炎症因子DaintainAIF1对胰腺β细胞功能影响研究

炎症因子DaintainAIF1对胰腺β细胞功能影响研究 炎症因子DaintainAIF1对胰腺β细胞功能影响研究 分类号 学号 D200777332学校代码 10487 密级 博 士 学 位 论 文 炎症因子 Daintain/AIF-1 对 胰腺 β 细 胞 功能 影响 的研究学位申请人 :黄欣媛 学 科 专 业 :生物化学与分子生物学 指 导 教 师 :陈正望 教授 答 辩 日 期 :2011 年 7 月 28 日 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of PhilosophyFunctional Research of Inflammatory CytokineDaintain/AIF-1 on Pancreatic β Cells //.didate : Huang Xinyuan Major : Biochemistry and Molecular Biology Supervisor : Prof. Chen Zhengwang Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China July , 2011 独创性声明 本人声 明所 呈交 的学 位论 文是我 个人 在导 师指 导下进 行的 研究 工作 及取 得的 研 究 成 果。 尽 我所 知 ,除 文 中 已经 标 明引 用 的内 容 外 ,本 论 文不 包 含任 何 其他 个 人 或 集 体已 经 发 或 撰写 过 的 研究 成 果。 对 本文 的 研 究做 出 贡献 的 个人 和 集体 , 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到,本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在_____ 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年月 日 日期: 年月 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要 Daintain (大炎肽) 是 1994 年由 Chen 等从猪的 小肠中分离纯化出的一种 新的 生物活性蛋白,其氨基酸序列与 1995 年由 Utans 等人在大鼠心脏移植排斥反应中 克隆出的巨噬细胞因子 Allograft Inflammatory Factor-1 ( 同种异体移植炎症因子-1, AIF-1 ) 高 度 同 源 ( 90% ) , 两 者 属 不 同 物 种 来 源 的 同 一 蛋 白 质 , 故 并 称为 Daintain/AIF-1 。Daintain/AIF-1 分子量 17kD , 主要由激活的巨噬细胞表达和分泌, 是一种多功能的细胞因子, 广泛参与炎症和免疫相关的多种疾病的发生发展过程, 如血管病变、移植排斥、肿瘤以及自身免疫疾病等。 1 型糖尿病糖尿病Type 1 Diabetes Mellitum,T1DM 是一种 T 淋巴细胞介导的 自身免疫疾病,以胰岛炎引发的胰岛 β 细胞的 选择性破坏为特征。在发病前的胰 岛炎阶段, 活化的巨噬细胞、T 淋巴细胞等大量浸润胰岛, 释放出 炎症介质如 细胞 因子和 NO 等协同作用,引起 β 细胞凋亡、坏 死以及胰岛素分泌异常等 功能 损伤, 进而发展为 T1DM 。目前 T1DM 发病的分子机 理还未完全阐明,但大量研究 表明 炎症和免疫相关的细 胞因子在这一 进程 中 起 着 关 键 作 用 。 我 们 的 前 期 研 究 发 现 Daintain/AIF-1 在正常胰腺组织中不表达, 但 在 T1DM 模型 BB 大鼠侵润胰腺的巨 噬细胞中大量表达, 表明 炎症 因子 Daintain/AIF-1 与 T1DM 的发病机理有关, 但具 体机制仍未明确。 为 了研究 Daintain/AIF-1 在 T1DM 发病中的作用, 本论文主要开 展了以下 工作: 第 一 部 分 : 以 大 鼠 β 细 胞 系 INS-1 为 实 验 模 型 , 在 细 胞 水 平 上 研 究 了 Daintain/AIF-1 对 T1DM 中 β 细胞功能异常的 影响。 在 细胞培养基中添加不同浓度 的 Daintain/AIF-1 刺激后, 检测 INS-1 细胞活力、凋亡、周期、胰岛素分泌和 NO 产量的变化,结果发现: 1. Daintain/AIF-1 对 INS-1 细胞具有毒性作用, 能抑制细胞活力。 2. Daintain/AIF-1 能够诱导 INS-1 细 胞 的 凋 亡 , 特 别 是 早 期 凋 亡 。 提 示 Daintain/AIF-1 可能在凋亡的起始阶段起刺激性作用,最终导致 INS-1 细胞活力的 I华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 降低。 3. Daintain/AIF-1 不影响 INS-1 细胞的基础胰 岛素分泌,但是抑制了 20mM 葡 萄糖条件下的葡萄糖刺激的胰岛素分泌 (GSIS ) 水平, 说明 Daintain/AIF-1 损伤了 INS-1 细胞的葡萄糖反应性,这是 Daintain/AIF-1 对 INS-1 细胞毒性作用的另一个 方面。 