氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立(可编辑)

氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测的建立(可编辑) 氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立 河北农业大学 硕士学位论文 氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立 姓名:宋洁 :硕士 申请学位级别 专业:预防兽医学 指导教师:孙继国 20060617摘要 氯霉素是第 个人.合成的广谱抗牛素,冈其效高价廉,住我国畜牧业巾得到』。。泛 应用,对畜禽疾病的控制和治疗起钊了重要的作用。随着氯镖素的广泛应及研究的深 入,发现其有许多毒、剐作用,冈此,必须拧制氯霉系存动物性食品中的残留,保障消 费者健康与安全。 本文分两部分,第~部分将氯搿索 ’、与牛血清蛋白、 卵清门蛋白利用优化的晕氮化法、混合酸酐法、碳化二亚胺法进行偶联及鉴定, 分别作为免疫抗原及包被抗原,免疫抗原注射免疫新西兰大兔获得多抗血清。第部 分建立了快速榆测氯霉素的接竞予 力法,并通过爻验,对检测过程巾的各; 条件进行优化。 分别应』硝重氮化法、混合酸酐法、碳化雌法将。载体蛋 偶联制备 人工合成抗原,以此作为免疫抗原,刚法合成包被抗原。它们的紫外描光谱、? 电泳、动物免疫试验均表明偶联成功。免疫~月龄新西.犬门兔,获得多抗抗 血清,硝闻接乍竞争 法测定抗清效价。数据显示,混合酸酊法在合成氯霉紊 人二抗原方山较优于其他两种方法;.本试验用过碘酸钠改良法制备辣根过 氰化物酶 标址的午抗兔抗体,用辛酸 硫酸铵法、.一、离了交换提纯纯化血清 ,经计算结合物巾各项指标,表明晦轫、抗仆标记成功,并?通过.电泳和 自接?』测定也”‘得出酶标抗体枷、记成功。 采用混合酸酐法制得的免接抗原免疫兔了得到的抗血清进玎问接竞争 实 验, 优化 作条件,建、了问接竞争检测方法。方阵滴定法确定理想 ?.包被抗原的浓度为.?‖,酶标:抗羊抗兔.?作浓度为: 以及多抗一清的工怍浓度为:。以卜述实验条件为基础,以系列 稀释的标准溶液作为检测刘缘,绘制标准曲线,得到的线性回归直线方程为 】. .,相关系数.,从标准曲线可以得知,此方法可测定的最适范 围为/~‖,最小检测限约为 ‖。 夺实验所建立的。方法的精确度以批内误差孔差异和批误筹板’差异 表示,结果表明孔间差异和扳问甲均差异分别为.%和.%,这表明方法精确度 较 好。添加叫收率实验测得氯霉素对鸡肉样本住】~咖范围内的平均同收率为 .%士.%。存可测定浓度范刖内,氯霉素抗皿清与磺胺二甲基嘧啶 】、恩若沙星圳、硫酸链霉素印、菏霉素、 氟哌酸诺氟沙星棚等‘能会因同时使片酊导致共同残留的抗生素药物未艟 示免疫交叉反应性,与结构相似物氯霉紊琥珀酸盐的交叉反应率为,这表明 所 建立的方法有较高特异性和选择性,适合氯霉素药物残留样本快速检测。为 开发具有自 主知识产丰义的氯霉素试剂盒打下了良好的基础。 关键词:氯霉素:人工抗原:多克隆抗体;酶标抗体;间接竞争乩 ‘: 州 :、, :?盯 笆. “ / 啊 , 】 . 九,口、,加已艇,九??佑“押加订:,拓,。如陀, 已.. 体 ’” ““己’。,卵一,,矗 如:疗 , , 乜口 ,.旭, . .“ ,、 ‘ ’ ” ? 譬, 山. “ “., . 、 鲥 】,“? .“酌肼】: .‖, ?.. 二.一.彤.. 芏 “ , ‖【厂‖ 舡 贮‖. ? 枷 . .%..%, .%士.%. 叫龄 ? 窑 川. ,,,川】? . “ :; ; ; ;;“ ? 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也包含为获得塑垦盛些盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签字日期:丑一‖年/月倍曰 学位论文作者签名:未西 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文 被查 阅和借阅。本人授权亟壅些盘望可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索,一以采用影印、缩印或扫描等复制于段保存、汇编学位论 文。 保密的学位论文在解密后适用木授权书 签名 导师 励纯/刃 易丧落 学位论文作者签名: 签字日期:山可舞‖月/扩曰 签字日期:丑弦石年/月/参日 学位论文作者毕业后去向 工作单位: 电话 通讯地址: 邮编氯霉裹全抗原合成的研究及问接检测方法的建立 .引言 氯霉素 又名左霉素、左旋氯霉素、氯胺苯醇,乓化学名称为.一.苏阿 型?对硝基苯基.一‘氯乙酰胺基一,一丙二.醇简称氯丙胺醇,英文名字为、 、、和“.足一种有效的广谱抗菌素,剥葺禽多 种疾病尤其是革兰氏阴性菌感染有很女的控制作用,曾被人们厂泛接受和使 用‘”。作为兽药,常 常被刚阗疗和治疗动物闭细菌、立克次氏体引起的炎疗等疾病,以减,闪其可 能造成的经济损 失。 ?? 。一专一。 ?? 但使用过程中存在严副作崩,其在动物肉、奶、货中的残留严重威胁人畜健康,氯霉素可 引起人体产牛不同的个体反应,如:过鼬性变态反心、肝损伤、视神经炎、新乍儿荻色瘟、血液 疾病、再乍障,?性贫血、一血病等等。闪此,许多国家限制甚至禁.此药朋于乍产食动物,: 对畜广品残留制定了严格的限量标准。