大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在碳源限制培养基中乙酸的积累

大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在碳源限制培养基中乙酸的积累 大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在 碳源限制培养基中乙酸的积累 Vo1.33No.4 2007—08 华东理工大学(自然科学版) JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology(NaturalScienceEdition)475 文章编号:1006—3080(2007)04—0475—06 大肠杆菌DH5a及其耐乙酸突变株DA19在 碳源限制培养基中乙酸的积累 张晓云,张艳军,李志敏,叶勤 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237) 摘要:在碳源限制的基本培养基和复合培养基中分别对大肠杆菌DH5a及其耐乙酸突变株 DA19进行分批培养,两者在复合培养基中的乙酸产量均明显高于基本培养基,相同培养基中 DH5a的乙酸产量高于DA19.基本培养基中分批培养的物料衡算显示:DH5a通过三羧酸(TCA) 循环和呼吸链提供能量的葡萄糖低于DA19,通过乙酸形成途径的量则增加,表明DA19的TCA 循环或电子传递链氧化能力有所提高,而DH5a的TCA循环或电子传递链的能力限制使更多的 葡萄糖通过形成乙酸来提供能量.能量需求的计算结果表明:在碳源限制的复合培养基中,有机氮 源的异化代谢提供了部分能量,在丙氨酸和谷氨酸为碳氮源的基本培养基中的分批培养也表明氨 基酸的异化代谢对乙酸产生的影响. 关键词:大肠杆菌;突变株;培养基;乙酸;耐受性 中图分类号:Q935文献标识码:A AceticAcidAccumulationin Acetate-TolerantM EscherichiacoliDH5aandIts utantDA19CulturedinCarbon-LimitedMedia ZHANGXiao—yun,ZHANGran—jun,LZhi—min,YEQin (StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversity ScienceandTechnology,Shanghai200237,China) of Abstract:BatchcultivationsofEscherichiacolDH5aanditsacetate— tolerantmutantDA19wereper— formedincarbon— limiteddefinedandcomplexmedia.Theaceticacidproductioninthecomplexmediawas morethanthatinthedefinedmedium.AdecreaseinaceticacidproductioninDA19wasobservedcom— paredwithDH5awhenculturedinthesamemedium.Thecarbonbalanceofbatchcultivationsinthe definedmediumshowedthatglucosedegradedthroughtricarboxylicacid(TCA)cycleandrespirationchain inDH5awasmuchlessthanthatinDA19,andthusglucosecatabolizedthroughaceticacidproduction pathwaywasmuchmorethanthatinDA19tosupplyenergy.ThissuggestedthatalowercapacityofTCA cycleand/orrespirationchainofDH5awasresponsibleformoreaceticacidproduction.Theenergybal— ancesuggestedthatapartoftheorganicnitrogensourceswasdegradedtoprovideenergyinadditionto glucosewhenDH5aandDA19werecultivatedincarbon— limitedcomplexmedia.Batchcultivationsof DH5aandDA19inadefinedmediumwithalanineandglutamateasthecarbonandnitrogenso urcesalso indicatedthatthecatabolismofaminoacidscontributedtoaceticacidproduction. 