方法 1. 实验对象 THP-1,人急性单核细胞白血病细胞系， 中科院上海细胞库 2. 试剂与仪器 2.1主要试剂 5-氨基酮戊酸(ALA) 天丰生物科技有限公司，西安 牛胎血清，RMPI1640培养基 Hyclone化学公司，北京 青霉素G，链霉素 Beyotime生物技术，江苏 12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA) Darmstad公司，德国 ATP检测试剂盒 碧云天生物技术有限公司， 上海 ATP酶 碧云天生物技术有限公司，上海 台盼蓝 碧云天生物技术有限公司， 上海 N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk) BioVision公司，美国 2.2主要仪器 Transwell Corning公司，美国 Luminometer Thermo 公司，美国 3.5cm细胞培养皿 Corning公司，美国 IX 71型荧光显微镜 Olympus公司，日本 3. 实验方法 3.1 细胞培养 THP-1(人急性单核白血病细胞系)作为实验用细胞系。使用添加有10%胎牛血清和50μg/ml的青霉素G-链霉素的RPMI1640培养基孵育THP-1细胞。将培养基保存在37?、含5%CO和95%空气的保湿孵育器内，当发生聚集时进行传代2 13 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 5培养。实验时，将细胞以每孔1x10的数目植入3.5cm细胞培养皿，并加入添加有浓度为10μg/ml PMA的培养基培养72小时即成为巨噬细胞。 3.2 SDT治疗 向3.5cm培养皿内的巨噬细胞加入终浓度为15μg/ml的ALA，孵育2小时 2后，用频率为1MHz，强度为0.8W/cm的超声辐照5 min,之后以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次，加入无血清细胞培养液继续培养。 3.3 Transwell 取SDT后6小时细胞上清、对照组细胞上清、ATPase组及SDT-ATPase组细胞上清，分别加入transwell板下层， 并在transwell板的小室内加入密度为610/ml的单核细胞，继续在胞培养箱内培养1 h后，对下层细胞进行台盼蓝染色，用显微镜拍照后统计下层细胞数。 3.4 荧光素酶法检测细胞上清及细胞内ATP 取SDT后20min、对照组、zVAD-fmk组及SDT&zVAd-fmk 组细胞上清及细胞裂解液，分别加入配置好的ATP检测工作液当中，反应10s后使用luminometer分别检测细胞上清液及胞内ATP含量。 4. 统计分析 各组数据采用均数?差表示，用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P , 0.05 为差异有意义。 14 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 技术路线 THP-1巨噬细胞 SDT- ATPase组 ATP酶组 SDT组 对照组 ATPase ATPase 细胞上清液 Transwell THP-1 巨噬细胞 对照组 zVAD-fmk组 SDT组 SDT -zVAD组 细胞裂解产物 细胞上清液 萤火虫荧光素酶 Luminometer 15 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 结 果 1.培养THP-1单核细胞并将其诱导为巨噬细胞，见图3 A B 图3 A THP-1单核细胞 B 巨噬细胞 (200X) 2. Transwell方法测定细胞上清液对单核细胞趋化作用，见图4 A 16 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 B C 图4 A Transwell实验模式图 B 用光学显微镜观察募集的台盼蓝染色后的单核细胞，并计数 C 细胞迁移数 (***:P<0.05;#:P>0.05) 从募集的单核细胞数量来看，声动力治疗组明显高于对照组，P<0.05;加入ATPase并进行声动力治疗组与声动力治疗组相比显著降低，对照组与ATPase组无统计学差异。 3(荧光素酶法测定上清及细胞内ATP含量，见图5 17 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 A B 图5 A ATP浓度与荧光强度标准曲线 B 各组ATP浓度(**:P<0.05;#:P>0.05) 声动力治疗后的ATP浓度明显高于对照组，约为其3倍;加入zVAD-fmk并进行声动力治疗组较声动力组显著降低;对照组与zVAD-fmk无统计学差异;SDT-zVAD组与对照组无统计学差异。 18 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 讨论 [20,21]动脉粥样硬化目前已经成为了全球范围内，人类健康的严重威胁。巨噬 [22]细胞介导的炎症反应是导致易损斑块破裂的主要因素，因此在动脉粥样硬化进展中对巨噬细胞积极性干预，对于预防急性心血管事件的发生具有非常重要的临床意义。 