欧腽备成员国自年起,已完伞禁氯礞素的应 用,目前将氯霉素的屉高残留浓度定为零限量,美国、加拿人、日本等国家也作相应的限伟舰定 列。 但是,山氯霉索的抑苗效果好,而且价格相对低廉,日前仍有些国家对氯霉素在动物中 的使用不加限制。为了保证我国人民的健康,以及扩人‘世界各国动物性食品的贸易往来,建立 灵敏度高、特异性强、简使易行、经济的方法,测定动物性食品中氯霉素的残留,对于畜禽产舱 的安全控制具有重要意义。 .氯霉素的性质和在体内代谢特点 氯霉素足白色的针状或片状结晶,味极苦,性质极稳定,结晶状的氯霉素熔点 为~?。 水微溶,?溶解度为 ‖,易溶于醇、乙醇、丙二醇、丙酮、厶酸乙酯等有机溶 剂中,水溶液呈中性.反应在以上町失去活性,空温存~的水溶液中能稳定存在 小时以,本品耐热,水溶液煮沸小时不会失效。由于其结构中何发色基日存在,在~ 处有最人吸收峰,敞可直接用紫外分光光度计检测。 ?报道:肉鸡几服给药或,曲,氯霉素吸收迅速,达峰时间分别为. 等 或.,消除半衰期分别为.或.,生物利用:红分别为%和%。用药后分钟血药 分别持续和。此后有学者报道氯霉素在禽肌肉组织的消除时间浓度可达‖, 是~, 而且在鸡体内广泛代谢为去氢氯霉素《.和可硝氯霉素.衍生物。大部分氯霉素主 要在肝中代谢,在肝中 细胞色素结合成复合物斤,经肝细胞内质网中结合酶的作用,河:匕农业大学硕士学付业论文 葡萄醛酸结台成为氯霉素单葡萄糖醛酸酯.,动物肝脏、肾、和血清中一半以上的氯霉 素以。的形式存在。这种代谢物极性高、热稳定性差,与原形药物差异大,在前处理易损 失,需水解为游离的组分测定一葡糖骨酶?水解,但鸡、牛、猪的肌肉组织束发现. 存在。通常肌肉样品中的提取不需要酶解过程”。在肝内小部分氯霉素转变为无作用的氨基 水解产物.约给药量的%~%以原形氯霉素由肾小球滤过排泄。 .氯霉素药理特性与残留危害性 ..氯霉紊药理作用 年茺国耶鲁大学 的科学家‘坝委内瑞拉片都加拉加斯附近 收集的.壤样品中分离得到一种链霉菌 ,琼脂划线培养发现它能抑制临近 的站养物如芽艳杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、人肠什菌、肺炎克甫伯菌、沙 门氏菌和忐船杆菌的生长,这些暴露丁空气中的肉汤培养液水层过滤发现滤液中存在能对儿种革 兰氏阴陛苗有效的抗菌活上物质。把从这些滤液中分离得到的结品状抗荫药物命名为氯霉素 。 氯霉素是广谱抗生豪,对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作。对其敏感的细菌有夫肠杆菌、 产气丰荫、伤寒杆菌、流感打蔺、沙】氏茁、布氏丰丁茼、也氏卡于菌、兜雷伯氏杆菌、胎弧菌等。 火部分敏感菌株可被卜/。的浓度所抑制。本品抗革兰氏刚性球卤的作用不如青霉索汞四环 素类,对绿脓朴菌及真菌无效,但对部分农原体和奇:克次氏体育作片。 氯霉素的抗菌作用机理”’在于抑制菌体蛋白的含成,产生抑菌作川。由于哺乳动物的核蛋白 体与细菌不同,故氧霉素对哺乳动物的核蛋白体无作用。氯霉素对革兰阴性菌也有抑制作用。对 某些厌氧菌有效。对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌较易发生耐药。金葡菌球菌部分 耐药。绿脓杆菌的多数菌株对本品耐药。氯霉素对分枝杆菌属、真菌、病毒则无作用。对原虫无 作川。 ..氯霉素残留危害性 尉人体的危害:自年氯霉素应用丁临床后,在一些感染性疾病,尤其在伤寒流行中取得 良好疗效,但也于年发现本品可造成严重致死性血液系毒性。此后,有芙这方而的报道渐 渐增”。氯霉素引起的副作用有”:氯霉素对人体遗血系统的毒性极大,能使白细胞减少,引起 引起急性中毒性表再生障碍性和溶血性贫血、血小板减少。还可损害视力, 皮松懈症,使眼喻粘 连及产生角膜瘢痕。对新生儿、早产儿以及肿肾功能不全的病人影响更大,新生儿由于肝脏酶系 统末发育成熟,肾脏功能差,氯霉素正容易导致新生儿血药浓度过高而发生毒性反应,而老年人 组织器官退化,功能减退,自身免疫功能降低,氯霉素可致肝硬化甚至严重/良反应。除此之外, 氯霉索还可引起变态反应、消化道症状等。 .对裔禽的危害:氯霉素是一种谱抗生素,月一且生产价格相对便宜。作为肠道消炎约被大量 的运用。在治疗人肠杆菌病方面有较好的疗效,但是氯霉素毒性较大,存齑禽体内蓄积会严重损 害其生殖系统。对蛋鸡可引起蛋鸡的产蛋事下降,对母畜影响表现为生育力降低、胎儿发育不良、 氯霉素全抗原合成的研究及间接 检测方法的建立 胎儿死亡率增加、产仔数减少、流产、早产等,严重威胁养殖业的生产。 耐我国卢誉的损害:近年来,我田囚食用含有“氯霉素”动物性食品中毒甚争北‘的事件时百 发生。这些不良现象:仅损害了我国的国际形象,而且直接影响我国的对外贸易。 .药物小分子制备人抗原的研究方法 农药、兽药等小分子化合物制备人一抗原方法的建立,包括目标化合物的选择、半抗原的分 子设计和台成、人.抗原的合成等步骤。 】半抗原 .. 半抗原是指与目标分析物结构相阃或类似、并具有反应活性基豳如.、一、一和 .等的小分子化台物。其设计与合成的研究是小分药物免疫分析技术的关键所在。通常弱物 分子本身具有括性基团,需要通过反应引入活性基团猷便与载体蛋自质上游离的援摹、氮基等 以共价键相偶联。也有有些药物分子具有滔,基目,但卸位丁分予的特异性部位上,就需要选择 其他非特异部分进行改造,从而突出特异性部化。 ..人工抗原 小分半抗原只有偶联剑载体赁自上,才能诱导机体产乍免疫应符反应。