收稿日期:2006—09—11 基金项目:国家863项目资助(2002AA217021) 作者简介:张晓云(1975),女,山东人,博士,研究方向为生物化工. 通讯联系人:叶勤,E—mail:qye@ecust.edu.cn 华东理工大学(自然科学版)第33卷 Keywords:Escherichiacoli;mutant;medium;aceticacid;tolerance 大肠杆菌作为表达外源基因应用最广泛的宿主 菌之一,已经应用于许多具有药用价值的蛋白生产, 如干扰素,白介素,胰岛素及一些酶类等.但是大肠 杆菌在以葡萄糖为碳源的培养过程中,会分泌乙酸, 累积到一定浓度时会抑制菌体生长,降低目标蛋白 的合成. 微生物在基本培养基中培养时,由于组成培养 基的化合物成分完全明确,发酵过程的重复性比较 好,目标蛋白的分离纯化比较容易.但是微生物需 要合成所有的细胞组分,与可以直接为细胞提供各 种氨基酸,核苷(酸)等物质的复合培养基相比,基本 培养基的发酵效率要低得多[.因此,在大肠杆菌 的发酵培养中,为使菌体生长更好或者提高重组蛋 白的生产力,往往需要使用复合培养基;而使用复合 培养基通常会增加乙酸的产生].通常使用添加 葡萄糖的复合培养基进行研究,对于有机氮源 的异化代谢对乙酸的产生是否有影响却没有详细研 究.复合培养基中的蛋白胨和酵母抽提物含有丰富 的游离氨基酸,一些氨基酸除了直接参与蛋白的合 成外,还可以通过异化代谢经丙酮酸或其他中问物 形成乙酰CoA.其中丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用 下会产生乙酸;乙酰CoA除了进入三羧酸(TCA) 循环,也可以由Pta—Ack途径产生乙酸.例如,丙氨 酸脱氨后直接形成丙酮酸,丙酮酸形成的乙酰 CoA大部分进入了乙酸形成途径[.然而,对于 大肠杆菌在碳源限制的复合培养基中乙酸的产生还 没有详细的研究报道. 本实验室由大肠杆菌DH5a筛选出的耐乙酸突 变菌DA19的乙酸产量明显降低"".本研究在碳 源限制的基本培养基和复合培养基中对DH5a和 DA19进行了分批培养,比较了两者在基本培养基 中和复合培养基中的代谢和碳源需求的差异,探讨 了有机氮源的异化代谢对乙酸产生的影响. 1材料与方法 1.1菌种 E.coliDH5a[supE44AlacU169(801acZ—AM15) hsdR17recA1endA1gyrA96thi一1relA1];DA19 是DH5a的耐乙酸突变株:.两者均用250g/L 的甘油在20.C保存. 1.2培养基 M培养基(1L):Na.HPO?12H2O15.12g, KH2PO43g,NaC10.5g,NH4C11g,葡萄糖2g, MgSO4?7H2O0.5g,CaC120.011g,维生素B1(10 g/L)0.2mL,微量元素混合溶液0.2mL,腺嘌呤 10mg,pH7.0.微量元素混合溶液(1L)包括: FeSO4?7H2O8Og,MnSO4?H2O10g,A1C13? 6H2O10g,CoC124g,ZnSO4?7H2O2g, Na2MoO4?2H2O2g,CuCl2?2H2O1g;H3BO4 0.5g. 氨基酸为碳氮源的基本培养基:含1.05g/L的 丙氨酸和1.1g/L的谷氨酸,不添加葡萄糖和 NHC1,其他成分与M培养基相同. LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母抽提物5, NaC110,pH7.2.LBG培养基:LB培养基补充葡 萄糖2g/L.2LBG培养基(g/L):蛋白胨20,酵母 抽提物10,NaC110,葡萄糖2,pH7.2.蛋白胨和酵 母抽提物均为英国Oxoid公司产品. 1.3培养条件 将一20?