4. Daintain/AIF-1 显著提升了 INS-1 细胞的 NO 产量,推测 NO 水平的上升可 能和细胞凋亡的增加和 GSIS 的下降有关,可能是 Daintain/AIF-1 诱导的 β 细胞毒 性作用的机制之一。 5. Daintain/AIF-1 影响 INS-1 细胞周期 ,将细胞 阻滞在 G0/G1 期,使得进 入 S 期和 G2/M 期的细胞减少, 以此来抑制细胞增 殖, 且 Daintain/AIF-1 浓度越大, 作 用越明显。 第二部分: 寻找 Daintain/AIF-1 在 胰 腺 中 的 相 互 作 用 蛋 白 , 为 深 入 了解 TM Daintain/AIF-1 对 β 细胞毒性作用机制提供思路 。 采用 Clontech Matchmaker GAL4 TM 酵母双杂交系统 3 来进行人胰腺 Matchmaker cDNA 文库中 Daintain/AIF-1 相互 作用蛋白基因 的筛选,主要结果为: 1. 构建了诱饵质粒 pGBKT7-Daintain/AIF-1, 经检测可以在 AH109 酵母中正 确表达出诱饵融合蛋白 BD-Daintain/AIF-1, 对 酵母细胞无毒性, 且没有自激活性。 2. 扩增了人胰腺 cDNA 文库,转化入 AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1 酵母, 涂布 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板并进行 β- 半乳糖苷酶活性检测,初步筛选出 64 + + + 个 Ade His lacZ 三阳性候选酵母克隆。 3. 进行回转实验和一对一验证实验排除假阳性 ,结果仅获得 1 种文库质粒。 对其 cDNA 插入片段测序 后 Blast 比对并 进行阅读框分析, 发现该片段翻译 时发生 了移码, 仅表达出 一段 32 个氨基酸残基的未 知小肽段, 说明该质粒 是假阳性。 本 次筛选 未获得 阳性结果 ,是 酵母双杂交系统假阳性率非常高这一重大缺 陷 的一次 实例 。 综 上 , 本 研 究 首 次 发 现 Daintain/AIF-1 对 INS-1 细 胞 具 有 毒 性 作 用 , Daintain/AIF-1 可能通过将细胞阻滞在 G0/G1 期来抑制细胞增殖, 以及 上调 NO 产 II华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 量来刺激细胞凋亡和损伤胰岛素分泌。 这说明细胞因子 Daintain/AIF-1 促进 了 β 细 胞的功能异常, 在 T1DM 的起始和发展中起重 要的推动作用。 关键 词:Daintain/AIF-1, 酵母 双杂交,1 型糖 尿病 ,INS-1 细胞, 细胞 毒性 , 胰岛 素分泌III华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Abstract In 1994, a bioactive polypeptide ?―Daintain‖ was isolated and characterized from porcine intestines by Chen et al. In 1995, Allograft inflammatory factor-1 AIF-1 was cloned by Utans et al from activated macrophages of rat atherosclerotic allogenic heart grafts. Daintain and AIF-1 of pig, rat, and human origin are identical proteins with only species-specific amino acid differences. Hence, we call the polypeptide ―Daintain/AIF-1‖. Daintain/AIF-1 is a 17kD cytokine that expressed mainly in macrophages and activated T cell. It is regarded as a novel multifunctional inflammatory factor that plays important roles in allograft rejection, vasculopathy, cancer, and autoimmune diseasesType 1 Insulin-dependent Diabetes Mellitum T1DM is characterized by a progressive autoimmune-mediated insulitis culminating in the death of pancreatic β cells. The β cell secretory dysfunction and apoptosis in the course of insulitis are perhaps caused by direct contact with activated T-cells