冈此,在制蔷抗体 前首先要合成抗原一裁体蛋偶联物,即人.抗原。在偶联物中载体蛋白不仪仪是增加、抗原的 相对分『质量,也不是单纯的起运载作用,而是依靠本身的结构特异性和免疫原性,诱导体液抗 体的产生以及继而诱导对、抗坎农药分子的只删,这种现象称为载体效应州 艉”。常用 的裁体蛋有乍血消蛋、人血清蛋【;、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白等。 对于同一种目标化合物,包被原和免瘦原通常不用同一种夤 偶联,目的是减少抗体埘包被 原的非特异性结合,提高分析的特异性和灵敏度”?。陈继明等认为免疫原年?包被原所?载体生白 的结构和分子革差异越大,非特异性结合反应越弱,分丰』灵敏度越高。 偶联方式的选择 一般可根据半抗原所禽活性基凼的小同,选择不同的方式与蛋白质进行偶联。如半抗原含羧 基?。”,则可通过碳化二、胺法,混合酸酐法 ,,羟基琥珀酰哑 胺活性酯法、”试剂法与载体蛋白进行偶肤:如半抗原含氰基”?,则可通过戊二 醛法、二异氰酸酯法、卤代硝基术法、亚胺酸酯法、碳酰氯法光气法、重氮化法等与载体蛋白 进行偶联;如、,抗胤含羟基,则可通过琥珀酸酊法、偶氦苯掣酸法、~氯醋酸钠法等与载体蛋白 进行偶联,若半抗原含巯基,呵通过一乙酸基巯基琥珀酸酐反应与载体蛋白质通过‘ 个二硫键交联;若卜抗原含醛基或酮基,通过。一羧甲基羟胺法,将半抗原的醛基或酮基与 。一黢基羟胺反应得到一个一羧甲肟衍牛物,这个中间体的羧基再与货白质 的氧基结合。河北农业大学硕学位毕业论文半抗原与蛋白质偶联条件的选择 半抗麒分子中何隈的反应基团或引入某些摹团和蛋白质分子中一】丁用于偶联的基团确定后, 可选择适宜的偶联』在一定的偶联条件下进偶联。偶联条件土爱包括以下几方面: 】.半抗原、蛋白质和偶联剂在偶联反应中的相对浓度及其比例麻适合: ‘溶解半抗原、蛋白质和偶联削的缓冲液成分、及其离子强度要台适: .偶联反应的温度和时问戍当适度控带?; 【某些特殊偶联反应中对牛抗原或蛋白质采取的特殊保护等; 此外,在选择偶联条件时还应考虑半抗原的溶性,冈为偶联反应般住特续搅拌的蛋向质、 半抗原霹偶联剂的混合液中进行。如果三者的溶解度不一致,虑选择合适的溶刺,使它们都能 溶解。通常,蛋白质和大部分偶联刺部能在水中溶解,一部分半抗原如肽类在水中的溶解艘 很赢。对这类、抗原进行偶联时?存水相中进行。如果半抗原住水叶溶解度不人或者不能溶解如 类洲醇激素圾其他脂溶性物质则应考虑采用既使半抗原溶解又保持蛋白质呈叫溶状态、并对生物 活性没有影响的有机溶剂。这类有机溶剂如毗啶、二氧六环、丙酮一.甲摹甲酸胺并通常既能与 水混合己,溶解脂溶性物质,从而将半抗原、偶联剂和蛋白质完伞溶解住水.有机溶剂反应体系内。 青则,偶联反应过程中会出现沉淀,这些沉淀,能由蛋白质变悱或者半抗原朱允分溶解所引起。 。氯霉素的残留检测 .,残留检测的必要性和限量标准 自问世以来,在防病、治病维护人体及动物的生命健康方面发挥,极大的作用。但是, 随着临床应用范罔的扩大和用药时间的延,可能会出现一些毒剐反应。因此类药物的残 留日题引起,国际上的“泛芙注。各固兽药箭理部门、食。吊卫生检疫部门、进口贸易口岸都将 该药作为呕点监控对象。我国己经加入,国际问的往来贸易口盏增多,动物性食品的 盲接受剑兽弱残留的影响可能会造成巨人的经济损失。话此建直控制粪药物谩留的往就 显得十分必要,这既是国际之间贸易往来的需要,更重要的是保正人类生存质量的需要【“。 美国仅允许氯霉素用于菲食用动物,规定在动物性食品中不得检出氯霉素。欧盟不允许氯霉 素用于产奶母牛和产蚩鸡,在其它动物的使用上也有限制,并严格规定肉中的氯霉素残留量不得 检。我国农业部也已将其列为禁用药物。然而山丁:其抑菌谱广,效果好以及相对廉价,人们违 规使用氯霉索治疗家畜、禽类疾病却比较普遍。为了保障人民身奉健康及扩大动物性食品?的贸易 ,建立灵敏度高,特异性强,简使易的氯霉索残馁检验方法是非常必要往来 的。 近年来,幽内外食品分析:作者部十分关沣氯霉素残留检测技术的研究,开发 和应用了许多 氯霉素残留分析方法.如常用的微生物学方法‘“,放射免疫法”圳,色谱法。平酶免疫分析法 ”?“等。甘前广泛使用的方法是高效液相色普法,该法虽然也能磷较高精度解决部分实际问题, 但操做复杂,检测周期乏,对出现的残留问题不能迅速做出反应,而柃测法正好可以弥补 这个缺憾。』法检测食品中氯霉素残留是一个成功的范例。 氯霉素是半抗味,它不能刺激机体产生抗体,因而要使半抗原性物质具有免疫原性就需与大 分子载体物质相结台制各人工抗原,而后将其作为抗原进行免疫,在动物体内即可产生特异性抗 氯霉素全抗原合成的研究及间接榆跚法的建立 体,然后建立相应的方法。等”心竞争酶联免瘦吸附法测定牛肌肉组织中氯 毒索残留,最低榆出限量可达,【.特异性也很好。&‘圳报道了~种经改进的测 定猪肌肉组织中残留的方法,其检测限达班或更高,较?创 、州勺灵敏了几‘倍。 我国农业部 年电觇定禁,相国内水产品?氯霉素残留的检测方法依然沿用年规 定的检测法,检雕为,此灵敏度无法满足国际标准咂?嚣为以下,本为, 而采川浊检测氯霉紊,枪测范司为.~ ,下限可达 ,能满足国际标准。 方法无论残田检测摹础胖沦上还是 『?见,法有其良好的应用前景,研究的 住水产品贸易实践中部有着徽大的现实意义。 ..各种检测方法的分析比较 检测氯霉素的样晶,应该是氯霉素药物残留量大,残留时闻长的组纵器官,刚时样品还应该 具有易于采集、保存、运输和处理,易于提取分析的特点。 