保存的菌种1mI接入装有30mL LB培养基的250mL摇瓶中,转速250r/min,30.C 培养12h,然后转接3mL于装有100mLLB的 500mL摇瓶中培养10h,作复合培养基分批发酵二 级种子;或转接3mL于100mIM培养基中,相同 条件DA19培养10h,DH5a培养17h,作基本培 养基中分批发酵的二级种子. 分批培养在5L玻璃发酵罐(RIBE5—11I型,华 东理工大学)中进行.装液量2.5L,接种量200 mI,搅拌转速500r/min,培养温度30.C,通气量4 L/min,用2mol/INaOH和H2SO1控制pH7.0, 采用国家生化工程技术研究中心(上海)开发的 Tophawk控制软件. 1.4分析方法 菌体浓度测定采用浊度法,将培养液适当稀释 后.在600nm测定其光密度()D..(上海欣茂仪器 公司721型),在一定的范围内()D...与菌体干重成 线性关系.葡萄糖浓度用葡萄糖试剂盒(上海科欣 生物技术研究所)测定.乙酸浓度用离子色谱法测 定(DionexICS1500离子色谱仪,IonpacAS11-HC 4mm×250mm阴离子分析柱,IonpacAG11一HC4 mm×50mm保护柱,电导检测器).氨基酸用邻苯 二甲醛(OPA)衍生后,用高压液相色谱测定(安捷 第4期张晓云,等:大肠杆菌DH5a及其耐乙酸突变株DA19在碳源限制培养基中 乙酸的积累477 伦hp1100,HypersilAA—ODS200mlTl×2.1mill 柱,DAD检测器). 2结果与讨论 2.1基本培养基中的分批培养 中以M培养基分批培养时表现出明显不同的代谢 特性,尤其是生长速率和副产物乙酸的形成具有显 着差异(见表1).DA19的最大比生长速率(…) 是DH5a的3倍,菌体关于葡萄糖的得率(yx/c)提 高了50%;而乙酸最高浓度和以菌体为基准的乙酸 生产(y,x)分别为DH5Q的33和21.4. 2.1.1代谢特性DH5Q和DA19在5L发酵罐 表1DH5a和DA19在不同培养基中分批培养的参数 Table1ParametersofE.coliDH5dandDA19culturedindefinedandcomplexmedia Drycellweight/D(Aceticacid)/ MediumStrain'(g?L)(g?L)/~/h1YX/G/(g"gYA/X/(g' [g.(.h / )] Q 1.31 0.28 0.69 0.34 0.81 0.59 0.83 0.73 0.21 0.14 0.48 0.23 0.50 0.46 0.55 0.54 1)MeasuredwhenglucosewasusedupinM,LBGand2LBG,orattheaceticacidpeakvalueinL B;2)Peakvalue;3)Valueintheexponen tialphase 2.1.2葡萄糖的利用在基本培养基中,葡萄糖同 时作为碳源和能源,一部分经同化构成细胞成分,一 部分异化代谢产生能量供细胞代谢活动使用,其中 部分通过三羧酸(TCA)循环/呼吸链产能,另一部 分通过形成乙酸产能.根据DH5a和DA19的碳含 量和生成的乙酸量对分批培养结果进行碳源物料衡 算,结果见表2.可以看出,DA19用于构成菌体 所消耗的葡萄糖比DH5多;DH5a则需消耗更多 的葡萄糖进行异化代谢来提供能量,其中通过乙酸 形成途径提供能量的葡萄糖远高于DA19,通过 TCA循环和电子传递链进行异化代谢为细胞提供 能量的葡萄糖却比DA19少得多. Reiling等..对大肠杆菌B/r进行连续培养时, 发现葡萄糖比消耗速率随稀释率增大直线增加,而 氧的比消耗速率在产乙酸临界稀释率时达到最大 值,超过该临界稀释率则保持在这一水平不再增加, 因而电子传递和(或)与之伴随的氧化磷酸化的限 制,导致通过产生乙酸获得ATP.Han等?的研究 表明,大肠杆菌在低生长速率时,有氧代谢可以满足 细胞合成的能量需求,然而在高生长速率时,能量需 求超过细胞氧化代谢的能力,由有氧代谢和乙酸形 成途径共同满足能量的需求.Majewski等u认为 TCA循环和电子传递系统的有限能力都是大肠杆 菌产生乙酸的主要原因,TCA循环的限制启动乙酸 的产生,而电子传递系统的限制则在近最大比生长 速率时影响乙酸的形成.在基本培养基中分批培 养,DH5a比DA19生长少而产乙酸多,反映其 TCA循环/电子传递链的能力比DA19低,所以更 多的葡萄糖通过乙酸形成途径产生能量供给维持和 合成需要. 