and macrophages, and/or exposure to inflammatory mediators secreted by these cells, including cytokines and NO. We have previously observed a particularly dense accumulation of Daintain/AIF1-immunoreactive macrophages in the insulitis affecting the pancreatic islets of prediabetic BB rats, suggesting that Daintain/AIF-1 have a role in connection with the pathogenesis of T1D. In this study, we aimed to investigate further the role of Daintain/AIF-1 in the pathogenesis of T1DM. The following work has been done: In the first part of the study, we explored the impact of Daintain/AIF-1 on β cell dysfunction in vitro using rat insulinoma INS-1 cells, a well-established insulin-secreting cell line for the study of diabetes. Various concentrations of Daintain/AIF-1 were added into the INS-1 culture medium. The influence of Daintain/AIF-1 on INS-1 cell viability, apoptosis, cell cycle, insulin secretion, and NOIV华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 production were detected and the results are as follows : 1. Daintain/AIF-1 exerts toxic effects on INS-1 cells, as it suppresses INS-1 cell viability2. Daintain/AIF-1 is effective in inducing apoptosis in INS-1 cells, especially early apoptosis, suggesting that it plays stimulatory roles in the initial stages of apoptosis, leading to elimination of viable cells and subsequently a decrease in INS-1 cell viability3. Daintain/AIF-1 caused no significant alteration effects on the basic insulin secretion BIS of INS-1 cells, but reduced glucose-stimulated insulin secretion GSIS levels, implying an impairment role of Daintain/AIF-1 on insulin secretion of INS-1 cells responding to high glucose levels. Besides the aforementioned suppression on cell viability, this inhibition of glucose-responsiveness might be another toxic effect that Daintain/AIF-1 exerts on β cell dysfunction in T1DM4. NO production in INS-1 cells increased significantly under Daintain/AIF-1 treatment. This suggests that the increase in NO level may be contributive to the increased apoptosis and decreased GSIS, which may be one of the mechanisms of Daintain/AIF-1-induced β cell toxicity5. More cells were arrested in the G0/G1 phase after Daintain/AIF-1 treatment, makes the number of cells that proceed to S phase and G2/M phase