据报道川,在人体内以肝和肾中浓度最高,依次为怖、脾、心肌、肠和脑组织。等研究 丁鸡、牛猪肉中氯霉素残留的液相色阱法。等用高效液牛【色潜法分别测定了牛肌肉、‘晤 以及川脏中的氯霉素残留量,研究丧明:氯霉素前一种织中状态都较稳定,而其残留最?低 :肌肉肾脏肝舶。等报道了牛尿,氯露亲残留、方法。汁多学者仪针 剑高为 肌肉纽纵作了相关的残翻报道, 、、对虾肉细织?,氯霉素残留的榆测做 了报道, 对鱼肉中的氯霉素残留徽了帽关的报通,埘报道了气质联用法测定 牛奶一,的氯霉素残留,等报道了采用.和法检测鸡蛋中氯霉素残留。目前, 还没柯发现以鸭细纵作为榆损对象的报道。 .色谱法 色谱法具有灵敏度高、结果可靠等优点,是前际公认的聆旺方法。但是,它存在一些明 显的不足,如:样品前处理过程复杂,同收率低,仪器化程度高且价格昂贵,具有较高素质 ’脱场监控,分析速度慢,小适用丁大量筛 的熟练人员操作,适应在基层推『使用,更不能件 选。 .微乍物法 微乍物法的优点是操作简便、样川量少、预处理简单,在基层夫规模筛选中 有一定的应片 价值。徊缺点是微生物法易受绢织中其他抗菌素影响.特异性低、灵敏度也不高,有报道认为该 力法币能榆出牛肌肉纲织中吕/以下氯霉素的残留“。 .放射免疫法 放射免疫法的榆测灵敏度较高,检测限为 ,,世足放刺免疫法具有『刊位索半衰期短、 存在放射性污染及需要复杂的仪器设备等缺点,不适宜于基层使川,适用范围受?限制。 .酶联免疫测定法 酶联免疫测定法的炙敏度高、特异性强、样品预处坪简单、使用方便。当然,酶联免疫测定 法也不是十全十天,也存在?些缺点,如它的特异性很强,不能进行多残留检测,试剂也比较昂 贵。另外,由丁抗体的批次不同,测定结果电可能出现微小芹异等。 河北农业大学硕上学仲毕、沦文 酶联免疫测定法适丁基层大舰模的筛选和现场舱控,它能在短短的几小时枪测儿卜到儿 卣个样品,也不需噩复杂的仪器,检测灵敏度高、特异性强。目前,内很多实验室也正在研究 氯霉素酶联免疫测定的试制盒产品,若研制生产出自己的试剂盒产讯,既价格便宜又方便实用, 定会为。产卜应川提供械人的力便。因此,酶联免疫测定法在现场监控和摹层检测推广应用中 有着广阔的麻川前景。 综所述,氯霉襄贱即检测方法有很多,色谱法中液相色谱法紫外检测器使川的比较 普遍,但它在纳充级别缺乏敏感性。气相包潜法中电子捕获检测器是灵敏度最高,检 测限最低的方法,但它年?液相色谱法样只能定量,无法满足实际乍产的需要。液质联用, 法和气质肤川,法司蚓时定量和定性,灵敏度高、检洲限低,足今后氯霉素残留榆测中最 且前处理过程郴很繁琐、耗时较上耍的方法。伸此力法对仪器的要求较高, 多,不适寅夫规模推 广。免疫法中酶标免疫法操作简单、快速、不需复杂设备,对环境无污染,作为筛选方法适 合丁人规模打.』“使。足免疫学办法容易出现假阳性取不易定量等小足之处,通常需要色谱学 方法进一步定蛙和确计。 .实验的日的与意义 】年,瞎茸次制备了抗抗体。的:氯酰胺醇和硝基笨结构部可作为抗 原决定箴。。前, 般采琥珀酰氯霉素作为免疫半抗原,也可通过硝基弓载体蛋白联结,先将 硝基苯还髓 成苯胺,雨重氮化法‘,簧『【质联结。酶联免疫测定的灵敏发。岛,足残留筛选的 ”。”。 重要力法。通常检测极限‘般在~/ 本论文的主要目的是通过较为系统地研究优化全抗原的合成及鉴定方法,制备出氯霉 素的高质量的、特异性好的多克隆抗体并建立氯霉素的酶联免疫检测力法以及相应的样品提取 方法。初步建市,检测方法,快速检测动物源食品巾残留。 本项谍题的研究成果,将有助于实现残留的快述筛选和见场检测,从而实时监控该类 药残在环境以及生物链中的传递卡代、射过年呈,为养殖业和食晶加业生产无公害绿色食口提供 新的、有效的分析手段,保证其食用安全性以及出贸易的顺利进行,并为食品巾农、兽药残 留以及其他危害【州子的快速枪测提供技术参考,促进相关产业的健康发展。 氯霉素全抗脒合成的研究及问接鼢检测方法的建立 .材料方法 ,材料及溶液配制 实验动物 河北省清苑县种兔场提供的.~.键康雌性球兔。 ..氯霉素全抗原合成及鉴定所需试剂 氯霉豢 进口分装: 牛血清白蛋自 舯避口分装 卵清白蛋白 进口分装 弗氏佐剂 公司 琥珀酸日 天津市’东试剂厂 丙酮分析纯 石家序市育机化上』 毗啶 北京化厂 三止胺化学纯 北京化学试剂公司; 氯甲酸乙略分析纯 天津市华、试剂厂 天廿市鼎盛化工材料厂 一一甲璧甲酰胺分析纯 进口分装; 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 舯进口分装; 进分装。 目进口分装 过硫酸铵 氨酸 卸】进口分装 蔬基乙醇 进口分装 溴酚置分析纯 北京化工 分析纯,北京化』‘ 苦斯亮硫琼日糖 ..抗体和免疫球蛋白制备所需主要试剂 吐温一、一 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐刹 乙二胺冈乙酸二钠 辛酸 北京金龙化学试剂有限公司 硫酸铵 北京化学试剂厂河北农业人学硕上学位毕、论文 日本进【国内分装 一 日本进口国内分装 ..酶标抗体制备及间接所需主要试剂 ? 辣根过氧化物酶, 天津市福晨化学试剂厂 岛碘酸钠 北京化学试剂公司 邻苯二胺 乙二:醇 天津市化学试剂一厂 天津市福晨化学试剂厂 硼氧化钠 天津市化一试剂公司 过氧化氢 犊牛清 杭州网季青 ..所需主要仪器 光学显微镜 。. 普通低速离心丰 上海安亭仪器设备厂 高速玲冻离心机 上海安亭仪器设备, 美圜.公司 超声波粉碎仪. 