表2基本培养基中异化代谢的葡萄糖流向分配 Table2Distributionoftheutilizedglucosewhenculturedin theMmedium 一 ?S,ASxandAScaretotallyconsumed,anabolizedand catabolizedglucose,respectively;一ASRand—ASAareglucose degradedthroughEMP——TCA——respirationchainandthatthrough EMP—PTA—ACKpathwayrespectively 2.2碳源限制的复合培养基中的分批培养 2.2.1代谢特性采用LB为基础的复合培养基 培养DH5a和DA19,结果见表1.在碳源限制的复 合培养基中,DH5a和DA19的生长速率差异不大, 一一L\L\ HAHAHAHA DDDDDDDD M吼一 478华东理工大学(自然科学版)第33卷 但代谢仍然存在很大差异.在不含碳源的LB中, DH5a和DA19的菌体浓度比在M培养基中增加 不多,但/a…显着增大.在LBG和2LBG中,葡萄 糖的加入使菌体浓度大大提高,DA19以菌体为基 准的乙酸生产和乙酸比生产速率(Q)都比DH5a 低,y/.比DH5a高.加入葡萄糖后,DH5a及 DA19在复合培养基中乙酸比生产速率都比在基本 培养基中高,乙酸最高浓度也明显高于基本培养基. 增加有机氮源浓度(2LBG中),乙酸积累量也提高. 另外,两者在LBG和2LBG中的比生长速率接近, 菌体浓度也没有明显提高,反映了在LBG和2LBG 中生长时碳源或能源的限制. 2.2.2能量需求在基本培养基中,葡萄糖的异化 代谢主要满足3方面的能量需求:维持,合成氨基酸 和核苷酸等生物大分子的单体和由单体合成生物大 分子;而在营养丰富的复合培养基中葡萄糖很少形 成菌体,主要起能源作用口,细胞可以直接利用培 养基中的小分子单体来合成大分子,因此能量需求 只包括维持和合成生物大分子. 对DH5a和DA19在基本培养基中的分批培养 过程建立动力学模型,并采用单纯型和龙格一库塔 法优化估计模型参数和模拟(数据未显示),得到的 维持系数分别是0.0291和0.0229g/(g?h),从 而可以计算它们在各种培养基中维持生长所需要的 葡萄糖u. 设大肠杆菌的P/O比是2,根据大肠杆菌的菌 体组成l1ll及表2中DH5a和DA19通过酵解 (EMP)一磷酸转乙酰酶(PTA)一乙酸激酶(ACK)和 EMP—TCA一呼吸链两条途径代谢葡萄糖的比例,可 以计算合成单体及由单体合成生物大分子并最终集 合成细胞的能量需求相当的葡萄糖口. 假设DH5a和DA19在基本培养基和复合培养 基中合成单位菌体时由单体合成大分子需要的能量 相同,可以根据菌体和乙酸形成,计算复合培养基中 用于满足DH5a和DA19维持及合成大分子能量需 求相当的葡萄糖,结果见表3. 可以看到,在IBG和2IBG中DH5a和DA19 需要的葡萄糖量超过了实际添加的葡萄糖量,因此 有一部分有机氮源通过异化代谢途径参与了能量供 应,且在2LBG中因生长有所增加而使异化代谢的 有机氮源比在LBG中更多.DH5a需要的葡萄糖 量显着高于DA19,表明其能量代谢效率比DA19 低,因此需要更多的葡萄糖提供能量. LB中总糖的含量低于0.1g/L(以葡萄糖计), 可以忽略不计,因此在LB中完全由有机氮源异化 代谢提供能量,积累的乙酸全部来源于有机氮源的 异化代谢.DH5a在2LBG中产生的乙酸最大值是 1.48g/L(表1),超过了实际添加的1.97g/L葡萄 糖产生乙酸的理论值,说明部分乙酸来源于有机氮 源的异化代谢. 表3复合培养基中提供能量所需葡萄糖的计算值与实际 值比较 Table3Comparisonofglucosedemandwithmeasuredglu— coseconsumptionincarbon-limitedcomplexmedia DH5a和DA19在葡萄糖限制的复合培养基 中,乙酸产量比在M培养基中明显增加(表1). Gray等5]认为由于复合培养基含有游离氨基酸, 使得细胞不需要再由TCA循环合成相关前体化合 物,TCA循环的酶受到阻遏而活力很低,而在基本 培养基中由于合成的需要,TCA循环酶的阻遏解 除,酶活提高.在LBG和2LBG中乙酸产量明显增 加,可能也是这种阻遏作用使更多的乙酰CoA通过 乙酸形成途径提供能量,其中部分的乙酰CoA是由 有机氮源产生的.在2LBG中形成的菌体比在 LBG略多,ATP的需求更多,因此在2LBG中的乙 酸产量要高. 