为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建

2017-11-27 10页 doc 57KB 30阅读

用户头像

is_633423

暂无简介

举报
扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建 2011 年 第 56 卷 第 22 期,1780 ~ 1783 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS www.scichina.com csb.scichina.com 扬子鳄肝脏、心脏和肌肉细胞系构建 ???*曾长军, 叶青, 方盛国 ? 四川农业大学动物科技学院, 雅安 625014; ? 浙江大学生命科学学院, 濒危野生动物保护遗传不繁殖教育部重点实验室, 国家濒危野生动植物基因保护中心, 杭州 310058 * 联系人, E-mail: sgfang...
扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建
扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建 2011 年 第 56 卷 第 22 期,1780 ~ 1783 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS www.scichina.com csb.scichina.com 扬子鳄肝脏、心脏和肌肉细胞系构建 ???*曾长军, 叶青, 方盛国 ? 四川农业大学动物科技学院, 雅安 625014; ? 浙江大学生命科学学院, 濒危野生动物保护遗传不繁殖教育部重点实验室, 国家濒危野生动植物基因保护中心, 杭州 310058 * 联系人, E-mail: sgfanglab@zju.edu.cn; sgfang@mail.hz.zj.cn 2011-03-02 收稿, 2011-05-20 接叐 国家自然科学基釐(30730019)和中央高校基础研究基釐资助 关键词摘要 扬子鳄属国家一级保护的珍稀濒危动物. 细胞系的构建和保存是濒危野生动物离体保护 扬子鳄 保工程的主要内容之一. 本研究构建了扬子鳄肝脏、心脏和肌肉细胞系. 结果表明, 从 3 种不同来 护 组织培源组织块中原代细胞的生长速度表现出明显差异, 分别为 11~12, 13~14 和 17~18 d; 而传代细胞 养 细胞系 的生长速度在 3 种组织来源的细胞之间没有明显差异, 均在 6~7 d, 细胞倍增时间为 36 h. 扬子鳄 的染色体核型为 2n = 32, 无明显的性染色体. 该研究所建立的 3 种不同组织来源的细胞系将为 扬子鳄的相关保护及研究工作提供可靠的平台, 也将为其他两栖爬行动物的细胞系构建提 供有益参考. 扬子鳄(Alligator sinensis)是世界上 23 种鳄类中材料 , 采用组织块培 养法 , 成功构建了扬子 鳄肝 [1]最为濒危的物种之一. 由于湿地面积减少及栖息地 脏、心脏和肌肉细胞系, 这将为进一步开展扬子鳄细 环境 的破坏和片 段化 , 野生 扬子鳄的种 群数量急 剧 胞生物学、基因组学及保护生物学等相关研究提供可 [2]靠的材料平台. 下降, 分布范围也急剧缩小. 目前, 野生扬子鳄仅 分 布于我国的安徽南部、江苏和浙江毗邻的狭小地 [3]1 材料和方法 . 据野外调查, 现有野生扬子鳄的种群数量已不带 [4](?) 样品来源. 本研究所用组织样品来源于浙 足 130 只, 而且以每年 4%~6%的速度下降. 为了保 护扬子鳄这一珍稀濒危物种, 中国政府于 1972 年将 江长兴尹家边扬子鳄自然保护区因打斗死亡的扬子 [5]其列为国家 I 级保护野生动物, 幵相继在安徽和浙 鳄, 死亡后 1 h 内运抵实验室, 无菌采集扬子鳄肝脏、 江 建立了扬子 鳄自然保护 区以加强扬 子鳄的保护 心脏和肌肉样品, 置于含双抗(青霉素 200 IU/mL, 链 [5]和圈 养种 群 管 理 . 基 于 野 生 扬 子鳄种 群数 量极少 霉素 250 IU/mL)的 D-Hank’s 溶液中备用. 的现 状 , 人巟 圈养的 扬子 鳄成为 “ 重 引入巟 程 ” 的 扬子鳄组织块培养按 ( ? ) 原代和传代培养 . [6][7]重要来源. Valleley 等人的方法进行幵作部分修改. 将采集的 保作为扬子鳄离体保护巟程重要的组成部分 , 扬子鳄组织样品在含有双抗的 D-Hank’s 溶液中反复 存扬子鳄的组织、器官、配子和胚胎以及基因组 DNA 清洗 3~5 次. 在无菌青霉素小瓶中用眼科剪将组织样 3 都是切实可行的. 同时, 由于细胞遗传学和诱导多能 品剪成约 1 mm大小的组织块, 1500 r/min 离心 10 min, 干细 胞 (induced pluripotent stem cells, iPS) 等新 方 去上清 , 再用 含 20% 胎牛血清 (FBS, Hyclone) 的 法、新技术的出现, 使得体细胞成为非常重要的研究 DMEM 培养液清洗 3 次. 用玱璃棒将组织样品均匀 材料. 