有研究认为，在斑块早期，因单核吞噬系统对凋亡巨噬细胞清除能力正常，不会出现继发性的炎症反应和坏死;而随着病变的进展，单核吞噬系统对凋亡坏 [23]死物的吞噬清除功能发生障碍，导致斑块内炎症反应加剧，脂质坏死核心扩大，诱发斑块破裂、血栓形成，引发急性心血管事件。在这个过程中，凋亡细胞释放的一系列信号，包括“find-me”、“keep-out” 、“don’t-eat-me”和“come-get-me”信号等，能够调节单核性吞噬细胞的趋化活性和吞噬功能。目前有研究表明，凋亡细胞释放的核苷酸可以作为一种“find-me”信号参与对单核性吞噬细胞的募[13]集。 为了验证SDT治疗巨噬细胞后对单核细胞趋化的效果以及凋亡细胞释放的核苷酸作为“find-me”信号的趋化功能，我们进行了一系列实验。首先，我们采用transwell 趋化性实验证明声动力治疗后的凋亡巨噬细胞能够趋化单核性吞噬细胞，并且初步验证核苷酸能够作为一种“find-me”信号(从现有药品及可行性出发，我们初步选定ATP作为验证对象)。取SDT后6小时细胞上清、对照组细胞上清、ATPase组及SDT-ATPase组，分别加入transwell板下层， 6并在transwell板的小室内加入密度为10/ml的单核细胞，继续在胞培养箱内培养1 h后，对下层细胞进行台盼蓝染色，用显微镜拍照后统计下层细胞数。SDT组较对照组单核细胞数显著增加。此实验结果证实声动力治疗后的凋亡巨噬细胞能够趋化单核细胞的聚集。而SDT-ATPase组较对照组显著下降说明ATP可能作为一种“find-me”信号在凋亡巨噬细胞趋化单核细胞的过程中起到一定的作用。 为进一步验证ATP为凋亡细胞释放的一种“find-me”信号，我们使用luminometer测定声动力治疗后ATP浓度。取SDT后20min、对照组、zVAD-fmk组及SDT-zVAd 组细胞上清及细胞裂解液，分别加入配置好的ATP检测工作液当中，反应10s后使用luminometer分别检测细胞上清液及胞内ATP含量。SDT组明显高于对照组，而SDT-zVAd组较SDT组显著降低。本实验证明声动力治疗后的凋亡巨噬细胞促进ATP的释放，从而趋化单核细胞的聚集;而且ATP的释放与caspase途径依赖的凋亡有关。 综上所述，本实验证明了声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞，从而为声动力疗法治疗动脉粥样硬化的机制进行了有益的探索，对声动 19 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 力治疗动脉粥样硬化的临床应用起到了推动作用。 20 哈尔滨医科大学 七年制学生基础阶段科研论文 病理生理学教研室 结论 1. 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞聚集。 2. 声动力治疗巨噬细胞后ATP释放增加依赖于caspase途径的凋亡。 致谢 在七年制基础科研训练即将完成之际，首先向我们的指导教师田野教授表示最衷心的谢意～本论文是在田老师的细心指导下完成的，在课题设计，实验进行和结果分析的整个过程中处处都凝聚着老师的心血。他独特的思维方式，严谨的治学态度，执着的事业追求和崇高的敬业精神以及对学生的严格要求和细心关怀令我们受益终生，他的人格魅力也令我们难忘，所有的这些也将成为我们今后做人做事的准则。 特别感谢孙鑫师兄、郭淑媛师姐、陈海波师兄在课题设计和实验过程中给予的悉心指导和无私帮助，在实验方面的大力支持，在实验中给予的意见和建议，使我们受到很大的启发，为实验的顺利进行打下了良好的基础。感谢本教研室的刘畅、旦菊花、姚剑挺、田芳等师兄师姐在实验上对我的支持。感谢同组七年制的郑子玲、黄宇航、马伟康同学，在一起为了实验而奋斗的日子里，我们一起收获了成功的喜悦、拼搏的艰辛，这段难忘的时光，我们结下了深厚的友谊，这些都是我们终生的财富。 感谢哈尔滨医科大学病理生理教研室为我们提供了一个良好的科研环境，这里，不仅培养了我们的科研能力、创新思维，也增强了我们的独立性和自信心，同时，也让我们学到了书本上学不到的知识，这是一笔难得的人生财富，将陪伴我们在以后的事业中，勇往直前。衷心地祝愿病理生理教研室的全体老师和同学工作顺利，身体健康～祝愿病理生理教研室永远辉煌～ 最后，感谢哈尔滨医科大学临床医学七年制的所有同学在日常学习生活中对我们的帮助和支持～ 21 哈尔滨医科大学 声动力治疗巨噬细胞通过促进ATP释放趋化单核细胞 ?病理生理学教研室 参考文献 1.LI JJ，FANG C H(Atheroscleritis is a more rational term for the pathological entity currently known as atherosclerosis[J](Med Hypotheses，2004，63(1):100-102( 2.LI JJ(Inflammation:an important mechanism for different clinical entities of coronary artery disease[J](Chin Med J，2005，118(21):1817-1826( 3. 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