因DH5a的TCA循环/电子传递链能力限制, 使得更多的葡萄糖和有机氮源需要通过乙酸途径提 供能量,因而DH5a在复合培养基中产生的乙酸也 比DA19高. 2.3以氨基酸作为碳氮源的基本培养基中的分批 培养 氨基酸是蛋白胨和酵母抽提物中的主要成分, 一 些氨基酸可以经异化代谢生成丙酮酸_7,而丙 酮酸可经乙酰CoA由ACK—PTA途径或在丙酮酸 氧化酶作用下产生乙酸.为了考察氨基酸异化代谢 时乙酸产生情况,在以氨基酸为碳氮源的基本培养 基中进行了DH5a和DA19的分批培养. 预实验表明DH5a和DA19在以一种氨基酸为 碳氮源的基本培养基中生长缓慢(尤其是DH5a), 用丙氨酸和谷氨酸为碳氮源时DH5a和DA19生长 相对较快.因此本实验采用丙氨酸和谷氨酸作为碳 氮源.DH5a和DA19在丙氨酸和谷氨酸做碳氮源 第4期张晓云,等:大肠杆菌DH5a及其耐乙酸突变株DA19在碳源限制培养基中 乙酸的积累479 的基本培养基中分批培养结果见图1. ,0. I, 萎0. 0. 毛. 占毛o. ,0. 一 岛0. 一n 0. O O 0 磊, 量 u口 磊 j^ 百Z 图1DA19和DH5a在丙氨酸和谷氨酸为碳氮源的基本培 养基中分批培养 Fig.1BatchcultivationofE.coliDA19andDH5ain definedmediumwithalanineandglutamicacidas carbonandnitrogensources ?一Drycellweight;口一NH;?一Aceticacid}?一Alanine} o--Glutamicacid 与DA19相比,DH5a的生长要慢很多,但最终 菌体浓度接近.培养过程中谷氨酸的浓度虽然有所 波动,但基本趋势是前期略有降低,后期基本维持不 变;而丙氨酸的整体趋势是随菌体生长迅速降低,直 至消耗完全. 在DH5a和DA19的培养过程中,乙酸是随着 丙氨酸的利用逐渐积累的.大肠杆菌中存在特异于 丙氨酸和甘氨酸的通用运输系统,L一丙氨酸由通 用载体运输到胞内后,不仅可作为碳源被细胞利用, 同时也可为细胞提供氮源.L一丙氨酸在丙氨酸 消旋酶作用下转变为丙氨酸;D-丙氨酸在D一氨 基酸脱氢酶的作用下氧化脱氨为丙酮酸和NHJ. 而以丙酮酸为碳源培养大肠杆菌,会有很大一部分 的碳源流量进入代谢副产物——乙酸形成途 径].当丙氨酸完全消耗时乙酸的浓度达到最大 值,DA19产生的乙酸最高浓度为0.20g/L,为 DH5Q的77.4;YA为0.745g/g,为DH5a的 70.3.丙氨酸消耗后菌体开始利用乙酸生长直至 稳定期.虽然整个过程中没有添加氨盐作为氮源, 但是随着丙氨酸的利用,发酵液中不断积累NH[. 谷氨酸和谷氨酰胺既是同化氨的产物,也是胞 内的主要氮源供体,细胞大约88的氮来源于谷氨 酸,12来源于谷氨酰胺.谷氨酸可为大肠杆 菌大部分的转氨酶提供氮源_1.由于E.coliK12 谷氨酸摄取系统活力很低,因此不能以谷氨酸为唯 一 碳氮源生长.但是大肠杆菌存在一种依赖于 结合蛋白的谷氨酸——天冬氨酸共用摄取系统, 发酵初期可摄取到胞内少量谷氨酸并用于其他含氮 化合物的合成,所以DH5a和DA19在丙氨酸培养 基中添加谷氨酸比单独用丙氨酸做碳氮源生长快. 而在快速生长期细胞代谢旺盛,可以自己合成谷氨 酸满足需要,从而使胞外谷氨酸浓度基本维持不变. 3结论 在基本培养基中,葡萄糖的物料平衡显示, DH5a的TCA循环/电子传递链流量比DA19低, 因此DH5a能量产生效率低于DA19,更多的葡萄 糖代谢流量通过乙酸形成途径提供能量,使细胞生 长大大减少. 在碳源限制的复合培养基中,有机氮源的异化 代谢对乙酸产生的贡献是不可忽视的,部分有机氮 源通过异化代谢为细胞生长提供能量.在碳源限制 的复合培养基中乙酸产量明显高于基本培养基,反 映了有机氮源异化代谢产生的乙酰CoA不能畅通 地进入TCA循环. 参考文献 一1.一0gg一/(}{z 0II一磊一味pl3Bu一吕日呈.) 5O5O5 22llOD8 ,,,,一一,一一,一一一一一,一 480华东理工大学(自然科学版)第33卷 [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] nologyProgress,2005,21:1062—1067. 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