decreased, demonstrating the inhibitor effect of Daintain/AIF-1on INS-1 cell proliferationIn the second part of the study, amied to identify some Daintain/AIF-1-interacting partners to better understanding the cytotoxic effects of Daintain/AIF-1 on β cells, we TM used Clontech Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 to perform a yeast TM two-hybrid screen of the human pancreas Matchmaker cDNA library. Here are the results: 1. We constructed the recombinant bait plasmid pGBKT7-Daintain/AIF-1. After transferred into yeast AH109, the expressed fusion bait protein BD-Daintain/AIF-1 showed to be nontoxic to AH109 yeast, and did not activate the reporter genes V华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2. The amplified human pancreatic cDNA library was transferred into AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1 yeast and plated onto SD /-Trp /-Leu /-His /-Ade selective plates. After the β-galactosidase activity assay we preliminarily screened out 64 Ade+ His+ lacZ+ candidate yeast clones3. Then we performed the ― one-to-one‖ verification tests to exclude false positive results, and only one kind of library plasmid passed all the tests. The cDNA insert was sequenced and Blast in the Genebank. We analyzed the translation reading frame and found that a frameshift occurred, thus the fragment can only express an unknown 32-amino acid residues peptide. This result indicates that the plasmid is still a false positive. Although our experiments did not gain positive results, they exemplified the highly false positive rate of the yeast two-hybrid system, which is an inevitable major flawIn summary, this study provides the first description of the cytotoxic effects of Daintain/AIF-1 on INS-1 β cells in vitro, as evidenced by decreased cell viability and GSIS, as well as upregulated apoptosis and NO production. We speculate that Daintain/AIF-1 may inhibit cell proliferation by arresting cells in G0/G1 phase, and induce cell apoptosis and suppress insulin secretion by stimulating NO productionCollectively, these data indicate that Daintain/AIF-1 exerts stimulatory effects in β cell dysfunction, thus may play important roles in the initiation and progress of T1DM Key words: Daintain/AIF-1, yeast two-hybrid system, Type 1 Diabetes