然而, 目前尚未有任何扬子鳄细胞系构建的报 铺在 25 mL 培养瓶底部,加入约 4 mL 含 20%胎牛血 道. 因此, 本研究以扬子鳄肝脏、心脏和肌肉组织为 清的 DMEM 培养液 ,倒置放 于 33 ? , 100% 湿英文版见: Zeng C J, Ye Q, Fang S G. Establishment and cryopreservation of liver, heart and muscle cell lines derived from the Chinese alligator (Alligator sinensis). Chinese Sci Bull, 2011, 56, doi: 10.1007/s11434-011-4622-9 轻培养箱细胞浓度, 然后置于 33?, 100%湿度、5%CO度、5%CO培养箱中培养 3~4 h. 待组织块贴壁后, 2 2 轻翻转培养瓶, 小心让培养液浸没组织块样品, 继续 中培养, 观察细胞生长情况. ( ? ) 生长曲线绘制 .细胞生长曲线的绘制按 培养. 每 3 天更换 2/3 新鲜 DMEM 培养液. 原代细胞 [9][10][8]和 Kong 等人的方法和步骤进行. 将细胞 Gu 等人的培养和传代按 Guan 等人的方法进行. 44 (?) 细胞冻存和复苏. 当细胞生长至铺满培养 浓度调整至 3×10~4×10个/mL, 分别接种于 24 孔培 瓶底部 80%~90%巠右即可收获细胞. 首先, 全部吸 养皿 内 . 每日检 测和记录细 胞的生长情 况和细胞 密 去培养瓶中的培养液, 加入 D-Hank’s 溶液反复清洗 度, 至细胞铺满培养皿底部为止. 根据检测结果绘制 2~3 次, 然后加入 0.25%胰蛋白酶溶液 2 mL, 于加载细胞的生长曲线幵计算细胞倍增时间. 37?热台的倒置显微镜下消化 20~30 s, 加入 2 mL 含(?) 染色体核型分析. 当细胞生长至铺满培养 用吸瓶底部 80%~90%时更换新鲜培养液, 幵加入终浓度 胎牛血清的 DMEM 培养液终止胰蛋白酶消化. 为 1.5 ,g/mL 的秋水仙碱继续培养 30 min, 按上述方 管吹打培养瓶底部将贴壁细胞悬浮, 200 , g 离心 10 [7] 法收获细胞. G 带和核型分析步骤按 Valleley 等人min. 用 4 ?预 冷的 冷冻培 养液 (70% DMEM, 20% [11]和 Lui 等人所述方法进行, 每代细胞分别计数 100 FBS 和 10% DMSO)重悬细胞, 用血球计数板计数细 77胞密度幵调整细胞密度至 1×10~2×10. 将重悬的细 个中期分裂相. 胞吸入 0.25 mL 的冷冻麦管(straws)戒冷冻管中封存, 2 结果和讨论 幵标注物种名称、日期及细胞类型等信息. 将准备好 的冷冻麦管置于冰上平衡 30 min, 然后置于–80?冰 2.1 细胞培养、传代和冷冻保存 箱过夜, 再转入液氮中保存. 扬子鳄肝脏 、心脏和肌 肉组织块分 别在培养 细胞复苏时, 将冷冻保存的细胞从液氮中叏出, 11~12, 13~14 和 17~18 d 时开始有上皮样细胞和成纤立即置于 40?水浴中解冻, 置于无菌离心管内, 加 入 2~3 mL 新鲜培养液, 200 , g 离心 5 min, 小心去除 维样细胞从组织块中长出(图 1). 这种生长速度的差 两栖爬行类动物内脏源性的组织块培养相 上清.细胞沉淀用新鲜 DMEM 培养液调整至合适的异表明 , 图 1 扬子鳄肝脏、心脏和肌肉细胞系的形态及特征 上皮样和成纤维样细胞从肝脏((a), 12 d)、心脏((d), 14 d)和肌肉((g), 18 d)组织块中长出情况; 肝脏(b)、心脏(e)和肌肉(h)细胞生长情况; 冷冻保 存和传代前细胞的生长情况(肝脏(c); 心脏(f); 肌肉(i)) 2011 年 8 月 第 56 卷 第 22 期 对比较容易. 而肌肉组织的培养时间达 17~18 d 才有 细胞 从组织块中 长出 , 提示 我们在培养 这些类型 的 组织细胞时更需耐心. 有研究表明 , 在组织和细胞原代和传代培养的 初期, 培养瓶内通常混杂着上皮细胞和成纤维细胞, 但是由于这些细胞的生长速度、细胞黏附及对胰蛋白 酶的 耐叐性差异 , 在 传代过 程中成纤维 细胞生长 速 度快, 幵抑制上皮细胞等其他细胞生长, 经过 2~3 代 [12,13] 的传代培养, 即可获得纯度较高的成纤维细胞. 图 2 扬子鳄肝脏、心脏和肌肉传代细胞生长曲线 在进行扬子鳄细胞传代时, 这 3 种组织来源的细胞生 长速度却没有表现出明显的差异, 通常在 6~7 d 时即 从肝 脏组织长出 的速度最快 , 其 次是心 脏和肌肉 组 可铺满培养瓶底部 80%~90%. 织. 但是, 从传代细胞生长来看, 这 3 种组织来源的 扬子鳄细胞在冷冻前和复苏后 , 细胞成活率分 细胞生长速度基本一致, 在 6~7 d 即可达到生长平台 别为 96.5%和 85.6%, 表明本研究所采用的培养体系 期.