单条可拆酶标板 囤产 . 型酶标仪 .生化培养箱 上海福玛实验设备有限公司 超净下作台 哈东联 稳压稳流电泳仪 京六一仪器厂 北京六一仪器厂 电泳槽 凝胶成像系统 一 电热恒温水浴箱 北京市医疗设备总 型磁力搅拌器 上海南汇电讯器材厂 新纪紫外可见分光光度计 北京谱系通用仪器有限责任公司 电热鼓风干燥箱 北京光明医疗仪器厂 真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂 ? 墅趣程毛溢冰籀 本二洋公两 主要溶液的配制 .. .伞抗原制各所用溶液的配制 ./,溶液:称取.,溶丁蒸馏水中,?保存备用。 ./ .磷酸盐缓冲液 液.,。:. .,加双蒸水至; 液./: ,,加双蒸水至;氯霸索全抗原合成的研究及州接榆测力法的建立 ./磷酸盐缓冲液:液,液混匀后,?保存。 啪.’几溶液:称取 ,溶于蒸馏水中,常温保存。 %溶液:称般晚,溶于蒸馏水中,常温保存。 . 几 ?缓冲液:取“ 。然后 ,加蕉馏水,盐酸调制 加蒸馏水补足体积拿。 .酸一硫酸铵盐析法提纯用溶液的配制 /磷酸盐缓冲液 液.几:比? ,加双蒸水至: 液.几: .,加双蒸水争; 几磷酸盐缓冲液:液,液匀后,?保存。 .、. / 、.%溶液:., .,加双蒸水至。 . ,, 几.:.仃 .,加硬蒸水至。 / 含/、.‘’/、 . ’ .,叭,. .’定容至,,混匀厉, , ., /?保存。使肖时川 做倍稀释。 . / 的乙酸缓冲液 疵 】酣孵钠溶液:醋酸钠】.譬,加坝蒸水定容至,; 液 几乙峻溶液:乙酸 .,加叔蒸水定容至.: ,‘/ .的/酸缓冲液:液, 液,加双蒸水定容至..程 匀,?保存。 .. 乜泳所用符液 %分离胶贮液:称取 和.,溶币楚水中,最后定容至,过滤后置 棕色试剂瓶中,?保存。 %浓缩胶贮液:称啾 私 .,溶丁币蒸/中,蛙后定容至,过滤后置 棕笆试剂瓶中,保。 分离胶缓冲液.】/ 缓冲液:称取啦,加少午重蒸水使其溶解, .? 再加入 ’/约 调至.,最后加重蒸水定容至,,?保存。 , 浓缩胶缓冲液 几..缓冲液:称取 ,堋少许重蒸水使其溶解,再 加入/】约.,凋至.,最后加重蒸水定容至,?保仃。 极缓冲液:称取蛹.,甘氩酸.,加入 ,加蒸馏水使其溶解后定窬至。 信样讯缓冲液: ,巯旗乙醇, 油,溴酚,, .?’ 川蒸馏水溶解定窬趸。 川定液:取%甲醇.,冰醋酸混匀。 染色液:取考马斯亮监.,加固定液 ,过滤后府用。 脱色液:冰醋酸,甲醇。,加蒸馏水定容垒。 .过碘酸钠法标记抗体所用主耍溶液 ”./过碘酸钠溶液:过碘酸钠.蒸馏水至。 . /聚乙醇溶液:聚乙二醇.蒸馏水至.。 河北农业人学硕.学何。业论文 ./ 碳酸盐缓冲液:二.,,.魄,蒸馏水至,调值 至,加水至。 ‖。硼氧化钠溶液:.醐氢化钠,蒸馏水至。 饱和硫酸胺】.溶液:称取化学纯固体,蒸馏水至。 .间接竞争所【一要溶液 包被液:.的.碳酸盐缓冲液:,、%,.,无离子水加至, .两周内使?。, ?保存 溶液:./ ,.几溶液 溶液 ,?离子水加至.,?保存。 ./ 王溶液:? .,无离子水加至。 .溶液:?? .,无离子水加垒。 .%溶液:’?一 .。,加军。 封闭液:%犊牛血清,川进干了配制。 底物缓冲液的删制:配制.的柠檬酸溶液】,置 ?冰箱保存备用。另舸制】 的溶液,常温保存。临用前,取. .的柠檬酸溶液,..的 溶液,再加冷双蒸水。现配现用的原因在:柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液稳 定,容 %双 易形成沉淀。然后称取 溶丁刚制的磷酸钠一柠檬酸底物缓冲液中,蜘 氧水,避光放置。底物液是临川前再己制。 终液:,,浓硫酸.,无离子水加至。 .方法 ..氯霉素免疫抗原的合成 .重氯化法”州合成免疫抗原. 还原:取 ,将其溶于无水乙醇中,加入 /盐酸中,再加入钎粉, 于?水浴中加热。 重氯化:将冷却后,庄?卜条件下逐滴加入. 几. 避光搅拌,至淀 粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色。 偶联:称取 .厂巾,将其冷却。将边搅拌边慢慢 ,溶于 同时加入,/,?搅拌,反应物对灭菌 加入。为保持加入过程巾的稳定, 生理盐水在?透析一天,得.复合物,真空冷冻干燥后,陈十保存。 .改良混合酸酐法?合成免疫抗原?? 氯霉素半琥珀酯。的制备 将廿、琥珀酸自 鼬丙酮、毗啶’混合在一起,搅拌溶解,然后于? 回流,蒸去丙酮,回流完后的混合液巾含有目的产物氯霉素半琥珀酸酯。将混合液移出,再 加入乙酰厶酯、稀盐酸 ,充分振荡后除去酸层,用蒸馏水反复洗两次,每次加蒸馏水 。向洗后的乙酰已酯屡中 %约,转溶,再加讯盐酸,调至,析出红 色糖浆状物。分出酸层,蒸馏水沈,再加入、饱和溶液至其伞溶,然后加入醋酸钡, 氯霉素令抗原合成的研究及问接检测方法的建直 ?水溺反应,冷却得钡盐粗品,,加热蒸馏水溶解热过滤,得滤液,再用盐酸调至, 有红色料稠油脂状物生成。将其冷豫干燥得单酯。 ??复合物的合成 上汉?溶于,弭加入? 正‘胺和?氯甲酸乙酯,?磁力 搅拌】,此为甲液。称取 .溶于 %中,在?冰箱中溶解预冷.置冰浴 上边搅拌边用/调至.,此为乙液。随后将乙液倒入液中,在?下搅拌, 用灭菌的生邢盐水在?下透析一天,兵问应多次换液,真空冷冻干燥后,冻保存。 .碳化一诬胺法””台成免疫抗原 ?.的浮液中; / 将溶 /.的溶液中; 将碳化二旺胺溶于 将五、琥珀酸酐、丙酮、吡啶.