Mellitum, INS-1 cell, cytotoxic, insulin secretion VI华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 目 录 摘 要 I AbstractIV 1 绪 论 1.1 Daintain/AIF-1:疾 病相关 的多功 能 炎症因子 1 1.2 细胞因子及 NO 在 1 型糖尿病 中的 作 用 10 1.3 酵母双杂交系统 在蛋白 质相互 作用 中的研究 进展16 1.4 本研究的目的与 意义. 25 2 Daintain/AIF-1 对 β 细胞功能的 影响 2.1 引言. 27 2.2 实验材料 28 2.3 实验方法 31 2.4 实验结果与讨论 37 2.5 小结. 45 3 酵母双杂交技 术筛选 Daintain/AIF-1 在人胰腺 中的相 互作用 蛋白 3.1 引言. 46 3.2 实验材料与仪器 48 3.3 实验方法 59 3.4 实验结果与分析 74VII华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3.5 小结与讨论86 4 全文 4.1 主要研究结果. 90 4.2 创新点 92 4.3 展望. 92 致 谢 94 参考文献95 附录 1 攻读博士学位 期间发 表的文 章. 114 附录 2 主要缩略词表. 115 附录 3 氨基酸缩写表. 116 VIII华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 绪 论 1.1 Daintain/AIF-1 : 疾 病 相 关的 多功能 炎 症因 子 1994 年 Chen ZW 从猪小肠中分离 纯化 出一个对 胰岛素分泌具有调节功 能的激 [1] [2] 素样活性蛋白,命名为 Daintain (大炎肽) 。1995 年,Utans 等 从大鼠慢 性排 斥的心脏移植物中克隆出一个巨噬细胞因 子的 cDNA , 将其 称为 Allograft Inflammatory Factor-1 (AIF-1, 同种异体移植炎 症因子-1) , 随后又从人心脏移植排 [3] 斥活化的巨噬细胞中克隆出了 AIF-1 , 通过 cDNA 序列推断出 AIF-1 的蛋白序列 由 147 个氨基酸组 成,除 N 端起始的甲硫氨酸 外,和以化学法测序的 Daintain 高 度同源 (90% ) , 因此本文将 Daintain 与 AIF-1 并称为 Daintain/AIF-1。 目前已知 离 2+ 2+ [4] 子化 Ca 结合调节器 1ionized Ca -binding adapter ,Iba1 和小胶质细胞应答因子 [5] microglia response factor , MRF-1 是 Daintain/AIF-1 的 2 个同系物 。 Daintain/AIF-1 [6] [7] [8] 普遍存在于人、鼠、猪 、 牛 等哺乳动物中 ,在脊椎动物如红海鲷 、鲤鱼 和低 [9] 等动物 海绵 中也有表达, 它们在氨基酸序列上保持了高度 同源性, 表明其在进化 [10] 上的保守性 (图 1.1 ) 。 人 Daintain/AIF-1 基因定位 于 6 号染色体 上 的 HLA (humam leucocyte antigen ) [11] III 类基因 BAT2 区域内, 其 增强子区域具有单核苷酸多态性SNP , 基因表达需 [12] [6] 要 转录因子 Pu.1 。Chen ZW 在氨基酸水平上 测定了 Daintain/AIF-1 的序列 ,它 2+ 由 146 个氨基 酸残基组成,N 端丝氨酸被乙酰 化, 内部含有一个特征性的 Ca 结 合 EF- 手形结构域(DLNGNGDIDIM ) 、一个 44 个氨基酸残基片段组成的 典型的 -KR-KK-GKR- 多肽激素类前体模式、 一 些 PDZ 结构 域结合基序以及酪氨酸激酶磷 酸化位点和多肽激素翻译后修饰区等,这 多个生物学活性位点提示 Daintain/AIF-1 具有广泛的生物学特性。 Daintain/AIF-1 主要由巨噬细胞和激活的 T 淋 巴细胞表达, 在 机 体 的炎 症病 变 、血 管 病变 、移 植 排斥 、 自身 免 疫 疾病 以及 癌 症中 发 挥重 要 作 用 。1华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文[13] 图 1.1 不同物种 来源的 Daintain/AIF-1 氨基酸序列比 对 将 7 个物种 来源的 Daintain/AIF-1 的氨基酸序列进 行 比对。 黑色标 记 在所有物 种中保守 的氨基 酸; 灰色 指示至 少在 4 个 物种中保 守的氨基 酸; 实线 标示 的是 EF 手 形结构域 , 箭 头 之间的 序 2+ 列 为 Ca 结合位点 ;虚 线代表 可能的 多 肽激素 翻 译后 加工 区域, 加粗的氨 基酸序列 -KR-KK-GKR- 代表 激素 前体转化 酶和酰 胺化酶的 识别 位点。 [13] Fig.1.1 Alignment of amino acid sequences of Daintain/AIF-1 from different species The amino acid sequences of Daintain/AIF-1 from seven species are presented and comparedAmino acid residues conserved among all seven species are shadowed in black; those present in at least four species are shaded in grey. The EF hand-like motif is underlined and the region between 2+ two arrows represents the putative Ca -binding loop. The broken line indicates the putative post-translational processing motif of peptide hormones and the recognition sites for pro-hormone convertases and amidation enzymes are emphasized with a bold line 1.1.1 Daintain/AIF-1 与炎症病变 体外 研究 发现 IL-1β 和 TNF-α 等促炎症 细胞 因 子 可 刺 激 巨 噬 细 胞 中 Daintain/AIF-1 表达上调,而 Daintain/AIF-1 过表达的巨噬细胞中 iNOS 和 MCP-1 水平升高,细胞迁移能力增强 。转染 siRNA 抑 制巨噬细胞中 Daintain/AIF-1 表达, 2华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 则 iNOS 表达被抑制,细胞迁移能力降低,凋亡 率增加 ,说明 Daintain/AIF-1 对巨 [14] 噬 细 胞 的 存 活 至 关 重 要 , 在 调 节 其 迁 移 以 及 促 炎 症 方 面 起 重 要 作 用 。 Daintain/AIF-1 还可调节炎症因子刺激下的单核/ 巨 噬 细 胞 系 分泌 特 定 的 细 胞因 子 [13] 如 IL-6、 IL-10 和 IL-12 等 。 Daintain/AIF-1 在 很多炎症病变损伤 部位的表达上调, 可见 在 炎 症 微 环 境 中 , 单 核/ 巨 噬 细 胞 被 活 化 进 而 大量 表达 Daintain/AIF-1 ,而 Daintain/AIF-1 又反过来调节着巨噬细胞的炎症 状态,在免疫炎症反应中发挥重要 作用。 Daintain/AIF-1 在正常皮肤中低表达,但在很多炎症性皮肤病,如牛皮癣 和扁 [15] 平苔癣 中表 达上 调, 主要 位于 病变皮 肤的 巨噬 细胞和 郎格 罕氏 细胞 。视 黄酸以 及一些细胞因子可显著上调 THP-1 和 U937 细 胞中 Daintain/AIF-1 的 mRNA 水平, 推测皮肤病中 Daintain/AIF-1 介导了巨噬细胞 的存活和促炎症反应, 而肾上腺皮质 激素或类视黄醇类药物对一些皮肤病的疗效就部分源于它们对 Daintain/AIF-1 的调 [16] 节效应 。 中枢神经系统损伤后, 小胶质细胞是重要且最 早响应的细胞类型。 正常人脑 实 质小胶质细胞仅表达痕量水平的 Daintain/AIF-1 。发生脑梗塞 时,从梗塞 的形成到 慢性囊阶段, 神经胶质反应区域激活的 CD68+ 小胶质细胞中 Daintain/AIF-1 表达水 [17] 平 持 续 升 高 。 在 克 罗 伊 茨 费 尔 特- 雅 各 布 病 人Creutzfeldt-Jakob disease 脑部, [18] Daintain/AIF-1 免疫反应性小胶质细胞 大量增加 。此外,Borna 病毒感染 Lewis 大 鼠 引 发免 疫介 导 的非 化 脓性 脑膜 脑 炎, 在 感染 早 期 ,大 鼠脑 部 炎症 损 伤部 位 以 及 邻 近 的 脑 实 质 中 的 小 胶 质 细 胞 就 开 始 表 达 Daintain/AIF-1 。在 感染 24 天后 [19] Daintain/AIF-1 表达水平更是广泛上调 。Daintain/AIF-1 阳性细胞可能代表响应 脊髓损伤最早的一类细胞, 推测 Daintain/AIF-1 的作用是启动早期小胶质细胞的响 [20] 应 , 导 致 中 枢 神 经 系 统 损 伤 急 性 响 应 所 必 需 的 小 胶 质 细 胞 的 活 化 和 增 生 。 [19] Daintain/AIF-1 是小胶质细胞活化的一个灵敏的标志 ,而且检测 Daintain/AIF-1 [21] 的免疫活性可对炎症损伤中单核细胞和小胶质细胞的活化阶段进行分级 。 [22] 在 Th1 型炎症病变模型如硫酸三硝基苯 (TNBS ) 诱导的小鼠结肠炎 和大鼠 [23] 抗 肾 小 球 基 膜 型 肾 炎 中 , 侵 润 的 炎 症 细 胞 大 量 表 达 Daintain/AIF-1 ,而 3华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Daintain/AIF-1 过表达的转基因小鼠结肠炎的严 重程度比正常小鼠的轻,这一改善 同结肠中 Th1 型 促炎症因子 IL-1β 的低表达有 关, 说明 Daintain/AIF-1 参与调节 Th1 [22] 型炎症反应 。