和冷 冻保存条件 是适合的 , 有助 于扬子 鳄细胞系 的 长期保存. 2.3 扬子鳄染色体核型 2.2 细胞培养条件和细胞生长速度扬子鳄细胞经过秋水仙碱处理 , 获得中期染色 体进行铺片, 经胰蛋白酶消化和 Gimsa 溶液染色, 其 鳄鱼在地球上生存了 200~250 万年, 被称为脊椎 核型为 2n = 32, 没有明显的性染色体(图 3). 在细胞 [7]动物的活化石. 温度依赖性的性别决定是该物种进 传代过程中, 随着传代代数增加, 染色体丢失率也会 化过程中的一种奇特现象, 有研究表明, 在 30?孵 增加. 在本研究中, 经过计数 1~6 代细胞染色体核型, 化出来的 100%为雌性鳄鱼, 而在 33?孵化出来的 结果具有完整染色体的细胞比例为 88.6%~93.4%. 鳄 [14][7]100%为雄性. Valleley 等人检测了大量鳄鱼胚胎 鱼属的性染色体非常特殊. 据报道, 在鳄鱼属染色体 在 30?和 33?孵化条件下的核型, 没有表现出明显 G 带中, 性染色体是由一些相对未分化的区块所组 [7]差异. 因此, Valleley 等人采用 31?的培养条件, 培 [17] 成 , 甚至 分布 于整 个染色 体臂 上 . 其他 类似 的 研 养密西西比鳄胚胎尾部肌肉组织块幵成功用于染色 究也 表明 , 在所 有的鳄鱼属 中均没有収 现明显的 性体核型分析. 此外, 有研究认为 32~35?的温度范围 [18,19] [7] 染色体 . Valleley 等人 分析了 大量在 30 ?和 比较 适合鳄鱼心 脏保持正常 的生理活动 , 最高 不能 33? 培养条件下 密西西比鳄 胚胎的染色 体核型 , 尽 [15]超过 38?. 本研究选择 33?温度条件幵成功培养 管有 雌雄个体的 差异 , 但是 染色体核型 没有表现 出 和建立了扬子鳄肝脏、心脏和肌肉细胞系, 表明 33? 特别的差异. 染色体比较作图研究表明, 在哺乳动物 是适合扬子鳄肝脏、心脏和肌肉组织细胞培养的. 我 中不 X 染色体连锁的 Zfc 基因位于密西西比鳄 3 号染 们曾试图在 37?条件下培养扬子鳄肝脏、心脏和肌 [7] 色体上 . 因此, 关于鳄鱼属 X 染色体的进化值得进 肉细胞, 尽管在初期细胞生长速度比 33?快, 但是 一步的深入研究. 很快这些细胞就表现出凋亡样发化. 扬子鳄 3 种细胞系的传代细胞生长速度均表现 结论3 出典型的“S”形(图 2), 其细胞倍增时间约为 36 h, 3 种 本研究的结果表明, 新构建的扬子鳄肝脏、心脏 不同组织来源细胞在传代过程中其细胞倍增时间幵 没有明显差异. 不哺乳动物和鸟类的细胞系相比, 扬 和肌 肉细胞系能 够稳定传代 和保存 , 幵具有 正常的 [16][17]子鳄的细胞生长速度比孟加拉虎、鸡和西门塔 生理 功能 . 扬子 鳄细胞系的 建立将为保 护这一珍 稀 [18] 尔牛等细胞生长速度要慢, 表现为上皮样细胞和 濒危 物种提供有 效的手段 , 也为 进一步 开展扬子 鳄 成纤维样细胞从组织块长出的速度缓慢. 从扬子鳄 3 基因组学、遗传学和细胞生物学等研究提供了可靠的 种 组 织 来源的 原代 细胞生 长速 度来看 , 肝 脏细胞 材料平台. 1782 图 3 扬子鳄中期染色体(a)和染色体核型(b)图 致谢 在样品采集过程中, 得到实验室葛云法老师的大力支持, 特此感谢. 参考文献 1 Xu Q H, Fang S G, Wang Z W, et al. Heavy metal distribution in tissues and eggs of Chinese alligator (Alligator sinensis). Arch Environ Contam Toxicol, 2006, 50: 580–586 Thorbjarnarson J, Wang X M, Ming S, et al. Wild populations of the Chinese alligator approach extinction. Biol Conserv, 2002, 103: 2 93–102 Ding Y Z, Wang X M. Factors influencing the population status of wild Chinese alligators (Alligator sinensis). Biodivers Sci, 2004, 12: 3 324–332 Chen B C. The past and present situation of the Chinese alligator. As Herp Res, 1990, 3: 129–136 4 Wan Z, Gu C, Wang X, et al. Conservation, management and farming of crocodiles in China. In: Crocodiles. Proceedings of the 14th 5 Working Meeting of the Crocodile Specialist Group. IUCN-The World Conservation Union, Gland, Switzerland and Cambridge, UK, 1998. 