混台在一起,搅拌溶解,然后于? 川流,蒸上丙酮,回流完毕后的混合液中含有的产物氯霉素、琥珀酸酯。将混合液移山,再 加入乙酰乙酯、稀盐酸,充分振荡后出去酸层,州蒸馏水反复洗啊次,每次加蒸馏水 。向洗的乙酰乙嗨层中加%,约.,转溶,再加浓盐酸,调至,折出红 /? 色糖浆状物.得到氯霉索琥珀酸钠盐,将其冷冻燥,称双溶丁. ’『勺溶液中 将鹰女,方勺】、舾液滩介庄‘起,墩雕好的液】,缓慢加湿台浈中,避光搅拌,然 后缓慢加入剩的液。?搅拌过夜,』静置小时。鼬后用?. ,?连 续透析』人,删问多次换液.真空冷冻爆后,一?保存。 ..氯霉素包被抗原合成 【卵清白货自作为戡体蛋白,按照 .中重氮化法、混合酸酐法和碳化二亚胺法 种万法分别合成氯霉素包被抗原,真空冷冻下爆后.一?保存。 . 氯霉素免疫抗原和包被抗原的鉴定 .紫外吸收光谱法鉴定氯霉素人工抗原”” 小分子物质与载体蛋白倘联前何各不嘲的吸收峰,偶联亓吸收峰发生改变‘“。根据所得结果 抗原进行汁算和鉴定。用生婵盐水稀释氯霉索纯品、、,配成浓对氯霉素人. 度各自为 、和?的溶液;用紫外分光光度计扫描一种物质的最大吸收峰波长。 然后将川不刚方法合成的免疫抗原,包破抗原分别稀释成蛋白,后,做同范围波 长的扫描。绘制紫外扫描图谱并记录各物质吸收峰波长处的吸光度。 人抗原的摩尔吸光系数的计算 根据公式?为吸光度为浓度,,为光拧分别求出三种物质在三个吸收峰的摩尔 吸光系数。 人工抗原中找体蛋与偶联比干?浓度测定的计算 测定人:抗原偶联物在丰应载体蛋白和免疫抗、包被抗坂吸收峰处的吸光度,由公 』?:河匕农业大学硕学位忱论文 。/。。。一。帅/钔?。。。 即可求出两物质摩尔比值其中。。与。表示物质在物质的最大吸收峰波长处摩 尔吸光系数,物质在物质的最大吸收峰波长处摩尔吸光系数,。、。为吸光值或光密 度值,即值为浓度,为光程,脚标。表示物质。和物质。脚标。表示最大吸收波长。 将偶联物适当稀释后,测和的吸光度,按公式汁算蛋自质浓度: ? 蛋白质浓度‖、蚰. .聚丙烯酰胺凝胶电泳法 鉴定氯毒豢人.抗原的合成。聚丙烯酰胺凝胶电泳法参照参考文献‘”的力法, 聚阳烯酰胺凝 胶电泳法操作如下: 封闭电泳扳:按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃扳夹子灾好,玻璃板的两侧及底部』 %的琼脂封边,防封闭不严而使凝胶液漏? 制胶:按表配制所需浓度的分离胶和浓缩胶: 表梨丙烯嘲版村腔咆泳用分离胶耳?浓缩胶 】曲 印灌胶:将装好的玻璃哇土泳扳倾斜成度角;按要求灌入分离胶和浓缩胶,插入“梳子”, 摩温放于口光灯 进行光化反应,浓缩胶即可凝聚。凝聚后,慢慢取出“梳子”,防止把胶 孔弄破。在形成的胶孔中加入缓冲液,冲洗未凝聚的聚丙烯酰胺,倒出孔中的水,整理加样孔。 制样和加样:将待检样品各取,加入等体积上样液样液配置:%蔗糖溶液 与.%溴酚蓝混合,?保存混匀,用微量进样器毗取已处理好的样品轻轻加到 加 样孔中。 电泳:电流为,进行电泳,至样晶全部进入分离胶后,调节电流为,样品中 的染料迁移至离端时停止电泳,小心取下分离胶。 染色和脱色:将分离胶在染色液中浸泡,用蒸馏水漂洗一次,加入脱色液后更换 一次脱色液。直至各蛋白质条带清晰为【:,然后将胶板浸入保存液中~。凝胶成像系统下观 察分析。 动物免疫实验 分别用重氮化法、混合酸酐法和碳化二?胺法一种方法制备好的氯霉素免疫抗原免疫实验动 氯霉豢伞抗曩弁成的研究股川接检测方法的建立 物。实验动物为三只体重.~.的雌性成年健康的新兰大白兔。另外,用生理盐水免疫三 新西兰大白兔.馓阴性蚶照。免疫百观察周。 犄冷冻十燥好的免疫抗原刚生理盐水稀释成/的浓度.加等量弗氏完全佐剂制成油包 水的乳化剂.于家兔的肯爿皮内多点注月进行苒免;岗后,取同样鼍抗原加弗氏不完全佐制乳 化后进行背部皮多点注目,为加强免疫:重复免疫三次,每次隔周,操作同上,最』舌一次免 疫,为耳静脉直接:射免疫抗进强化免搜。 表瓤两兰人亡』兔免疫程序 ? ‘】 ”” 免壤音位 接种量/只 时间 抗原类型 汀免 弗氏完全住刑抗胀 部应山多点汴射 ‖ 弗氏水完全佐刺抗味 足掌,部皮多点注射 ‖山. 一免 三免 弗氏不完全佐荆抗隐 府部脚肉两点、肯部应卜多点注射 ‖ 四免 弗氏小完拿住州抗蟓 肘部叭内两、都皮影点注野寸 ‖ 弗氏不完全佐刑抗燎 耵部肌内两点、部应多点注身寸 五免 ‖昌 . 未免 耳缘静脉汴乌于 ‖ ,检测抗『【消,分别二种合成的免疫 用双向琼胎扩敞试验坚 抗原卞抗原对照,捡.刍特异性抗血清是否产生。确定抗血清产生后,再用测 定抗 清效价。 .兔抗氯霉素全抗原抗血清制备及效价测定 .按照..冲免疫程序制备免抗血清。术次免瘦肝,分删从每只家兔的耳缘静脉 采血, ?温浴,?冰箱~,‖离心 分离清。珥】问援非竞争方法四测定 曲清教价。 确定效价较高的仝抗原合成方法.末免周后心脏采血,按照中方法制备抗血 清。 .羊抗兔抗体血清制备 采取健康兔血清,辛酸.硫酸铰法提取血清,免疫健康雄性绵 只,具体操作 如: 首免:采用加入等量弗氏完全“涮,澎匀,爿对接滓射器反复抽吸,直至溶液成 粘 稠的油状,于山羊两后腿内侧皮内、皮分点汴射。 二免:周后, 兔血清与等量弗氏不完全佐剂混匀,按首免,法混匀,皮内、皮 下分点注射: 三免:闸隔周,用加入福氏不完全作刺中,混匀皮内、皮分点注射; :间隔 ?,以蛋白于?一颈静脉免疫一次,皮内、皮下分点注射; 四免 末次免疫灭后采血,免疫扩散试验检测其血清效价,枪验合格币颈动脉采血。 河北农、大学硕学位毕业论文 ..