鉴于 Daintain/AIF-1 在 巨噬细 胞中的表达可以被 Th1 炎症因子如 INF-γ 、IL-1β 等上调,Daintain/AIF-1 的增高表 达可能反映了一种抑制 Th1 反应的 [22] 反馈机制 ,但其具体机理还有待进一步研究 。 Kimura 等发现 Daintain/AIF-1 还参与类风湿关 节炎病理进程。 滑膜细胞的增殖 是类风湿关节炎最关键的病理变化之一, 类风湿关节炎中 Daintain/AIF-1 在侵润的 单核细胞和滑液的成纤维细胞中强表达, 体外实验中 Daintain/AIF-1 以剂量依赖的 形式诱导滑液 细胞增殖 ,促进滑液 成纤维细 胞 和外周血单核 细胞分泌 IL-6 ,表明 Daintain/AIF-1 可能通过缩短细胞周期来促进滑 膜细胞的增殖, 以及影响 IL-6 等炎 [24] 症因子 级联 反应 这两 条途 径来 调节类 风湿 关节 炎的病 理进 程 。 此外 ,基 因型以 [25] 及表达分析也显示 Daintain/AIF-1 的 SNP 和类 风湿关节炎之间有关联 。 1.1.2 Daintain/AIF-1 与血管病变 血管病变 的发病 机制涉 及血管 损伤后 的炎症 反 应过程, 即免疫 细胞如 单核/ 巨 噬细胞、T 淋巴细胞等被活化, 毁坏内皮组织 , 导致细胞因子的产生, 进而活化内 中层的血管平滑肌细胞 (VSMC ) ,使其增殖和 迁移到内膜和细胞外间 质, 产生闭 [26] 塞性动脉内膜增厚 。 而 Daintain/AIF-1 在病变 进程必需的初始的 T 淋巴细胞活化 中发挥重要作用。冠状动脉 血管病变病人冠状动脉中 CD3+ 淋巴细胞表达 Daintain/AIF-1 。一些细胞因子刺激下,外 周血单核细胞和 MOLT-4 细胞中 Daintain/AIF-1 表达上调。过表达 Daintain/AIF-1 的 MOLT-4 细胞增殖速度和迁移 能力明显增强, 该细胞的条件培养基还可促进原代人 VSMCs 增殖加 快 99% , 这说 明 Daintain/AIF-1 由激活的 T 淋巴细胞表达, 同时 Daintain/AIF-1 的表达增强了 T 淋 巴 细 胞的 迁移 和 增殖 , 进而 活化 邻 近的 动 脉平 滑 肌 细胞 ,参 与 冠状 动 脉血 管 病 [27] 变进展 。 Daintain/AIF-1 在动脉损伤后可被诱导表达,是动脉损伤以及 VSMCs 活化的 标志,促进着 VSMCs 及内皮细胞(EC )的活 化、增殖与迁移,在动脉损伤后血 4华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 管新内膜形成以及血 管增殖性病变 过程中发 挥重要作用。进一步 的研究表明: Daintain/AIF-1 转染 VSMCs 后, 促进周期蛋白 PCNA 、cyclin A 以及 cyclin B 的表 达,缩短了细胞周期从而促进 VSMCs 增殖, 且 Daintain/AIF-1 的表达量越高,促 [28] 增殖作用越强 。 另外 Daintain/AIF-1 还促 进 VSMCs 自分泌粒细胞集落刺激因子 [29] (G-CSF )来调节其增殖 。Daintain/AIF-1 作 为一个胞浆脚手架蛋白,可作用并 聚合纤维型肌动蛋白 (F-actin ) , 在血小板源性 生长因子 (PDGF ) 刺激下, 一起迁 [30] 移到膜皱褶中, 将 Rac-1 蛋白激活, 促进 VSMCs 的迁移 ; 还可作用并激活 Rac2 , [31] 诱导 VSMCs 的活化和迁移 。 过表达 Daintain/AIF-1 的转基因小鼠相对于野生型 小鼠来说 , 颈动脉损伤部位血管形成的新内膜区域明显增大; 体外培养的 VSMCs [32] 增殖和迁移更快,胞内活化的 p38 和 PAK1 水 平也显著升高 。Sommerville 等发 现 Daintain/AIF-1 发挥调节作用有两种信号通 路:促进 VSMCs 增殖 是 p38 MAPK [33] 依赖型信号通路,促进 VSMCs 迁移则为 p38 MAPK 非依赖型 。血管炎性神经 病变中 Daintain/AIF-1 基因过表达,推测 Daintain/AIF-1 调节血管周围性炎症引起 的神经外膜 VSMCs 的增殖迁移, 在神经外膜 血管增厚中发挥病理作用, 是血管炎 [34] 性神经 病变 的一 个致 病因 子, 可能作 为一 个新 的治疗 的分 子靶 点 。 此外 ,大鼠 [35] 肝脏热、冷缺血- 再灌注损伤中 Daintain/AIF-1 的表达也被激活 。在发炎的人动 脉新内膜中, CD31+ 内皮细胞也表达 Daintain/AIF-1 。 转染 Daintain/AIF-1 的 siRNA 显著抑制内皮细胞增殖和迁移, 而转染 Daintain/AIF-1 使其过表达则细胞增殖和迁 移 能 力 提 高 , 导 管 样 结 构 和 微 血 管 形 成 的 数 目 以 及 复 杂 度 也 增 加 了 , 表 明 Daintain/AIF-1 还调节着与 VSMCs 紧邻的血管 内皮细胞的激活、信号转导以及血 [36] 管发生 。 Daintain/AIF-1 还参与动脉粥样硬化血管病变发生发展。氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL)是一种致动脉粥样硬化的刺激因子,可以激活动脉粥样硬化斑块中巨 噬细胞的信号转导级联反应,从而启动动脉粥样硬化病理发展过程。oxLDL 刺激 下,人和鼠巨噬细胞中 Daintain/AIF-1 水平显著提升。将 siRNA 转染巨噬细胞中 抑制 Daintain/AIF-1 表达,再给以 oxLDL 刺 激,则动脉粥样硬化信号蛋白 Akt 、 p44/42 MAPK 以及 p38 激酶的磷酸化显著降低 , 表明 Daintain/AIF-1 介导了致动脉 5华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 [37] 粥 样硬 化的 起始信 号的 转导 和巨噬 细胞 的活化 。与此 对应,Mishima 等报 道用 Daintain/AIF-1 转染巨噬细胞使其过表达,则显 著增强巨噬细胞对乳胶微球和大肠 杆菌 BioParticles 以及乙酰化 LDL 的吞噬能力 ,加速了 ApoE-/- 转基因小鼠动脉粥 [38] 样硬化的进程 , 进一步说明了 Daintain/AIF-1 调节着巨噬细胞的功能发挥, 在 动 脉粥样硬化中发挥重要作用。 2+ Daintain/AIF-1 具有胞浆信号蛋白的结构特征,其内含的 Ca 结合 EF 手结构 域是其发挥作用所必需,该结构域突变致使 Daintain/AIF-1 失去了对 VSMCs 的促 [39] 增殖作用 。 此外,Daintain/AIF-1 还含有一些 可以和 PDZ 结构域结合的基序 而使 [33] [37] 其能够介导细胞特定部位装配多蛋白复合体 , 以及 QXXER 基序介导 Gβγ 相 [37] 互作用 。 再结合 Daintain/AIF-1 在 以 上 血 管 病 变 中 的 表 达 特 点 , 推测 Daintain/AIF-1 可作为信号通路的一个脚手架蛋 白,将一个或多个信号转导激酶和 它们的活性底物拉近以利于信号转导,调节着巨噬细胞、T 淋巴细胞、VSMCs 以 [26, 及 ECs 的活化 、 增殖和迁移, 在血管病变的一系 列细胞事件进展中发挥重要作用 33, 37] [40] 。可以作为治疗增殖性动脉血管病变的一 个靶点 。 1.1.3 Daintain/AIF-1 与移植排斥 移植排斥反应本质 是受体免疫 系统对移 植器官的免疫排斥 反应, Daintain/AIF-1 在免疫排斥反应中的上调表达与 移植排斥中巨噬细胞的激活和功能 发挥相关。Daintain/AIF-1 最初是从发生慢性排 斥反应的大鼠同种异体心脏移植物 中 克 隆 出 来 , 在 对 照 组 的 同 种 同 基 因 移 植 物 以 及 供 体 心 脏 中 并 不 表 达 。 Daintain/AIF-1 选择性表达于巨噬细胞和嗜中性粒细胞,且在 IFN-γ 诱导下显著上 [2] [3] 调 。在人心脏移植排斥活化的 CD68+ 巨噬细胞中也克隆出了 Daintain/AIF-1 , [26] 其表达和排斥反应有关, 且表达量和心脏同种异体移植排斥的严重程度正相关 , [26] 可以作为移植排斥的一个代理标记物 。 持续使用抗 CD4/CD8 免疫抑制疗法可以 降低小鼠心脏同种异体移植物中 Daintain/AIF-1 的转录水平, 阻断炎症的活化和减 [41] 少血管内膜增厚 , 表明在心脏同种异体移植 中,Daintain/AIF-1 是巨噬细胞激活 [3] 过程中的一个免疫调节器 。Grimm 等 对肾同 种异体移植物组织活检时发现, 在所 6华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 有分析的巨噬细胞活化标记物中, 如 CD25 、穿孔素、TNF-α 等,仅活化的 Daintain/AIF-1+ 巨噬细胞侵润在临床排斥反应中显著升高,提示 Daintain/AIF-1 可 作 为 巨 噬 细 胞 活 化 的 标 记 物 来 区 分 肾 移 植 的 临 床 和 亚 临 床 排 斥 反 应 , 活 化 的 Daintain/AIF-1+ 巨噬细胞可能通过分泌细胞因子引起移植物血管痉挛或其他损害, [42] 导致标 志急 性临 床排 斥反 应的 肾小球 滤过 作用 急性恶 化的 产生 。另 外, 大鼠肝 脏移植后,肝脏 Kupffer 细胞及外周血白细胞 中 Daintain/AIF-1 表达明显增高,反 映出肝脏对移植物产生急性免疫排斥反应, 检测外周血粒细胞中 Daintain/AIF-1 水 [43] 平可以监视增高的免疫抑制 。 另外,Daintain/AIF-1 还参与低等动物海绵的同种 [9, 44] 异体移植免疫排斥 。 1.1.4 Daintain/AIF-1 与生殖免疫 调节 Daintain/AIF-1 在小鼠子宫中表达,表达水平和 巨噬细胞种群大小相关,在动 情 期 和 妊娠 的植 入 期这 两 个巨 噬细 胞 大量 涌 现的 时 期 达到 峰值 。 有胎 儿 再吸 收 倾 向的妊娠小鼠的胚胎中 Daintain/AIF-1 表达量 升高, 同时伴随 TNF-α 以及一氧化氮 [45] 合酶(NOS2 )mRNA 的表达升高, 表明 Daintain/AIF-1 和胚胎吸收有关 。牛妊 娠期的一些关