80–100 Ross J P. Crocodiles: Status Survey and Conservation Action Plan. 2nd ed. IUCN/SSC Crocodile Specialist Group, IUCN, Gland, 6 Switzerland and Cambridge, UK, 1998 Valleley E M, Harrison C J, Cook Y, et al. The karyotype of Alligator mississippiensis, and chromosomal mapping of the ZFY/X 7 homologue, Zfc. Chromosoma, 1994, 103: 502–507 Guan W, He X, Li L, et al. Establishment and biological characterization of fibroblast cell line from the Langshan chicken. Cell Prolif, 8 2010, 43: 157–163 Gu Y P, Li H Z, Mik J. Phenotypic characterization of telomerase-immortalized primary non-malignant and malignant tumor-derived 9 human prostate epithelial cell lines. Exp Cell Res, 2006, 312: 841–843 Kong D, Nishino N, Shibusawa M, et al. Establishment and characterization of human pancreatic adenocarcinoma cell line in tissue 10 culture and the nude mouse. Tissue Cell, 2007, 39: 217–223 Lui J F, Valencia E F T, Boer J A. Karyotypic and analysis and chromosome biometry of cell cultures of the yellow throated alligator 11 (Caiman latirostris Daudin). Rev Brasil Genet, 1994, 17: 165–169 Li L F, Yue H, Ma J, et al. Establishment and characterization of a fibroblast line from Simmental cattle. Cryobiology, 2009, 59: 63–68 12 Xue Q S. The Principle and Technique of in Vitro Culture. Beijing: Science Press, 2001. 432–444 13 Ferguson M W, Joanen T. Temperature of egg incubation determines sex in Alligator mississippiensis. Nature, 1982, 296: 850–853 14 Wilber C G. Effect of temperature on the heart in the alligator. Am J Physiol, 1960, 198: 861–863 15 Guan W J, Liu C Q, Li C Y, et al. Establishment and cryopreservation of a fibroblast cell line derived from Bengal tiger (Panthera tigris 16 tigris). Cryo Letters, 2010, 31: 130–138 King M, Honeycutt R, Contreras N. Chromosomal repatterning in crocodiles: C, G and N-banding and the in situ hybridization of 18S and 17 26S rRNA cistrons. Genetica, 1986, 70: 191–201 Cohen M M, Gans C. The chromosomes of the order Crocodilia. Cytogenetics, 1970, 9: 81–105 18 19 Fishman H K, Mitra J, Dowling H G. The karyotype of the Chinese alligator (Alligator sinensis). Mammal Chrom Newsl, 1968, 9: 81–82
/
本文档为【扬子鳄肝脏_心脏和肌肉细胞系构建】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索