抗体血清的纯化 .辛酸.硫酸铵法”“纯化血清 将..和. 种制备好的兔抗抗血清和羊抗兔血清经辛酸.硫酸铵法提纯。 向份预处理过的血清中加入份./, ,的醋酸缓冲液,用,洲调 至,; 在室温边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸,按每毫』稀秆前的血清加入辛酸兔血清 加入,羊 血清加入此,鸡血清加入“,,?静苴,然后离心,弃沉淀: ,. , 上清液过滤,加入/体积 ,.%,用/的调至 ,;按每毫升魁台液中加入.硫酸铵,在?冰浴下丁内加完,静置以上。 ?唧 离心,弃去上清; 沉淀溶于适量/,.,,. 的 中,对~ 倍的上述于?透析过夜。?离心,以除去不溶性沉清; 用分光光度计测血清的含革,公式如下: 含量一.砷×卡羊品稀释倍数 .凝胶过滤法除去硫酸饺 取.×层析梓垂直丁闰定架上,夹住流出。加少量.,.然后将 浸泡的“一.沿管壁边搅拌边加入柱中,松开流出几。继续加“.,使其自然 沉降;并以柞床/体积的平衡柱,使流出的液体的值与的一致,放出液面多余的 夹住出口,按拄床的/加入耜提的】,盎黑色比色磁盘上加入%的磺酰水杨酸,, 滴 一滴收集液,出现白色絮状沉淀即为.球蛋白,并开始收集,收集】滴为一符,然后在白色比 色磁盘上滴加奈氏试剂,出现黄色沉淀时停止收集。如小;现棕黄色叮宁其本身颜色即无氨离子, 合并无氨离蛋白管,浓缩后置冰箱待进‘步纯化。 ..离子交换纤维素法纯化 .纤维索的活化处理:称取适量的.,朋去离水浸泡过夜,次日倒去水,加 ./ ,静置,用布氏漏斗真空抽滤洗涤至..例出上清夜:加入.几 的溶液,静置,方法同上用去离子水洗至.为【:,待川;装托、平衡均与 一的相同;加样与洗脱:按柱床的/加入除盐的,在黑色比色磁盘上加入%的磺酰 水杨酸一滴,再滴一滴收集液,出现白色絮状沉淀时开始收集,并收集滴为一管,直至白色 絮状沉淀物不出现为止:合并众管,垒紫外分光光度计上测值,算其蛋白含 量。小量分装后, ?保存备用。 ..免疫球蛋白的纯度鉴定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,按照..种方法配制各种溶液,浓缩胶浓度为.%,分离 胶浓度为.%,分离胶电泳电乐为,考马斯亮蓝染色,鉴定纯化的纯度。 氯露素伞抗豫合成的研究及间接榆测方法的建立 ..辣根过氧化物酶标记抗体的制备 本试验采用郭春祥””’所描述的过碘睃钠改良法制各辣根过氧化物酶标记的抗兔抗 称取 体。具体标记程序如: 硝溶 .三蒸水中,加入新配制的. 水溶 液.,混匀,置冰箱;取出后滴加.乙醇水溶液.,室温放置;加入含 .的液透析 纯化羊抗兔二述刹备的抗体的水溶液混匀并装透析带,以 过夜期间换~次液;将抗体从透析带吸?后肋硼氧化钠溶液加.置冰箱 ;加入等体积的饱和硫酸铵.冰箱放置后“离心玎,将所沉淀溶于 的. ,.巾透析过夜,次再离心除去:锌物,这样即得酶轫。一羊抗免抗体结台物,用 . . 自至采】紫外分光光度计分别测定其拳 光密搜,然历 按照文献‘”’的方法讣算结合物中丰?的浓度,聚丙烯酞胺凝胶电泳检测其标记结 果.?泳方法同..。并进行纯度签定。 ..辣根过氧化物酶标记抗体效价测定 利用刚日抗原一酶杯抗体商接竞争法‘“直接测定辣根过氧化物酶标记抗体 的效 价,步骤如下: .包被:月包破液将包被抗原稀释犟”酌,”‖孔加到酶标板上,?湍浴: .封闭:梧包被好的酶午,、饭取出,待其恢复空温后,掰.%的 .的,洗液洗 涤次,每次力?完洗涤液.静置,洗涤后咀,经吸水纸:拍,每孔加山封闭液, ?封闭】: 功口酶标抗体:将封闭好的酶标板取出,待其恢复窄温后,甩去封闭液,肺洗 液洗涤次, 加完洗涤液后,每次静置,甩干,拍干,依次加入用 ,.的稀释的酶标 ,对倍稀释?‖孔,每个浓度重复两个孔,以为卒向对照.?温浴 抗体从倍起 : .加底物液:用洗涤液洗涤次,』完洗涤液历,每次静置,甩干,拍,加入新配制 的 .底物显色液,每孔; .终止反应:每孔加入 吼,?反戍】儿; 坝定:反应完后,置于酶联免瘦检测仪上. 读取各孔的伉.以依据值接近 .时的酶标抗体稀释扁的浓度为其效价。 ..间接竞争的主要操作程序 基本程序参照川的方法旧,步骤如: .包被:以 定浓度的包被原复合物.包被 孔酶标板,每孔汕?包被 ,包被液为.碳酸盐缓冲溶液: .洗涤:用 %、的.的洗液洗涤次 每次加完洗涤液后,静置,洗 涤后甩干,在吸水纸上拍干; 封闭:缚孔加山封闭液,?封 ;河北农人学硕士学位毕业论文 .洗涤:用洗液洗涤次,加完洗涤液后,每次静置,甩干,拍千: .加样:加入系列稀释的标准品”/孑或“/孑,雨加入适当稀释的抗体?/孑 或?/ : 孔,?孵育 .洗涤:用沈液洗涤次,加完洗涤液后,每次静置,丁,拍千; 加酶标抗体:每孔加山新鲜配制的稀释度为:的羊抗兔。辣恨过氧化物酶标 . 记物,?孵育: 洗涤:川洗涤次,加完洗涤液后,每次静置,甩下,拍: . .显色反应:加入新配制的.底物屁色液,每孔?; 终止显色反应:每孔加入 ,?反戍; ?.溃取值:反应完后,置于酶联免疫检测仪上,下读取各孔的值; .计算抗血清的效价:依据值,以阴性样品的吸收值之均值加上其曲倍或三倍 所得数 值作为判断标准,凡值大于这个标准值的芦断为阳性。 ..间接竞争条件的优化 .抗血清工作浓度和包被原理想包被浓度的确定 系列浓度的包被抗原的配制 、.、 、 取合成的包被抗原冻干粉,川.碳酸盐包被缓冲液倍比稀释配成. .、 、、,的包被抗原液,置?保存.一周内使。 