盐酸乐卡地平的合成(1).pdf

盐酸乐卡地平的合成(1).pdf 实验九 性染色质 【实验原理】 在间期细胞核中，女性X染色质和男性Y染色质均可用特殊染色法显示出来。女性的两个X 染色体中的一个，在间期时的染色质呈异固缩(Heteropycnosis)，呈深染的小体，称Barr氏 小体。Barr氏小体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易为碳酸复红或硫堇等染料 着色。正常女性Barr氏小体阳性，男性为阴性。 男性Y染色质位于间期细胞核近中央部，易为盐酸阿的平着色，荧光显微镜下观察发教强 荧光，呈点状小体，发光部分系Y染色体异固缩的长臂。初代培养细胞和二倍体细胞株均可观 察到性染色质，传代细胞系现不规律。 【实验方法】 (一)碳酸复红(Basic Fuchsin)显示X染色质法 X染色质显示常用碳酸复红法和硫堇(Thionine)法。碳酸复红法显示过程如下: 染色液 干液:称碱性复红3g，溶于100ml 70%乙醇中，可长期保存。 工作液:(现用现配) 干液 10.0ml 5%石炭酸水溶液 90.0ml 冰醋酸 10.0ml 甲醛(40%) 10.0ml 染色步骤 (1)细胞:盖片培养细胞用37?的BSS漂洗后，立即投入染色液内染色5~10分钟(亦可先固定再染色);如用涂片标本则应待涂片干后，迅速投入96%酒精固定10~15分钟后再染色; (2)分化:用96%酒精分化1分钟，分化时要不断摇动，把片子上多余的染料漂洗掉; (3)脱水:通过纯酒精1分钟; (4)封片:二甲苯透明2~3分钟，树胶封固。 结果 细胞质不着色，细胞核染成紫红色;阳性Barr氏小体附于细胞核膜内面呈三角形或半月形小体(如图所示) (一) 荧光染色显示Y染色质 1、 取材 方法同X染色质的检测，实验安排时可作两份制片。 2、 染色 口腔粘膜细胞制片放入1:1乙醇-乙醚溶液内固定15分钟至12小时(可长至几周 而不影响结果)。然后移入95%乙醇中约30分钟。 外周血细胞制片用无水甲醇固定5,10分钟，空气干燥，此标本在室温下可保持3, 5天。 毛根鞘细胞制片请实验者按上述两法进行固定等处理，并比较最后结果。 上述处理好的制片按下列步骤染色: ? 将标本放入0.5%盐酸阿的平溶液内染色10分钟，染液温度18,22?。 ? 染色后立即以流动的自来水冲洗约1分钟，空气干燥。 ? 在标本上加1,2滴McIlvaine缓冲液(PH5.5,6.8)，立即盖上盖玻片。 ? 用吸水纸吸去多余的缓冲液，并用市售橡胶水在盖玻片边缘封口，以防缓 冲液蒸发。 ? 荧光显微镜观察。 【实验结果及思考】 1.X染色质的观察 选择细胞核较大，染色清晰，轮廓清楚，核质呈均匀细网状的细胞100个，计数X 染色质的出现频率。X染色质应位于细胞核膜的内侧，轮廓清晰呈平凹形、三角形或卵 圆形，颜色深染，直径约1,1.5微米。阳性涂片至少15%的细胞含X染色质，一般不 超过30%,35%。而来自男性的样本涂片应呈阴性，出现率低于2%。 观察时注意下列可能的现象:?阳性样本的X染色质出现率低于正常值;?阳性样 本的X染色质形态比正常的大或小些;?X染色质数目异常，样本与表型性别不一样。 2.Y染色质的观察 制备好的标本均应平放于暗处(如玻片盒内)，在12,17小时内镜检。12小时之 前可见Y染色质的细胞很少，且不亮，而27小时后则开始褪色。镜检时，在荧光显微 镜下从低倍物镜转至高倍油镜下观察，整个细胞发出亮荧光者不算在内。Y染色质一般 靠近核膜或接近核的中心和近中心。如在油镜下观察到细胞核中有发亮的荧光小体，即 可认为Y染色质阳性。Y染色质直径一般为0.25,0.3微米，在男性不同类型细胞中的 检出率往往有差异，但一般阳性涂片应达25%,50%的细胞含有Y染色质。正常男性细 胞中可见一个Y染色体，正常女性则没有。 选择100个核膜完整无缺，核质染色均匀，清晰可见的细胞进行计数。观察时注意下列 可能出现的现象:?阳性样本，但阳性细胞数低于正常值;?阳性样本，但是Y染色质 的形态显示双份结构，二者相隔较远，可能代表两个Y小体或Y小体数超过二个;?阳 性样本，但Y染色质异常小或特别大;?样本与表型性别不一致。 3、结合你的实验检测结果，谈谈你对X染色体失活及基因剂量补偿效应的理解。 荧光染液 Sorensen PBS (pH5.5~6.6) 100.0ml 盐酸阿的平(Atebrine) 0.2g 染色 Y染色质显示染色与染色体荧光显带法相同。 结果 在荧光显微镜下观察， Y染色质呈特别明亮的黄绿色荧光圆点，直径0.25-0.3微米，可位于核内任何位置，但以近中央时居多。 附:硫堇法 1.取材及制片 口腔粘膜细胞:先让受检者(可以是实验者本人)用水漱口数次，以尽可能去除口腔内杂物，然后用 医用压舌板刮取受检者口腔颊部粘膜，将刮取物在载玻片上涂片，晾干。 外周血细胞:在受检者无名指指端取血，制成较厚的血涂片，空气中干燥。 毛根鞘细胞:取受检者带毛根鞘的毛发一根(约2cm长)放在一干净的载玻片上。在根部加一滴50%醋酸溶液，静置5分钟，待毛发软化后，用干净针头将根部组织刮下，去毛干，并用针头将刮下的组织均匀地分散，晾干。 2.染色 (1) 硫堇染色 ? 将制片置甲醇-冰醋酸(3:1)固定液中20分钟。 ? 蒸馏水中漂洗2~3分钟。 ? 置37?水浴的1mol/L HCl中水解20分钟。 ? 硫堇染色10,20分钟，蒸馏水漂洗，晾干即可镜检。如染色太深则可在95%乙醇中分化30秒 钟左右，如太浅可再复染。 人毛根鞘细胞制片可直接用硫堇工作液染色后，移入75%乙醇中约半分钟，轻轻摆动，取出晾干即可。 2) 焦油紫染色 ( ? 制片用95%乙醇固定液固定30分钟。 ? 经过70%、50%乙醇和蒸馏水各5分钟，再经过蒸馏水2次。 ? 标本浸入1%焦油紫水溶液中染色5,8分钟。 ? 95%乙醇中分色，上下摆动约5,8次即可。 ? 在无水乙醇中继续分色，并镜检，直至核结构十分清晰为止，分色所需时间通常约需1分钟。 ? 在二甲苯中透明两次，每次3分钟，封片后即可镜检观察。