系列稀释的抗由清的配制”” 将所获抗血清用作:、:、:、:、:、:?、:系列稀释, 置?保存,一周内使用。 配制上作稀释度的羊抗兔. 的结果作适、’稀释,一?存备用,可时间 川 将酶标羊抗兔按照. 放置。 参照文献,采用方阵滴定法”,选择值在.左,的包被原浓度帮『抗体稀释度分 别作 为理想的工作浓度。 .抗原最仕包被时间和温度的选择 ,?,?, ? 以包被原最佳工作浓度包被,分别按?过夜、?, 以最佳抗血清稀释度进行。测定,根据其值选择最佳包被时间。 航原抗体最佳竞争反应时问年温度的选择 其他条件不变,选择?和?这两个温度,分别在,,,的时 间进行竞争反应,测其。。值选择晟佳的反应时问和温度。 湿色时间和温度的选择 按照已经建立的最佳反应条件,分别在?显色、、,室温显色、 、,终后计算抑制:簪选择最佳显色时问和温度。 氯霉素全抗原合成的研究及问接儿捡洲,法的建立 ..抗体特异性试验 航体特辟性试验 分别用、、.包被酶联反应板,抗体系列稀释后?间接竞争性 方法测定值。判定纠果与 .同。 .抗体交义反应性试验 抗体的特异性也,以』目交义乏府率米表示.即抑制抗体‘包陂抗原结台达%时,标准品的 分子数和抑制类似物的分子数之比。采』州接竞争 厅法删抗体与生产中常州的及结构. 与硝基呋喃类类似的防病治病的抗生素药物竞争物如氯霉索琥珀酸日、磺胺.甲基峨啶、氯霉素、 思诺沙星、硫酸链霉素、青霉素、氟哌睃诺氟沙晕等化合物的变义反应性。测定中,以系列 稀释的竞争物溶液作为被检抗原,剑何种竞争物的值,眄利川公式求出每种竞争物的交叉 反应率。 ..标准曲线的绘制 将氯霉素原粉置丁恒温箱巾?烘干至恒委,精确称驭原粉,以%乙腈蒸馏水 . 溶液溶解,然后』 .的,或蒸馏水溶液精确定容至,即得/的 储备液。将储备液稀释倍得毋,.的庸刚液。使川应用液配制系列浓度为 、‖、/、‖、/、乙.‖、‖的标准溶 液。 间接竞争法检测系列稀释的一定浓度的标准溶液,建立标准曲线,具体方法如 ,.., 。整个过程中,都以前述步骤. .所得到的最佳包被原包被浓度和包被 时间,抗血清工作浓度及抗原抗体最佳反应温度和时问为条件,进行间接竞争测定,制备 标准曲线。标准曲线中,以各浓度包括/的值转换成甩。值抑制率的倒数作为 纵 世标,无即浓度为时抑制时的。值,再相应淋皮的抑制时的值为, 以相对应的【作为横坐标。因为结合;举倡。债。。【 】成线性同归关系,从而可以计算 叫归曲线的方程和相关系数。 ..方法精确度的确定 以孔问变异系数及板问变异系数表示该方浼的精确度。 ..添加回收率的测定 收率测定试验是证明检测方法可靠性的有力证据。鸡肉添加羊?提取方法均采其常规残留 分别选择个添加水平,另设一个窄自样本,每个水平重复次测定。测定方法, 样本的前处理 /. 方法如: 采用间接竞争方法测残留的样&制备,取鸡肉,加 磷酸缓冲液,超声波提取,室温静置,取.清液.沉淀再用超声波重复提取两次, 次提取液合并.置?冰箱中备川。然进行间接竞争测定?值。据.的方法 计算抑制率,代入标准回州方程,计算的含量。斤根据以公式计算添加叫收率。 添加同收率%实测值一添加值×?% 河北农业大学硕士学位毕业论文 .结果 .氯霉素免疫抗原和包被抗原的鉴定 ..紫外吸收光谱法鉴定氯霉素人工抗原 因透析时朋生理盐水作为透析液,所以紫外分光光度计检测时也必须用生理 盐水作空白对 照,并用生理盐水适当稀释样品。、在紫外阮能产生明显吸收光谱。把合成的氯霉素免 疫抗原溶液、溶液、载体蛋白溶液分别在?波长下进行紫外分光光度计扫描, 结果如图。由图可见三种方法台成的八免疫抗原与、的最大吸收波长都在 左右,但..的紫外吸收曲线与和的紫外吸收曲线明显不同,通过数据对比 可定性证明重氮化法、混合酸酐法和碳化二亚胺法三种方法偶联成功。 圈 免疫抗原紫外扫描图谱 捌啪; 订 ,、在紫外区能产生明显吸收光谱。把合成的氯霉素包被抗原溶液、溶 同样 液、载体蛋白溶液分别在波长下进行紫外分光光度计扫描,结果如图。由图 可见三种方法合成的免疫抗原与的最大吸收波长都在呻左右,但.. 的紫外吸收曲线与和的紫外吸收曲线明显不同,通过数据对比可定性证明熏氮化法、 混合酸酐法和碳化二亚胺法三种方法合成包被抗原偶联成功。氯霉素全抗原合成的研究及间接,鼬检测力‘法的建立 蹦、色被抗原紫外描图蓉 【 曲伽玎..人工抗原中载体蛋白与摩尔吸光系数、偶联比和浓度测定的计算 川紫外分光光度仪可测?人:抗原祁载体赁、定点吸光艘,恨据.”公』?玎计 算出人上抗原中载体蚩白‘ 摩尔吸光系粒、偶联比和浓度。所测结果如表: 是 免疫抗绦紫外分光光度汁删定结梁 印盯 根据公,?』得币氮化法、混台酸酐浊及碳化二亚胺法?种疗法台成免疫抗 原偶联比为 ..:、.。 :和..法.:,由此说明三巾方法中河』农业大学硕士、?位毕业论文 混合酸酐法更适合氯霉素免接抗原的合成。 表包植抗原紫外分光光度计测定结果日盯 按照表,计算出合成包被抗原.、?.、一?法 与的摩尔比分别为:、.:、:。说明重氮化法、混合酸酐法及碱化二亚胺法二种方 法台成包被抗原中混合酸酐法较优。 分别测偶联好的免疫抗段和包被抗原在和波处的吸光度,明公式计并后褂 、、?法中载体蛋白浓度分别为.幽、 ? .、.‖。包被抗原.、、,.?、、,??法中载体蛋 白浓度分别为.咖.、/、.咖。 .电泳结果及分析 根据随分子量增加,样晶在. 泳中迁移距离越来越短 。偶联物一队电 泳鉴定如下图所示.第、泳道为,其它泳道为不同时间合成的...第、、 泳道?.条带明显落后于第、泳道条带。图为三种方法合成的包被抗原与载